牛骨血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽發(fā)酵動(dòng)力學(xué)及結(jié)構(gòu)與特性分析

劉麗莉，李 丹，尹光俊，梁嚴(yán)予，康懷彬

牛骨血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽發(fā)酵動(dòng)力學(xué)及結(jié)構(gòu)與特性分析

劉麗莉，李 丹，尹光俊，梁嚴(yán)予，康懷彬

（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471003）

前期篩選蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus MBL13-U），結(jié)合嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus，St）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，Lp）混合發(fā)酵牛骨粉制備血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制肽，對(duì)其發(fā)酵動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，采用Logistic和Luedeking-Piret等方程對(duì)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行非線性擬合，建立發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)物生成、基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)模型，擬合度均高于0.97。通過(guò)掃描電鏡、紫外掃描、差示掃描量熱儀對(duì)ACE抑制肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。結(jié)果表明，由于牛骨ACE抑制肽具有良好的吸濕性，其在掃描電鏡下表面出現(xiàn)明顯的溝壑痕跡；在222 nm波長(zhǎng)處出現(xiàn)強(qiáng)吸收峰，符合膠原多肽的特征吸收；與牛骨膠原蛋白相比，其熱變性溫度升高，熱穩(wěn)定性較強(qiáng)。同時(shí)對(duì)其特性分析表明，牛骨ACE抑制肽具有較好的溶解性、較強(qiáng)的耐酸堿性，在0.9 mol/L以內(nèi)的NaCl濃度條件下耐鹽性較強(qiáng)，胃腸道酶對(duì)牛骨ACE抑制肽的影響較小。

蠟樣芽孢桿菌；牛骨血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽；發(fā)酵動(dòng)力學(xué)；結(jié)構(gòu)表征；特性

高血壓是一種慢性疾病，是引發(fā)心腦血管疾病的重要危險(xiǎn)因素之一，據(jù)估計(jì)，在2025年，全球超過(guò)1.5億 人將被診斷出患有高血壓[1]，高血壓的預(yù)防和治療已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者共同關(guān)注的問(wèn)題。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）是一種多功能性的酶，它是腎素-血管緊張素系統(tǒng)和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)的主要調(diào)節(jié)器，在血壓的調(diào)節(jié)方面起著重要的作用[2-3]。ACE抑制劑是治療高血壓和心血管疾病使用較多的藥物，但多數(shù)為合成的ACE抑制劑，一些降壓藥如卡托普利、賴諾普利，會(huì)產(chǎn)生咳嗽、皮疹、腎功能損害和血管神經(jīng)性水腫等副作用[4]，因此研究者在尋求一些來(lái)源于天然產(chǎn)物的安全可靠的ACE抑制劑。

資料表明，膠原蛋白經(jīng)水解后產(chǎn)生的膠原多肽對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶起到了有效的抑制作用，在新的治療和功能性食品領(lǐng)域具有潛在的發(fā)展[5]。目前從食品中制備ACE抑制肽的方法主要為酶解法[6]。國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者已經(jīng)從多種蛋白水解物中成功獲得了ACE抑制肽[7-9]，如Mirzaei等[7]將胰蛋白酶作用在酵母蛋白上，將水解產(chǎn)物經(jīng)過(guò)超濾和色譜分離制備ACE抑制肽并研究其穩(wěn)定性。近年來(lái)隨著畜產(chǎn)品需求的增加，骨骼的開(kāi)發(fā)利用受到了極大的關(guān)注，骨骼中含有豐富的膠原蛋白，但是由于其特殊的三股螺旋結(jié)構(gòu)很難被機(jī)體消化吸收，造成了極大的資源浪費(fèi)。一些學(xué)者對(duì)酶解骨骼進(jìn)行了相關(guān)研究，如舒一梅等[10]將豬骨進(jìn)行酶解后分離得到的ACE抑制肽具有較好的耐熱、耐酸堿和耐鹽性，在酸性條件下具有良好的溶解性。Pagán等[11]對(duì)豬骨的酶解動(dòng)力學(xué)及對(duì)膠原多肽的分子質(zhì)量進(jìn)行分析，探究其降解機(jī)理。Zhang Yuhao等[12]使用6 種不同的蛋白酶作用于牛骨制備ACE抑制肽，并對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行分析表明，使用適當(dāng)?shù)拿柑幚砜梢杂行岣逜CE抑制肽的含量。也有學(xué)者將微生物發(fā)酵與骨骼相結(jié)合進(jìn)行研究，如宗紅等[13]利用枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，Lp）對(duì)豬骨泥進(jìn)行聯(lián)合發(fā)酵，目的在于提高骨泥中易于吸收且具有功能的小分子蛋白、多肽及可溶性鈣的含量，強(qiáng)化發(fā)酵骨泥的功能性。

