藍(lán)莓果實(shí)中花色苷單體的色譜分離純化

劉靜波，陳晶晶，王二雷*，劉彥君

藍(lán)莓果實(shí)中花色苷單體的色譜分離純化

劉靜波，陳晶晶，王二雷*，劉彥君

（吉林大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130062）

為充分開(kāi)發(fā)藍(lán)莓果實(shí)的潛在應(yīng)用價(jià)值，主要采用柱色譜法及半制備高效液相色譜法系統(tǒng)研究藍(lán)莓果實(shí)中花色苷（花青素的糖苷形式）單體的制備技術(shù)。藍(lán)莓花色苷粗提液經(jīng)超聲輔助浸提、乙酸乙酯萃取2 次，能夠促進(jìn)花色苷類(lèi)物質(zhì)的溶出，并有效去除溶液中的黃酮類(lèi)雜質(zhì)。經(jīng)Amberlite XAD-7HP大孔樹(shù)脂層析、Sep-Pak C18固相萃取，所得藍(lán)莓花色苷粗品的純度為62.49%。經(jīng)Sephadex LH-20凝膠色譜柱分離，獲得的3種花色苷純化組分純度在65%～75%之間。運(yùn)用半制備型高效液相色譜技術(shù)從3 種花色苷純化組分中制備出兩種藍(lán)莓果實(shí)中含量較低的半乳糖苷化的花色苷單體，經(jīng)分析型高效液相色譜鑒定為飛燕草素-3-O-半乳糖苷和錦葵色素-3-O-半乳糖苷，純度分別為96.98%和95.63%。本研究為花色苷單體的規(guī)?；a(chǎn)提供了技術(shù)參考，同時(shí)為實(shí)現(xiàn)藍(lán)莓花青素高附加值產(chǎn)品的生產(chǎn)提供良好理論依據(jù)。

藍(lán)莓；花色苷；柱層析；半制備型高效液相色譜法；分離純化

花青素又稱(chēng)花色素，是一類(lèi)水溶性天然色素，廣泛存在于多種植物中，常與多種糖類(lèi)結(jié)合形成花色苷形式，屬類(lèi)黃酮類(lèi)化合物[1]?；ㄇ嗨乜寡趸芰?qiáng)，能有效地清除人體內(nèi)自由基，具有延緩衰老，增強(qiáng)機(jī)體免疫力的功效；花青素除具有極強(qiáng)的抗氧化作用外，還具有保護(hù)視力、抗腫瘤、改善老年癡呆、預(yù)防骨質(zhì)疏松、改善肥胖等多種生理活性功能[2-4]。

藍(lán)莓為多年生灌木，原產(chǎn)于北美洲，在我國(guó)又稱(chēng)為越橘、都柿，為杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium spp.）被子植物。我國(guó)藍(lán)莓主要分布于大、小興安嶺以北的林區(qū)地帶，為世界上少有的藍(lán)色純野生漿果。藍(lán)莓果實(shí)中含有多種營(yíng)養(yǎng)成分，如VA、熊果苷、花青素[5]、食用纖維及多種礦物質(zhì)等。藍(lán)莓中所含花青素的量居于水果和蔬菜之首，被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織譽(yù)為“黃金漿果”。

近年來(lái)，隨著國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)富含花青素的藍(lán)莓研究的不斷深入，如何從藍(lán)莓果實(shí)中高效分離純化花青素單體已成為天然花青素研究的熱點(diǎn)之一?；ㄇ嗨氐娜斯ず铣赏緩狡毡榇嬖诠に噺?fù)雜、產(chǎn)率低、安全性差等缺點(diǎn)，從自然界植物中分離得到的花青素不僅降低了生產(chǎn)成本，而且簡(jiǎn)便、安全性高。常見(jiàn)的花青素提取方法主要有萃取、浸提、酶解、超聲波和微波等[6]。常用于純化花青素的技術(shù)主要有：固相萃取技術(shù)、柱層析技術(shù)、液相色譜技術(shù)、高速逆流色譜技術(shù)等[7-11]。但目前大多數(shù)研究局限于藍(lán)莓花色苷粗提物的制備及功能活性研究，并未較好地實(shí)現(xiàn)花色苷單體的分離。迄今，自然界中已探明的花青素種類(lèi)有23種，與糖苷結(jié)合所形成的花色苷單體多達(dá)500余種[12]，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓果實(shí)中花色苷單體約為16種。本實(shí)驗(yàn)主要采用超聲輔助浸提、液液萃取、固相萃取、層析分離、半制備高效液相色譜等技術(shù)，旨在制備高純度的花色苷單體，為后期工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

野生藍(lán)莓果實(shí)（采摘地點(diǎn)：吉林省長(zhǎng)白山地區(qū)，東經(jīng)127°40’～128°16’，北緯41°35’～42°25’之間的地帶；采摘時(shí)間：2014年8—9月份；保存方式：采摘后于冰箱內(nèi)冷凍）；矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品（cyanidin-3-O-glucoside，純度＞97%，相對(duì)分子質(zhì)量448.2） 美國(guó)Sigma公司。