目前發(fā)酵骨骼以Lp為主，本課題組前期成功從自然界篩選出蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus MBL13-U，并研究了其產(chǎn)酶條件及降解牛骨膠原蛋白的機(jī)理[14-16]，發(fā)現(xiàn)牛骨是ACE抑制肽可靠無(wú)副作用的來(lái)源。在此基礎(chǔ)上，本研究采用蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus MBL13-U，結(jié)合嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus，St）、Lp混合發(fā)酵牛骨制備ACE抑制肽，構(gòu)建發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型，對(duì)制備的ACE抑制肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征和特性分析，合理利用廢棄牛骨資源，增加其附加值，為今后工業(yè)化的生產(chǎn)提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牛腿骨 洛陽(yáng)市老城區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus MBL13-U為本課題組篩選誘變所得未產(chǎn)生腸毒素的菌種；St、Lp為市售光明暢優(yōu)乳中分離所得。

馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（N-hippuryl-His-Leu，HHL）、胃蛋白酶、胰蛋白酶 美國(guó)Sigma化學(xué)公司；雙縮脲、鹽酸、氫氧化鈉 天津德恩化學(xué)試劑有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

發(fā)酵培養(yǎng)基（100 mL）：菌種接種量3%、菌種配比（Bacillus cereus MBL13-U/St/Lp體積比）1∶1∶1、蔗糖2.5 g、骨粉添加量3.5 g。

1.2 儀器與設(shè)備

Scout SE電子天平 奧豪斯儀器（常州）有限公司；BBS-V800潔凈工作臺(tái) 濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司；PHS-3C pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀儀器開(kāi)發(fā)有限公司；紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；JMSC300超濾杯、PES-300聚醚砜超濾膜 上海摩速科學(xué)器材有限公司；CX21光學(xué)顯微鏡 日本Olympus公司；SM-6480掃描式電子顯微鏡 日本電子公司；DSC204F1差示掃描量熱儀 瑞士Mettler-Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 牛骨ACE抑制肽的制備

1.3.1.1 牛骨ACE抑制肽制備的工藝流程

新鮮牛骨→除雜→切塊（5～6 cm）→高壓蒸煮（121 ℃，0.1 kPa）→脫脂、脫鈣→水洗→烘干→粉碎（40 目篩）→牛骨粉→發(fā)酵培養(yǎng)基→滅菌→接種→發(fā)酵→紫外殺菌→離心取上清液→超濾分離純化→真空冷凍干燥→牛骨ACE抑制肽

1.3.1.2 牛骨ACE抑制肽的制備工藝

按本課題組前期實(shí)驗(yàn)確立的最佳發(fā)酵條件進(jìn)行[14]。將牛骨粉在最佳發(fā)酵條件為菌種接種量3%、菌種Bacillus cereus MBL13-U/St/Lp體積比1∶1∶1（菌體的細(xì)胞濃度均為108CFU/mL）、發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時(shí)間42 h、初始pH 7.0條件下進(jìn)行發(fā)酵，紫外殺菌（功率25 W，高度60 cm，發(fā)酵液厚度1 cm，時(shí)間10 min）后取上清液，8 000 r/min、4 ℃離心10 min除去菌體和其他大分子物質(zhì)，收集上清液調(diào)節(jié)pH值至7.0，依次過(guò)截留分子質(zhì)量分別為10、5、3 kD的超濾膜得到牛骨ACE抑制肽，真空冷凍干燥后收集備用。

1.3.2 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型的建立

最佳條件下培養(yǎng)的發(fā)酵液在0～48 h的連續(xù)發(fā)酵時(shí)間內(nèi)每隔4 h取樣，測(cè)定不同時(shí)間條件下菌液濃度、牛骨粉含量和ACE抑制肽生成量的變化，選取合適的方程式進(jìn)行擬合，構(gòu)建最佳發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型，并不定期對(duì)混合菌種進(jìn)行顯微鏡觀察，以確保其發(fā)酵過(guò)程的穩(wěn)定性。

1.3.3 牛骨ACE抑制肽的結(jié)構(gòu)表征

1.3.3.1 ACE抑制肽的掃描電鏡分析

取少量牛骨ACE抑制肽樣品均勻涂抹于掃描電鏡樣盤雙面膠上，進(jìn)行噴金鍍膜處理后置于掃描電鏡抽真空，調(diào)整電壓，放大不同倍數(shù)獲取清晰掃描圖像。

1.3.3.2 ACE抑制肽的紫外光譜分析

室溫條件下，取0.5 g分離干燥的牛骨ACE抑制肽溶于30 mL去離子水，樣品于紫外-可見(jiàn)光掃描儀上進(jìn)行200～450 nm波長(zhǎng)范圍的掃描[17]。

1.3.3.3 ACE抑制肽的熱變性溫度分析

采用差示掃描量熱法，稱取0.02～0.05 g牛骨ACE抑制肽樣品置于潔凈坩堝中，加蓋密封，以空白坩堝作為對(duì)照組，放入差示掃描量熱儀內(nèi)，在－10～150 ℃范圍內(nèi)以10 ℃/min升溫速率進(jìn)行掃描。

1.3.4 ACE抑制肽的特性分析

1.3.4.1 ACE抑制肽的溶解性

取0.1 g冷凍干燥的牛骨ACE抑制肽溶于20 mL去離子水，用0.1 mol/L HCl溶液和0.1 mol/L NaOH溶液分別調(diào)pH值至2.0～10.0，室溫條件下攪拌1 h，8 000 r/min、 4 ℃離心10 min，分別取上清液測(cè)其蛋白質(zhì)含量，以考察牛骨ACE抑制肽的溶解性。ACE抑制肽溶解度為清液中蛋白質(zhì)質(zhì)量與樣品質(zhì)量比值[10]。

1.3.4.2 ACE抑制肽的pH值穩(wěn)定性

取0.1 g冷凍干燥的牛骨ACE抑制肽溶于20 mL去離子水，用0.1 mol/L HCl溶液和0.1 mol/L NaOH溶液分別調(diào)pH值至2.0～10.0，室溫條件下靜置1 h，分別測(cè)其ACE抑制率[18]。

1.3.4.3 ACE抑制肽的鹽穩(wěn)定性

取0.1 g冷凍干燥的牛骨ACE抑制肽分別溶于0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3、1.5、1.7 mol/L NaCl溶液，室溫條件下靜置1 h，分別測(cè)其ACE抑制率。

1.3.4.4 ACE抑制肽的體外消化模擬

用鄧惠玲[19]的方法略加修改。將提純干燥的牛骨ACE抑制肽配成一定質(zhì)量濃度的溶液，用1 mol/L HCl溶液調(diào)pH 2.0，加入2%的胃蛋白酶，37 ℃條件下水解2 h，沸水浴10 min后終止反應(yīng)，將其pH值用1 mol/L NaOH溶液調(diào)至中性，先取部分水解液在8 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，取上清液，測(cè)其ACE抑制率；再取部分水解液加入2%的胰蛋白酶，37 ℃水解2 h，沸水浴10 min后終止反應(yīng)，在8 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，取上清液，測(cè)其ACE抑制率。