1.1.2 試劑

甲醇（色譜純）、Amberlite XAD-7HP大孔樹(shù)脂、Sephadex LH-20羥丙基葡聚糖凝膠樹(shù)脂 美國(guó)Sigma公司；Sep-Pak C18固相萃取柱 美國(guó)Waters公司；其他試劑均為分析純 北京化工廠；高效液相色譜用水為超純水。1.2 儀器與設(shè)備

UV-2550紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)、LC-6AD半制備高效液相色譜儀（色譜柱：Shim-pack PREP-ODS(H) KIT（20 mm×25 cm，5 μm））、分析型高效液相色譜儀（二極管陣列檢測(cè)器）（色譜柱：Shimpack VP-ODS（4.6 mm×150 mm，5 μm）） 日本島津公司；CXG-1電腦恒溫層析柜（配備HL-2型恒流泵、BS-16A自動(dòng)部分收集器等設(shè)備） 上海青浦滬西儀器廠。1.3 方法

1.3.1 藍(lán)莓花色苷浸提液的制備

藍(lán)莓花色苷浸提液的制備主要分為超聲、離心、抽濾、萃取、濃縮等步驟[13]，具體操作見(jiàn)圖1。

圖1 藍(lán)莓花色苷單體純化制備的工藝流程Fig. 1 Schematic illustration of the purification and preparation of blueberry anthocyanin monomers

準(zhǔn)確稱(chēng)取500 g的冷凍野生藍(lán)莓果實(shí)，經(jīng)組織粉碎，置于1 000 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇（含0.1%的鹽酸）溶液中超聲浸提（35 ℃，60 min），離心（3 000 r/min，15 min，15 ℃），抽濾，回收濾渣并重復(fù)超聲浸提一次，兩次濾液合并后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至100 mL左右，將旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后液體與乙酸乙酯按1∶2的比例避光萃取12 h，重復(fù)萃取2 次，收集萃取后水層部分，即得藍(lán)莓花色苷水層濃縮液。

1.3.2 藍(lán)莓花色苷粗提物的柱色譜分離制備工藝

藍(lán)莓花色苷粗提物的柱色譜分離主要分為Amberlite XAD-7HP大孔樹(shù)脂層析分離、Sep-Pak C18固相萃取分離和Sephadex LH-20凝膠色譜分離[14]。準(zhǔn)確量取藍(lán)莓花色苷水層濃縮液30 mL，注入Amberlite XAD-7HP大孔樹(shù)脂柱（2.6 cm×60 cm）中充分吸附，依次用酸化的去離子水（含0.01%HCl）、30%乙醇溶液（含0.01% HCl）和80%乙醇溶液（含0.01% HCl）洗脫，洗脫流速均為1.5 mL/min，收集30%洗脫液并濃縮。將濃縮后的洗脫液上Sep-Pak C18固相萃取小柱，分別用酸化的去離子水、50%乙醇溶液（含0.01% HCl）洗脫，洗脫流速均為0.5 mL/min，收集洗脫液并濃縮。將濃縮液上Sephadex LH-20凝膠柱（2.6 cm×60 cm），考察流速分別為0.5、1.0、1.5、2.0 mL/min時(shí)，對(duì)不同花色苷組分分離效果的影響。采用自動(dòng)部分收集器分管收集不同時(shí)間段的洗脫液（10 mL/管），根據(jù)分光光度計(jì)的檢測(cè)結(jié)果分段合并洗脫液，將不同段的洗脫液減壓濃縮干燥，制得3種紫紅色藍(lán)莓花色苷粗提物粉末，分別為組分1、2和3。

1.3.3 藍(lán)莓花色苷單體制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取3 種藍(lán)莓花色苷組分各10 mg，置于試管中，加入3%甲酸溶液超聲溶解5 min，定容至10 mL，經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣，進(jìn)行半制備高效液相色譜分離，根據(jù)色譜圖中單體出峰時(shí)間收集不同單體的洗脫液，多次進(jìn)樣，收集并合并同一單體的洗脫液，減壓濃縮至干燥，即得花色苷單體。半制備型高效液相色譜條件[15]見(jiàn)表1。1.3.4 藍(lán)莓花色苷單體種類(lèi)分析鑒定

表1 分析型與半制備型高效液相色譜參數(shù)條件比較結(jié)果Table1 Comparison between analytical and semi-preparative HPLC parameters

準(zhǔn)確稱(chēng)取1 mg待測(cè)樣品，于10 mL的50%甲醇（色譜級(jí)）溶液中超聲溶解5 min，0.45 μm濾膜過(guò)濾至液相進(jìn)樣小瓶，進(jìn)行高效液相色譜分析。分析型高效液相色譜條件[16]詳見(jiàn)表1。

1.3.5 藍(lán)莓花色苷樣品的純度測(cè)定

藍(lán)莓果實(shí)花色苷樣品純度測(cè)定采用pH值示差法[17]。1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)莓花色苷提取及萃取實(shí)驗(yàn)結(jié)果

藍(lán)莓果實(shí)中富含多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，除含豐富的花色素類(lèi)物質(zhì)外，還含有水溶性還原糖類(lèi)、有機(jī)酸和維生素，鈣、鐵、鋅、銅等礦物質(zhì)元素，VE、VA等脂溶性維生素，以及黃酮類(lèi)、多糖和蛋白質(zhì)類(lèi)。花色苷具有極強(qiáng)的生物活性，然而藍(lán)莓果實(shí)中非花色苷類(lèi)物質(zhì)的存在降低了花色苷質(zhì)量濃度，這可能干擾或降低其生物活性。前期已研究[15]藍(lán)莓果實(shí)中花色苷的提取工藝，但主要以靜態(tài)浸取為主，本實(shí)驗(yàn)考慮到靜態(tài)浸提的不充分性，將工藝進(jìn)行了改進(jìn)，增加了超聲、離心等步驟，使浸提、萃取過(guò)程一體化完成，以充分溶出細(xì)胞內(nèi)的花色苷，縮短提取工藝周期，為后期工業(yè)化生產(chǎn)花色苷提供了技術(shù)參考。經(jīng)過(guò)超聲和離心處理的藍(lán)莓花色苷浸提液中花色苷濃度明顯提高（圖2A），未經(jīng)超聲離心的浸提液中花色苷質(zhì)量濃度非常低。此外，浸提時(shí)間相同的條件下，超聲、離心操作對(duì)520 nm波長(zhǎng)物質(zhì)（花色苷類(lèi)）質(zhì)量濃度影響較大，而對(duì)360 nm的物質(zhì)（黃酮類(lèi)）質(zhì)量濃度未有明顯作用。超聲和離心操作有助于藍(lán)莓果中花色素類(lèi)物質(zhì)的析出，較之傳統(tǒng)的冷浸法，大大縮短了浸提時(shí)間，增大了花色苷的溶出率。

圖2 藍(lán)莓花色苷浸提過(guò)程中不同提取液的紫外-可見(jiàn)吸收光譜Fig. 2 UV-vis spectra of blueberry anthocyanin extract and its different solvent fractions

花色苷類(lèi)物質(zhì)最大吸收波長(zhǎng)約為520 nm，黃酮類(lèi)雜質(zhì)在360 nm左右有最大吸收波長(zhǎng)，由圖2B可知，花色苷浸提液經(jīng)乙酸乙酯萃取前，黃酮類(lèi)雜質(zhì)吸收峰明顯高于花色苷類(lèi)特征吸收峰；萃取1次后，浸提液中花色苷特征峰明顯高于黃酮類(lèi)雜質(zhì)的吸收峰，說(shuō)明，乙酸乙酯能有效除去花色苷浸提液中一定量的黃酮類(lèi)雜質(zhì)；經(jīng)過(guò)1 次萃取，從乙酸乙酯層檢測(cè)出大量黃酮類(lèi)雜質(zhì)（圖2C），萃取2次時(shí)仍有部分黃酮類(lèi)物質(zhì)持續(xù)溶解在乙酸乙酯層，但較萃取1次的黃酮溶出量有明顯減少，萃取3次時(shí)黃酮類(lèi)物質(zhì)幾乎未溶出。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)提高乙酸乙酯體積比例（乙酸乙酯與旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后液體由初期1∶1提高到2∶1），經(jīng)過(guò)2 次萃取后，可以將浸提液中大部分黃酮類(lèi)物質(zhì)除去，且能夠達(dá)到初期3 次萃取的理想程度，極大地縮短了浸提液萃取時(shí)間。圖2D表明，藍(lán)莓花色苷水層濃縮液中黃酮類(lèi)雜質(zhì)幾乎完全被除去，也表明了萃取步驟的有效性。

2.2 藍(lán)莓花色苷的柱色譜分離結(jié)果

藍(lán)莓花色苷濃縮液經(jīng)浸提、萃取操作后雖除去了絕大部分黃酮雜質(zhì)，但其中仍含有大量水溶性糖類(lèi)、蛋白質(zhì)以及部分極性黃酮類(lèi)雜質(zhì)。因此，本實(shí)驗(yàn)采用柱層析技術(shù)結(jié)合固相萃取技術(shù)對(duì)花色苷濃縮液進(jìn)一步純化，分別為Amberlite XDA-7HP大孔樹(shù)脂純化、Sep-Pak C18固相萃取柱和LH-20凝膠色譜分離過(guò)程[18]，最終達(dá)到充分富集花色苷組分的目的。結(jié)合課題組前期研究基礎(chǔ)，對(duì)原有工藝做出以下調(diào)整：1）降低大孔樹(shù)脂層析過(guò)程中的乙醇洗脫體積分?jǐn)?shù)（由35%降至30%），收集30%酸化乙醇洗脫液，降低洗脫液體積分?jǐn)?shù)有助于減少非花色苷黃酮被洗脫下來(lái)的可能，從而間接促進(jìn)花色苷的純化。2）降低LH-20凝膠色譜柱洗脫體積分?jǐn)?shù)，以20%酸化乙醇作為最佳洗脫體積分?jǐn)?shù)，這有助于實(shí)現(xiàn)水溶性花色素類(lèi)的分離。