1.3.5 指標(biāo)測(cè)定

菌液濃度：將混合菌種按3%的接種量接到發(fā)酵培養(yǎng)基中連續(xù)發(fā)酵48 h，每4 h取發(fā)酵液，靜置20 min取上清液于分光光度計(jì)600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A600nm），所測(cè)數(shù)據(jù)即可描繪菌體的生長(zhǎng)情況。

牛骨粉含量：取發(fā)酵液于干燥好的離心管中，5 000 r/min、4 ℃離心20 min，收集骨粉，于恒溫干燥箱中105 ℃干燥至恒質(zhì)量，稱其質(zhì)量，單位g/L。

牛骨ACE抑制肽含量：采用魯偉等[20]的方法進(jìn)行測(cè)定。

ACE抑制率：在莊溪[21]所采用的方法上略加修改：取50 μL 5.0 mmol/L HHL與10 μL發(fā)酵上清液混勻，37 ℃水浴中預(yù)熱5 min，加入10 μL 0.1 U/mL ACE，37 ℃水浴中反應(yīng)1 h，加入75 μL 1.0 mol/L HCl溶液終止反應(yīng)。加入0.6 mL乙酸乙酯充分混勻后4 000 r/min、4 ℃離心10 min。取l mL乙酸乙酯層于試管中放入烘箱，110 ℃揮發(fā)60 min后用4 mL蒸餾水溶解，充分混合30 s，在波長(zhǎng)228 nm處測(cè)定其吸光度。ACE抑制率計(jì)算如式（1）所示：

式中：A為加入ACE抑制肽的樣品吸光度；B為不加ACE抑制肽的樣品吸光度；C為不加ACE的樣品吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Origin 8.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛骨ACE抑制肽的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型的構(gòu)建

2.1.1 微生物發(fā)酵過(guò)程中代謝變化

圖1 混合菌種發(fā)酵過(guò)程代謝曲線圖Fig. 1 Metabolic curves during mixed culture fermentation

由圖1可知，在發(fā)酵前12 h內(nèi)，牛骨粉消耗量很小，相應(yīng)的混合菌種生長(zhǎng)量及牛骨ACE抑制肽生成量均不明顯，此階段處于混合菌種生長(zhǎng)的延滯期。在12～32 h階段，牛骨粉含量從31.97 g/L顯著降到17.95 g/L，牛骨ACE抑制肽的生成量也顯著增加，混合菌種快速生長(zhǎng)，處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期。當(dāng)超過(guò)32 h后，菌種的生長(zhǎng)已經(jīng)停滯處于穩(wěn)定期，此時(shí)牛骨ACE抑制肽的產(chǎn)量依然增加，但增幅緩慢，因此，牛骨ACE抑制肽的產(chǎn)量與菌體的生長(zhǎng)呈部分偶聯(lián)關(guān)系。同時(shí)不定期對(duì)混合菌種進(jìn)行顯微觀察，總體表明發(fā)酵過(guò)程具有穩(wěn)定性。

2.1.2 菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型

由圖1可知，混合菌種的生長(zhǎng)呈典型的S型走勢(shì)，因此選擇用由Verhulst提出的Logistic方程[22]建立模型描繪混合菌種的生長(zhǎng)情況，Logistic方程的微分形式為：

式中：X為菌體濃度（A600nm）；Xm為最大菌體濃度（A600nm）；μ為混合菌體的最大比生長(zhǎng)速率/h－1；t為時(shí)間/h。

對(duì)式（2）進(jìn)行積分，得到：

式中：X0為初始菌體濃度（A600nm）。

用Origin 8.5軟件按式（3）對(duì)菌種濃度進(jìn)行擬合，結(jié)果見(jiàn)圖2和表1。

圖2 混合菌種生長(zhǎng)擬合曲線Fig. 2 Growth curve of mixed strains

表1 混合菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)Table1 Parameters estimation for the kinetic model for the growth of mixed straaiinnss

得到的擬合方程為：

由圖2及表1可知，擬合值與實(shí)驗(yàn)值基本相符，擬合的R2值為0.991 0，擬合情況良好，說(shuō)明Logistic方程能較好地模擬混合菌種發(fā)酵牛骨粉過(guò)程中菌體的生長(zhǎng)過(guò)程。在發(fā)酵初期擬合產(chǎn)生誤差，其原因在于Logistic方程主要是反應(yīng)菌種濃度的增加和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的減少對(duì)菌種自身生長(zhǎng)抑制的影響，在混合菌種生長(zhǎng)的延滯期，由于濃度較低，影響效果不明顯，因此造成發(fā)酵初期擬合效果相對(duì)不理想。

2.1.3 產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)模型

微生物在發(fā)酵的動(dòng)態(tài)過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)的生物合成途徑十分復(fù)雜，且其代謝調(diào)節(jié)機(jī)制特點(diǎn)各有不同，根據(jù)產(chǎn)物生成速率與細(xì)胞生長(zhǎng)速率之間的關(guān)系，將產(chǎn)物的形成與微生物細(xì)胞生長(zhǎng)關(guān)系的動(dòng)力學(xué)模型主要分為以下3 類：Ⅰ生長(zhǎng)偶聯(lián)型；Ⅱ部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型或稱混合型；Ⅲ非生長(zhǎng)偶聯(lián)型[23]。因此本實(shí)驗(yàn)混合菌種發(fā)酵的產(chǎn)物牛骨ACE抑制肽生成模型采用Luedeking-Piret方程[24]，表達(dá)式為：

式中：P為發(fā)酵產(chǎn)物ACE抑制肽的生成量/（mg/mL）；a為與生長(zhǎng)偶聯(lián)的產(chǎn)物形成系數(shù)；b為非生長(zhǎng)偶聯(lián)的相關(guān)系數(shù)。

將式（2）、（3）、（5）積分得：

將式（4）代入式（6）得到：

式中：P0為初始牛骨ACE抑制肽含量/（mg/mL）。

采用Origin 8.5軟件按式（7）對(duì)實(shí)驗(yàn)測(cè)得的發(fā)酵產(chǎn)物牛骨ACE抑制肽的生成量數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到圖3和表2。

圖3 產(chǎn)物牛骨ACE抑制肽生成的擬合曲線Fig. 3 Time course for the formation of bovine bone ACE inhibitory peptides

表2 產(chǎn)物牛骨ACE抑制肽生成動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)Table 2 Parameters estimation for the kinetic model for the formation of bovine bone ACE inhibitory peptides

得到擬合后的方程為：

由圖3和表2可知，利用Luedeking-Piret方程對(duì)實(shí)驗(yàn)測(cè)得混合菌種發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)物牛骨ACE抑制肽的生成情況進(jìn)行擬合，擬合度R2為0.976 0，效果較理想。在發(fā)酵后期，菌種自身質(zhì)量濃度的增大和底物牛骨粉的消耗導(dǎo)致擬合值和實(shí)測(cè)值出現(xiàn)偏差，說(shuō)明在發(fā)酵后期適當(dāng)提高底物濃度有利于提高牛骨ACE抑制肽的產(chǎn)量。

2.1.4 底物消耗動(dòng)力學(xué)模型

發(fā)酵過(guò)程中，認(rèn)為底物骨粉的消耗主要用于發(fā)酵菌體的生長(zhǎng)消耗和產(chǎn)物牛骨ACE抑制肽的合成消耗兩部分，通常采用以下方程[25]：