藍(lán)莓果實(shí)中花色苷單體的鑒定主要依據(jù)3 種方法：1）基于高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)得不同液相單體峰對(duì)應(yīng)的一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜離子，如圖3A中峰1、3、6、9、12對(duì)應(yīng)一級(jí)/二級(jí)質(zhì)譜離子質(zhì)荷比（m/z）分別為465/303、449/287、463/301、479/317、493/331；2）基于花青素在色譜柱上的保留時(shí)間先后順序，如飛燕草素＜矢車(chē)菊素＜牽?；ㄋ兀忌炙幧兀煎\葵色素，花青素半乳糖苷形式＜花青素其他糖苷形式；3）基于已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[19]，結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)對(duì)長(zhǎng)白山野生藍(lán)莓果實(shí)中花色苷單體鑒定結(jié)果[15,20]，從中共鑒定出16 種花色苷單體（圖3A）。通過(guò)比較野生藍(lán)莓花色苷濃縮液（圖3A）與Amberlite XAD-7HP大孔樹(shù)脂純化液（圖3B）及固相萃取液（圖3C）的高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器色譜圖發(fā)現(xiàn)，三者均含有16 種藍(lán)莓花色苷單體，經(jīng)過(guò)大孔樹(shù)脂層析及固相萃取后，花色苷單體種類(lèi)沒(méi)有明顯改變，層析純化前后，花色苷單體間的含量比例略有差異。這說(shuō)明層析純化過(guò)程中并沒(méi)有改變野生藍(lán)莓果實(shí)中花色苷單體的原始構(gòu)成。利用pH值示差法分別對(duì)不同純化步驟后的樣品進(jìn)行純度分析后，得出，經(jīng)大孔樹(shù)脂純化后的花色苷樣品純度為50.52%，經(jīng)固相萃取后的藍(lán)莓花色苷樣品純度為62.49%，說(shuō)明經(jīng)過(guò)固相萃取能顯著提高花色苷純度，為后期花色苷單體的制備提供了必備條件。

圖3 不同藍(lán)莓花色苷純化液在波長(zhǎng)520 nm條件下的高效液相色譜圖Fig. 3 Analytical HPLC chromatograms of different purified blueberry anthocyanin solutions at 520 nm

Sephadex LH-20是一種葡聚糖凝膠，具備純化過(guò)濾、反相分配和吸附層析3 種特性。在目標(biāo)物洗脫過(guò)程中，利用凝膠過(guò)濾作用，大分子物質(zhì)首先被洗脫下來(lái)，小分子物質(zhì)由于保留作用比大分子物質(zhì)強(qiáng)，洗脫時(shí)間延長(zhǎng)，最后被洗脫出柱。利用LH-20的這種結(jié)構(gòu)特性，來(lái)實(shí)現(xiàn)花色苷組分分離的目的。凝膠色譜層析過(guò)程中，洗脫流速是色譜柱層析的一項(xiàng)重要影響因素。經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱分離后，可以看到樣品被大致分成3 段（圖4），利用自動(dòng)部分收集器收集洗脫液，根據(jù)不同試管中收集液在波長(zhǎng)520 nm處吸光度變化趨勢(shì)繪制吸光度隨時(shí)間變化的曲線(xiàn)。為獲得極性較大的花色苷單體，采用20%（含0.01% HCl）乙醇溶液進(jìn)行洗脫，并考察洗脫流速對(duì)花色苷單體分離的影響。當(dāng)洗脫劑的極性不變時(shí)，花色苷單體的洗脫主要以凝膠過(guò)濾作用為主。由圖4可知，當(dāng)洗脫流速?gòu)?.5 mL/min增大到2 mL/min時(shí)，組分1的分離效果受流速的影響較小，均能達(dá)到完全分離的目的，但組分2和3受流速的影響較大，當(dāng)流速較?。▓D4A和B）或較大（圖4D）均易造成2種組分的分離不徹底，流速較小時(shí)，易造成洗脫時(shí)間延長(zhǎng)，洗脫能力較差，組分2、3難以洗脫下來(lái)，造成分離難度較大；流速較大時(shí)（圖4D），洗脫能力增強(qiáng)，但組分2、3的吸附能力均變?nèi)?，分離過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生組分疊加，也不能獲得理想的分離效果。因此，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)優(yōu)化凝膠色譜柱層析工藝后，選擇最佳流速為1.5 mL/min，可以基本實(shí)現(xiàn)組分2、3的分離（圖4C）。

圖4 不同流速時(shí)藍(lán)莓花色苷組分的凝膠色譜分離結(jié)果Fig. 4 Gel chromatography of blueberry anthocyanins at different flow rates

圖5 藍(lán)莓花色苷經(jīng)Sephadex LH-20凝膠色譜柱分離后3 段組分的高效液相色譜圖Fig. 5 HPLC chromatogram of three blueberry anthocyanin fractions purified by Sephadex LH-20 gel chromatography