式中：S為骨粉含量/（g/L）；YX/S為菌體細(xì)胞得率系數(shù)；YP/S為產(chǎn)物得率系數(shù)；m為維持系數(shù)。

將式（2）、（3）、（5）代入式（9）得：

令：

將式（11）、（12）代入式（10）得到：

式中：S0為初始骨粉含量/（g/L）。

將式（4）代入式（13）得到：

采用Origin 8.5軟件按式（3）、（13）對(duì)測(cè)得的骨粉含量數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到圖4和表3。

圖4 底物牛骨粉消耗的擬合曲線Fig. 4 Time course for substrate consumption

表3 底物牛骨粉消耗動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)Table3 Parameter estimation for the kinetic model for substrate consumption

得到擬合后的方程為：

由圖4可看出，發(fā)酵過(guò)程中，牛骨粉的消耗走勢(shì)呈現(xiàn)反S型，在菌種處于對(duì)數(shù)期時(shí)消耗量較大，而在菌種分別處于延滯期和穩(wěn)定期時(shí)，消耗量均較平緩。經(jīng)軟件擬合后的曲線與實(shí)驗(yàn)測(cè)得數(shù)據(jù)較接近，且擬合決定系數(shù)R2為0.971 6，擬合情況較理想。

2.2 牛骨ACE抑制肽的結(jié)構(gòu)表征

2.2.1 牛骨ACE抑制肽的掃描電鏡及紫外光譜分析

圖5 牛骨ACE抑制肽的掃描電鏡圖（×25 000000）Fig. 5 SEM image of bovine bone ACE inhibitory peptides (× 25 000)

圖6 牛骨ACE抑制肽紫外掃描圖Fig. 6 UV absorption spectrum of bovine bone ACE inhibitory peptides

如圖5所示，牛骨ACE抑制肽表面出現(xiàn)了明顯的溝壑痕跡，可能是由于牛骨ACE抑制肽的親水區(qū)具有較強(qiáng)的吸濕性，接觸空氣后極易吸水，在掃描過(guò)程中的真空環(huán)境下失水所造成的。

在波長(zhǎng)200～230 nm之間，膠原多肽的羰基及肽鍵有特征吸收峰[26]。牛骨ACE抑制肽的紫外掃描結(jié)果如圖6所示，牛骨ACE抑制肽在波長(zhǎng)214～222 nm之間出現(xiàn)強(qiáng)吸收峰，在280 nm處無(wú)吸收峰出現(xiàn)，這是因?yàn)榕９悄z原蛋白水解后得到的ACE抑制肽鏈中含有的CO—NH2、C—O、—COOH都是生色基團(tuán)，能夠在220 nm波長(zhǎng)左右產(chǎn)生光吸收[27]。因此所制備的ACE抑制肽符合膠原多肽的特性吸收。

2.2.2 牛骨ACE抑制肽的熱變性溫度分析

圖7 牛骨ACE抑制肽和牛骨膠原蛋白的差示掃描量熱曲線Fig. 7 DSC curves of bovine bone ACE inhibitory peptides and bovine bone collagen

膠原的熱穩(wěn)定性通常以其熱變性溫度來(lái)表示，牛骨粉蛋白含量中以Ⅰ型膠原蛋白為主，分別對(duì)牛骨膠原蛋白和牛骨ACE抑制肽進(jìn)行熱變性溫度測(cè)定，結(jié)果如圖7所示，牛骨膠原蛋白的熱變性溫度為69.93 ℃，此時(shí)，膠原特有的三螺旋結(jié)構(gòu)被破壞，轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)規(guī)則的卷曲狀，導(dǎo)致膠原喪失部分生物性質(zhì)，即為膠原的熱變性過(guò)程。而牛骨ACE抑制肽的熱變性溫度為87.65 ℃，高于牛骨膠原蛋白，可知膠原蛋白經(jīng)發(fā)酵降解為多肽，隨著其分子質(zhì)量的降低，熱變性溫度升高，相較于膠原蛋白，牛骨ACE抑制肽的熱穩(wěn)定更強(qiáng)。