根據(jù)凝膠色譜柱分離結(jié)果并按試管合并3 種組分，利用高效液相色譜對(duì)凝膠色譜層析的3 種花色苷組分的檢測(cè)結(jié)果如圖5所示。圖5A為組分1的高效液相色譜檢測(cè)結(jié)果，與濃縮液（圖3A）相比，組分1中13號(hào)峰面積比例為82.56%，12號(hào)峰面積比例為10.68%，8號(hào)峰為6.76%，即組分1中含量最豐富的為錦葵色素-3-O-葡萄糖苷，其次為錦葵色素-3-O-半乳糖苷和牽牛花素-3-O-葡萄糖苷。如圖5B所示，組分2中8號(hào)峰（占45.86%）含量相對(duì)較多，除此之外還有1、2、5、13號(hào)峰等。組分3（圖5C）中以2號(hào)峰為主，還有1、5、8、13號(hào)峰等。高效液相色譜結(jié)果表明，凝膠色譜柱層析初步實(shí)現(xiàn)了幾種主要花色苷單體的分離，若要得到高純度花色苷單體，仍需后期實(shí)驗(yàn)深入分離單體。利用pH值示差法分別對(duì)凝膠色譜純化后的3種組分進(jìn)行純度分析后，得出組1、2、3的純度分別為66.27%、70.36%及74.81%，這3 種組分較固相萃取后的純度有明顯提高。以上結(jié)果表明，凝膠色譜純化不僅實(shí)現(xiàn)了不同種類(lèi)花色苷單體的分離，而且顯著提高了花色苷樣品的總體純度。

2.3 半制備液相色譜分離花色苷單體結(jié)果

圖6 Sephadex LH-20凝膠色譜制得各組分的半制備高效液相色譜圖Fig. 6 Semi-preparative HPLC profiles of blueberry anthocyanin monomers

由于長(zhǎng)白山野生藍(lán)莓果實(shí)中花色苷單體多、含量低，難以分離，無(wú)法直接通過(guò)半制備液相分離手段達(dá)到分離目的，因此，本實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)超聲浸提、液液萃取、大孔樹(shù)脂柱、固相萃取柱和凝膠色譜柱逐級(jí)分離技術(shù)，使得樣品中花色苷單體的構(gòu)成趨于簡(jiǎn)單化、易于分離。前期已利用半制備液相色譜技術(shù)純化出3 種含量豐富的花色苷單體[20]，主要為飛燕草素-3-O-葡萄糖苷、牽?；ㄋ?3-O-葡萄糖苷和錦葵色素-3-O-葡萄糖苷，分別對(duì)應(yīng)圖3A中峰2、峰8和峰13。本實(shí)驗(yàn)不僅通過(guò)前期調(diào)整浸提、萃取、層析等步驟中相關(guān)參數(shù)，而且在后期應(yīng)用半制備液相色譜技術(shù)上也進(jìn)行了相關(guān)改進(jìn)，如梯度洗脫程序、上樣量等參數(shù)條件，旨在收集更多種類(lèi)、含量相對(duì)較少的花色苷單體。此外，對(duì)于組分相近且半制備液相色譜不足以實(shí)現(xiàn)兩種單體或多者之間分離時(shí)，采用中心切割法和邊緣切割法（圖6A）進(jìn)行收集[21]，從而實(shí)現(xiàn)極性相近的花色苷單體的分離與制備。

圖6B為凝膠色譜層析后組分1的半制備高效液相色譜圖，主峰為藍(lán)莓花色苷中的13號(hào)峰（錦葵色素-3-O-葡萄糖苷），主峰前小峰對(duì)應(yīng)12號(hào)峰（錦葵色素-3-O-半乳糖苷）。本實(shí)驗(yàn)主要以純化含量較少的糖苷單體為目的，以中心切割法的方式收集12號(hào)峰。12號(hào)峰出峰時(shí)間約為62.5 min，實(shí)驗(yàn)收集從63 min開(kāi)始，64.5 min結(jié)束。為了驗(yàn)證收集效果，排除雜質(zhì)和收集誤差的影響，將收集到的12號(hào)峰洗脫液再次上樣，所得半制備液相色譜峰見(jiàn)圖6C，可見(jiàn)12號(hào)信號(hào)峰單一，未見(jiàn)其他信號(hào)峰，重復(fù)上述操作，合并花色苷單體洗脫液。圖6D和6E分別為凝膠色譜層析后組分2和3的半制備高效液相色譜圖結(jié)果，通過(guò)與圖5相比，可知半制備液相圖中出現(xiàn)的3 個(gè)大峰并非由一種單體構(gòu)成，而是由兩種以上的花色苷單體重疊后得到的大峰。由于組分2和組分3中均含有一定比例的1號(hào)峰單體，因此本實(shí)驗(yàn)中組分2和3均可作為1號(hào)峰的收集來(lái)源，在收集目標(biāo)物時(shí)，采用邊緣切割法以1號(hào)峰為目標(biāo)峰進(jìn)行收集，并進(jìn)行再次上樣（圖6F），合并花色苷單體的洗脫液。由于半制備型液相檢測(cè)精度并不高，所得花色苷單體的二次洗脫液，需經(jīng)分析型高效液相色譜進(jìn)行分離效果的評(píng)價(jià)。

圖7 半制備高效液相色譜制得的兩種花色苷單體的分析液相檢測(cè)結(jié)果Fig. 7 Analytical HPLC chromatograms of two anthocyanin monomers obtained from semi-preparative HPLC

通過(guò)多次進(jìn)樣，收集一定量的花色苷單體洗脫液。將多次進(jìn)樣后制得的花色苷單體洗脫液進(jìn)行低溫濃縮，真空冷凍干燥，得到花色苷單體固體粉末。利用分析型高效液相色譜對(duì)花色苷單體進(jìn)行分析結(jié)果見(jiàn)圖7，圖7A中單體保留時(shí)間為12.5 min，對(duì)應(yīng)圖3A中1號(hào)峰（飛燕草素-3-O-半乳糖苷），圖7B中單體保留時(shí)間為30.6 min，對(duì)應(yīng)圖3A中12號(hào)峰（錦葵色素-3-O-半乳糖苷）。利用pH值示差法對(duì)兩種單體進(jìn)行純度分析，得出飛燕草素-3-O-半乳糖苷的純度為96.98%，錦葵色素-3-O-半乳糖苷的純度為95.63%。一般來(lái)講，當(dāng)樣品純度達(dá)到95%以上時(shí)，便可以被當(dāng)作物質(zhì)對(duì)照品[22]?？梢?jiàn)，經(jīng)過(guò)半制備液相兩次純化后大大提高了花色苷單體純度，也說(shuō)明此方法純化花色苷單體具有很高的可行性。

3 討 論

為增大花色苷的提取效率，傳統(tǒng)用于提取花色苷的溶劑一般為酸化的甲醇或丙酮[23]，本研究從食品安全角度考慮，藍(lán)莓果實(shí)中花色苷的提取工藝中采用70%乙醇（0.1% HCl）溶液為提取劑；利用超聲輔助提取法開(kāi)展了花色苷的提取工藝研究。Corrales等[24]研究結(jié)果表明，超聲輔助提取花色苷效率與熱浸提法相比，可以提高50%以上；本實(shí)驗(yàn)中，超聲輔助提取法與傳統(tǒng)的熱浸提法相比能有效提高花色苷的溶出效率，此結(jié)果與Corrales等[24]研究結(jié)果保持一致。藍(lán)莓花色苷粗提液中弱極性成分以黃酮類(lèi)物質(zhì)為主，本實(shí)驗(yàn)中以乙酸乙酯為萃取劑來(lái)除去這部分雜質(zhì)，通過(guò)與國(guó)內(nèi)外已有制備藍(lán)莓花色苷粗品的文獻(xiàn)報(bào)道相比，此步驟常被忽略[25]，但在制備藍(lán)莓花色苷單體過(guò)程，此步驟卻至關(guān)重要。為制備高純度的藍(lán)莓花色苷樣品，柱色譜常被用作花色苷的分離純化，其中大部分文獻(xiàn)中將Amberlite XAD-7HP與Sephadex LH-20的雙步層析列為制備花色苷純品的常用組合[8]，本實(shí)驗(yàn)對(duì)此組合進(jìn)行了改進(jìn)，在兩步層析中間加入了固相萃取一步，通過(guò)Sep-Pak C18固相萃取，既使藍(lán)莓花色苷樣品純度提高12%，又避免過(guò)多雜質(zhì)對(duì)價(jià)格昂貴的凝膠色譜柱的潛在污染。在藍(lán)莓花色苷的半制備過(guò)程中，引入中心切割法及邊緣切割法的理論，成功制備出兩種純度高于95%的半乳糖苷化的花青素單體。近年來(lái)，高速逆流色譜法逐漸成為大批量制備花色苷單體的熱門(mén)技術(shù)之一，且所制備的花色苷單體純度也高于90%，盡管本研究中所用的半制備高效液相色譜法的制備效率低于高速逆流色譜法，但后者一般采用高沸點(diǎn)、污染大的有機(jī)溶劑為流動(dòng)相，如正丁醇、正己烷等溶劑，容易造成花色苷樣品中的大量溶劑殘留，本實(shí)驗(yàn)中采用的流動(dòng)相為甲醇和甲酸，通過(guò)低溫濃縮便可去除。

在藍(lán)莓花色苷單體的純化過(guò)程中，通過(guò)計(jì)算得出，飛燕草素-3-O-半乳糖苷和錦葵色素-3-O-半乳糖苷單體的回收率分別為10.4%和17.5%，此結(jié)果表明花色苷單體的回收率較低。由于本實(shí)驗(yàn)中采用了多次柱色譜技術(shù)，如大孔樹(shù)脂層析、固相萃取、凝膠色譜層析、半制備高效液相色譜，其中大孔樹(shù)脂層析及凝膠色譜層析均能造成50%以上總花色苷的損失。后期將在保證花色苷單體高純度基礎(chǔ)上，通過(guò)優(yōu)化花色苷單體的柱層析步驟，以便獲得更加經(jīng)濟(jì)實(shí)用的花色苷單體制備工藝。