2.3 牛骨ACE抑制肽的特性分析

2.3.1 牛骨ACE抑制肽的溶解性和pH值穩(wěn)定性

圖8 ACE抑制肽的溶解性曲線及pH值對(duì)ACE抑制肽活性的影響Fig. 8 Solubility curve and influence of pH on the activity of ACE inhibitory peptides

針對(duì)不同pH值情況下ACE抑制肽的溶解性及ACE抑制率的測(cè)定結(jié)果如圖8所示，改變多肽液的pH值，其溶解度始終保持在88 g/100 g左右，變化幅度并不明顯，并且牛骨ACE抑制肽的抑制率始終維持在66.3%～67.2%范圍內(nèi)，并不隨pH值的變化而變化，說(shuō)明牛骨ACE抑制肽具有較好的溶解性，且受pH值的影響不顯著。與王艷[28]研究的魚皮膠原蛋白的溶解性相比，牛骨ACE抑制肽的溶解性較強(qiáng)且對(duì)酸堿均較穩(wěn)定，可能由于膠原蛋白經(jīng)微生物發(fā)酵為短肽后，分子有卷曲狀變?yōu)樯煺範(fàn)睿x子性增強(qiáng)，從而大大提高了其溶解性，并在酸堿情況下具有較好的穩(wěn)定性。

2.3.2 牛骨ACE抑制肽的鹽穩(wěn)定性

圖9 NaCl濃度對(duì)ACE抑制肽活性的影響Fig. 9 Effect of NaCl concentration on the activity of ACE inhibitory peptides

如圖9所示，當(dāng)NaCl溶液濃度在0.1～0.9 mol/L時(shí)，牛骨ACE抑制肽的活性波動(dòng)范圍比較小，幾乎不受NaCl濃度的影響，當(dāng)NaCl溶液濃度超過(guò)0.9 mol/L時(shí)，牛骨ACE抑制肽的活性隨NaCl溶液濃度的增加而顯著降低。因此，在0.9 mol/L以內(nèi)的NaCl濃度條件下牛骨ACE抑制肽具有較強(qiáng)的耐鹽性。

2.3.3 牛骨ACE抑制肽對(duì)胃腸道蛋白酶耐受性

食品來(lái)源的ACE抑制劑之所以具有有效降壓的作用，是因?yàn)樗荒鼙幌纼?nèi)的酶系降解，可以到達(dá)抑制ACE的作用位點(diǎn)。如果其被消化道內(nèi)的酶系降解，分解成不具有抑制作用的片段，即使在體外具有ACE抑制活性也是毫無(wú)意義的，因此研究其抗消化道酶解能力至關(guān)重要[29]。

圖10 胃腸道酶對(duì)牛骨ACE抑制肽的影響Fig. 10 Effect of gastrointestinal proteases on bovine bone ACE inhibitory peptides

牛骨ACE抑制肽在模擬胃腸道環(huán)境下，經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶體外消化后測(cè)其ACE抑制率變化情況如圖10所示，牛骨ACE抑制肽在分別經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶及兩種酶同時(shí)消化后ACE抑制率變化不顯著，說(shuō)明該肽對(duì)胃腸道環(huán)境中胃蛋白酶及胰蛋白酶具有一定的抗性，在體內(nèi)可通過(guò)胃腸道吸收而進(jìn)入血液，從而發(fā)揮降血壓作用。

3 結(jié) 論

采用Logistic和Luedeking-Piret等方程對(duì)混合菌種發(fā)酵牛骨粉的過(guò)程進(jìn)行非線性擬合，建立發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)、牛骨ACE抑制肽生成、牛骨粉消耗動(dòng)力學(xué)模型。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與預(yù)測(cè)值擬合良好，其擬合度分別為0.991 0、0.976 0、0.971 6，證明本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型能較好模擬混合菌種對(duì)牛骨粉的發(fā)酵過(guò)程。模型的建立可以更直觀了解在發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)、牛骨ACE抑制肽的生成、牛骨粉消耗的情況，為后期工業(yè)化生產(chǎn)提供理論參考依據(jù)。

對(duì)牛骨ACE抑制肽的結(jié)構(gòu)及特性分析表明：牛骨ACE抑制肽具有較好的吸濕性，在掃描電鏡下其表面呈現(xiàn)出溝壑痕跡，與其具有較強(qiáng)的吸濕性有關(guān)；牛骨ACE抑制肽的最大峰值在波長(zhǎng)222 nm左右，符合膠原多肽的特征吸收；牛骨ACE抑制肽的熱變性溫度為87.65 ℃，與牛骨膠原蛋白相比，其熱變性溫度升高，具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性；同時(shí)牛骨ACE抑制肽具有較好且穩(wěn)定的溶解性和較強(qiáng)的耐酸堿性；在0.9 mol/L以內(nèi)的NaCl濃度條件下具有較強(qiáng)的耐鹽性；耐受胃腸道蛋白酶消化作用，為其在食品及藥品工業(yè)領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)使用提供理論依據(jù)。

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Fermentation Kinetics, Structure and Characteristics of Angiotensin Converting Enzyme Inhibitory Peptides Derived from Bovine Bone

LIU Lili, LI Dan, YIN Guangjun, LIANG Yanyu, KANG Huaibin
(College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China)

In this work, we conducted a kinetic study on the mixed culture fermentation of bovine bone meal with Bacillus cereus MBL13-U, which was isolated in our previous study, Streptococcus thermophilus and Lactobacillus plantarum for preparing angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitory peptides. Kinetic models with a determination coefficient greater than 0.97 for cell growth, product formation and substrate consumption were developed through nonlinear fitting using Logistic equation and Luecleking-Piret equation. The model predictions were in good agreement with the measured values. The structural properties of the ACE inhibitory peptides were characterized by scanning electron microscopy (SEM), ultraviolet (UV) spectroscopy and differential scanning calorimetry (DSC). The results showed that gully marks appeared on the surface of bovine bone-derived ACE inhibitory peptides, because they had a strong moisture absorption capacity with the maximum absorption at 222 nm as collagen-derived peptides do. Besides, the ACE inhibitory peptides had an increased thermal denaturation temperature and a better thermal stability than bovine bone collagen, apart from good solubility, acid and alkali resistance, and their salt tolerance was strong when the NaCl concentration was below 0.9 mol/L. Pepsin and trypsin had slight effects on bovine bone ACE inhibitory peptides.

Bacillus cereus MBL13-U; angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitory peptides; fermentation kinetic models; structure characterization; characteristics

10.7506/spkx1002-6630-201702009

TS253.1

A

1002-6630（2017）02-0052-07

劉麗莉, 李丹, 尹光俊, 等. 牛骨血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽發(fā)酵動(dòng)力學(xué)及結(jié)構(gòu)與特性分析[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(2): 52-58. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201702009. http://www.spkx.net.cn

LIU Lili, LI Dan, YIN Guangjun, et al. Fermentation kinetics, structure and characteristics of angiotensin converting enzyme inhibitory peptides derived from bovine bone[J]. Food Science, 2017, 38(2): 52-58. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201702009. http://www.spkx.net.cn

2016-04-28

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31401622）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201303084）；河南省重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（152102110080）；河南科技大學(xué)高級(jí)別項(xiàng)目培育基金項(xiàng)目（2013ZCX012）；河南省教育廳自然科學(xué)研究項(xiàng)目（13A550255）

劉麗莉（1974—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品加工技術(shù)。E-mail：yangliuyilang@126.com