4 結(jié) 論

以長(zhǎng)白山野生藍(lán)莓果實(shí)為原料，運(yùn)用超聲浸提、液液萃取、分步層析、固相萃取等手段，同時(shí)結(jié)合半制備高效液相色譜技術(shù)，開(kāi)展了花色苷單體的制備技術(shù)研究，并對(duì)花色苷樣品的純度及單體構(gòu)成進(jìn)行了鑒定，所得結(jié)論如下：采用超聲輔助浸提能促進(jìn)藍(lán)莓果實(shí)中花色苷類(lèi)物質(zhì)的溶出，乙酸乙酯能有效萃取出花色苷浸提液中的非花色苷黃酮類(lèi)物質(zhì)。采用3 種柱色譜技術(shù)（大孔樹(shù)脂層析、固相萃取、凝膠色譜層析）能夠獲得純度在65%以上的花色苷純化樣品。運(yùn)用半制備型高效液相色譜從花色苷純化樣品中分離出2種花色苷單體，分別為飛燕草素-3-O-半乳糖苷和錦葵色素-3-O-半乳糖苷，純度均高于95%。

本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)研究了花色苷單體的制備技術(shù)，并獲得了制備花色苷單體的有效途徑，為深入開(kāi)發(fā)花青素標(biāo)準(zhǔn)化物質(zhì)提供良好的研究思路，并為規(guī)?；a(chǎn)藍(lán)莓果實(shí)高附加值產(chǎn)品提供一定參考。

[1] YOU Q, WANG B W, CHEN F, et al. Comparison of anthocyanins and phenolics in organically and conventionally grown blueberries in selected cultivars[J]. Food Chemistry, 2011, 125(1): 201-208. DOI:10.1016/j.foodchem.2010.08.063.

[2] SPECIALE A, CIMINO F, SAIJA A, et al. Bioavailability and molecular activities of anthocyanins as modulators of endothelial function[J]. Genes and Nutrition, 2014, 9(4): 1-19. DOI:10.1007/ s12263-014-0404-8.

[3] WU T, JIANG Z, YIN J, et al. Anti-obesity effects of artif cial planting blueberry (Vaccinium ashei) anthocyanin in high-fat diet-treated mice[J]. International Journal of Food Sciences and Nutrition, 2016, 67(3): 257-264. DOI:10.3109/09637486.2016.1146235.

[4] 陳文超, 劉回民, 劉景圣. 花青素抗腫瘤活性的研究進(jìn)展[J].食品研究與開(kāi)發(fā), 2016, 37(1): 211-215. DOI:10.3969/ j.issn.1005-6521.2016.01.051.

[5] NORBERTO S, SILVA S, MEIRELES M, et al. Blueberry anthocyanins in health promotion: a metabolic overview[J]. Journal of Functional Foods, 2013, 5(4): 1518-1528. DOI:10.1016/ j.jff.2013.08.015.

[6] 許相雯. 微波輔助萃取藍(lán)莓中花青素及純化的研究[D]. 哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012: 14-36.

[7] LI D N, MENG X J, LI B. Prof ling of anthocyanins from blueberries produced in China using HPLC-DAD-MS and exploratory analysis by principal component analysis[J]. Journal of Food Composition and Analysis, 2015, 47: 1-7. DOI:10.1016/j.jfca.2015.09.005.

[8] BUNEA A, RUGIN? D, SCON?A Z, et al. Anthocyanin determination in blueberry extracts from various cultivars and their antiproliferative and apoptotic properties in B16-F10 metastatic murine melanoma cells[J]. Phytochemistry, 2013, 95: 436-444. DOI:10.1016/ j.phytochem.2013.06.018.

[9] CANUTO G A, OLIVEIRA D R, da CONCEI??O L S, et al. Development and validation of a liquid chromatography method for anthocyanins in strawberry (Fragaria spp.) and complementary studies on stability, kinetics and antioxidant power[J]. Food Chemistry, 2016, 192: 566-574. DOI:10.1016/j.foodchem.2015.06.095.

[10] GALLOWAY K R, BRETZ S L, NOVAK M. Paper chromatography and UV-Vis spectroscopy to characterize anthocyanins and investigate antioxidant properties in the organic teaching laboratory[J]. Journal of Chemical Education, 2014, 92(1): 183-188. DOI:10.1021/ed400520n.

[11] CORREA-BETANZO J, PADMANABHAN P, CORREDIG M, et al. Complex formation of blueberry (Vaccinium angustifolium) anthocyanins during freeze-drying and its inf uence on their biological activity[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2015, 63(11): 2935-2946. DOI:10.1021/acs.jafc.5b00016.

[12] ARACELI C, MADELOURDES P H, MAELENA P, et al. Chemical studies of anthocyanins: a review[J]. Food Chemistry, 2009, 113(4): 859-871. DOI:10.1016/j.foodchem.2008.09.001.

[13] 潘利華, 王建飛, 葉興乾, 等. 藍(lán)莓花青素的提取工藝及其免疫調(diào)節(jié)活性[J]. 食品科學(xué), 2014, 35(2): 81-86. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201402015.

[14] 董周永, 阿嘎, 趙國(guó)建, 等. 大孔樹(shù)脂對(duì)紅心蘿卜花色苷的純化[J].食品科學(xué), 2011, 32(4): 21-24.

[15] 王二雷. 藍(lán)莓花青素高純提取物的制備技術(shù)及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用研究[D]. 長(zhǎng)春: 吉林大學(xué), 2014: 34-93.

[16] 劉均玉, 許晨, 許建中, 等. 高效半制備液相色譜法從橘皮中分離制備黃酮類(lèi)化合物[J]. 中國(guó)食品添加劑, 2009(2): 157-160.

[17] 王二雷, 陳晶晶, 趙葉輝, 等. 小葉女貞果實(shí)花青素組分鑒定及色譜純化技術(shù)[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào), 2016, 32(4): 302-308. DOI:10.11975/ j.issn.1002-6819.2016.04.043.

[18] 郭丹妮, 向燦輝, 陳陽(yáng), 等. 葡聚糖凝膠色譜結(jié)合高速逆流色譜提取藍(lán)莓中花青素[J]. 食品工業(yè), 2016, 37(2): 181-183.

[19] BARNES J S, NGUYEN H P, SHEN S, et al. General method for extraction of blueberry anthocyanins and identification using high performance liquid chromatography-electrospray ionization-ion traptime of flight-mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 2009, 1216(23): 4728-4735. DOI:10.1016/j.chroma.2009.04.032.

[20] WANG E L, YIN Y G, XU C N, et al. Isolation of high-purity anthocyanin mixtures and monomers from blueberries using combined chromatographic techniques[J]. Journal of Chromatography A, 2014, 1327: 39-48. DOI:10.1016/j.chroma.2013.12.070.

[21] 寧德生, 梁小燕, 方宏, 等. 半制備高壓液相色譜法制備羅漢果苷Ⅴ標(biāo)準(zhǔn)品[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(12): 137-140.

[22] 龔金炎, 毛建衛(wèi), 黃偉素, 等. 竹茹中苜蓿素對(duì)照品的高效液相半制備色譜制備研究[J]. 中草藥, 2012, 43(5): 919-921.

[23] 王秋霜, 凌彩金, 劉淑媚, 等. 花青素分離純化及其組分鑒定研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技, 2013, 34(3): 358-360. DOI:10.13386/ j.issn1002-0306.2013.03.054.

[24] CORRALES M, TOEPFL S, BUTZ P, et al. Extraction of anthocyanins from grape by-products assisted by ultrasonics, high hydrostatic pressure or pulsed electric fields: a comparison[J]. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 2008, 9(1): 85-91. DOI:10.1016/ j.ifset.2007.06.002.

[25] BURAN T J, SANDHU A K, LI Z, et al. Adsorption/desorption characteristics and separation of anthocyanins and polyphenols from blueberries using macroporous adsorbent resins[J]. Journal of Food Engineering, 2014, 128: 167-173. DOI:10.1016/ j.jfoodeng.2013.12.029.

Separation of Anthocyanin Monomers from Blueberry Fruits through Chromatographic Techniques

LIU Jingbo, CHEN Jingjing, WANG Erlei*, LIU Yanjun
(College of Food Science and Engineering, Jilin University, Changchun 130062, China)

To fully develop the potential application of blueberry fruits, this paper is focused on the preparation of anthocyanin monomers from blueberry fruits using column chromatography and semi-preparative high performance liquid chromatography (HPLC). Crude blueberry anthocyanins were ultrasonically extracted with acidified 70% ethanol and further subjected to two cycles of ethyl acetate extraction for the purpose of facilitating the dissolution of anthocyanins and removing non-anthocyanin flavonoids. The purity of crude blueberry anthocyanins reached 62.49% after Amberlite XAD-7HP column chromatography separationand Sep-Pak C18solid-phase extraction. Three anthocyanin fractions were obtained by Sephadex LH-20 column chromatography with purities ranging from 65% to 75%. Using semi-preparative HPLC, two pure anthocyanin monomers were successfully isolated from the three purif ed anthocyanin fractions, which were identif ed as delphinidin-3-O-galactoside and malvidin-3-O-galactoside by analytical HPLC, with purities of 96.98% and 95.63% respectively. The present study can provide technical references for large-scale production of anthocyanin glycoside monomers, and also provide a good theoretical basis for the production of high value-added products of blueberry anthocyanins.

blueberry; anthocyanins; column chromatography; semi-preparative high performance liquid chromatography (HPLC); separation and purif cation

10.7506/spkx1002-6630-201702033

TS255.1

A

1002-6630（2017）02-0206-08

劉靜波, 陳晶晶, 王二雷, 等. 藍(lán)莓果實(shí)中花色苷單體的色譜分離純化[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(2): 206-213. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201702033. http://www.spkx.net.cn

LIU Jingbo, CHEN Jingjing, WANG Erlei, et al. Separation of anthocyanin monomers from blueberry fruits through chromatographic techniques[J]. Food Science, 2017, 38(2): 206-213. (in Chinese with English abstract)

10.7506/ spkx1002-6630-201702033. http://www.spkx.net.cn

2016-06-29

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31271907）

劉靜波（1962—），女，教授，博士，研究方向?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)與功能食品。E-mail：ljb168@sohu.com

*通信作者：王二雷（1981—），男，實(shí)驗(yàn)師，博士，研究方向?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)與功能食品。E-mail：wel@jlu.edu.cn