淫羊藿葉多糖工藝優(yōu)化及抗氧化活性

譚 莉，陳瑞戰(zhàn)*，常清泉，陸 娟，金辰光，殷 薇

淫羊藿葉多糖工藝優(yōu)化及抗氧化活性

譚 莉，陳瑞戰(zhàn)*，常清泉，陸 娟，金辰光，殷 薇

（長春師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130032）

探索和優(yōu)化超聲復(fù)合酶解提取淫羊藿葉粗多糖工藝。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化復(fù)合酶添加量，再采用Box-Behnken設(shè)計(jì)和響應(yīng)面優(yōu)化超聲復(fù)合酶解提取工藝參數(shù)。結(jié)果顯示：不同酶添加量對多糖提取得率的影響次序是：纖維素酶＞果膠酶＞木瓜蛋白酶＞α-淀粉酶，最佳復(fù)合酶（木瓜蛋白酶、果膠酶、纖維素酶和α-淀粉酶）的添加量分別為50、250、200、100 U/g；最佳提取條件為提取溫度46.8 ℃、超聲時(shí)間42.3 min、pH 4.3、超聲功率311 W。在此實(shí)驗(yàn)條件下，粗多糖提取得率為5.98%，與模型預(yù)測值（6.2%）接近。粗多糖通過瓊脂糖離子交換和葡聚糖分子篩凝膠柱色譜分離純化，得到3 個(gè)主要多糖組分（EPs-1、EPs-2、EPs-3），多糖組分采用DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基清除和鐵離子還原能力實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了抗氧化活性評價(jià)。結(jié)果表明，超聲復(fù)合酶提取作為一個(gè)高效和環(huán)保的提取技術(shù)，可以應(yīng)用于從植物原料中提取活性成分；抗氧化活性實(shí)驗(yàn)顯示3 個(gè)多糖組分都具有顯著的抗氧化活性，其活性呈添加量依賴關(guān)系。這些結(jié)果說明淫羊藿多糖可以探索作為潛在的抗氧劑應(yīng)用于功能食品和藥品。

淫羊藿多糖；超聲復(fù)合酶；響應(yīng)面；抗氧化活性

淫羊藿為小檗科植物淫羊藿、箭葉淫羊藿、巫山淫羊藿、朝鮮淫羊藿等多種淫羊藿的莖葉，是一味有名的中藥。研究表明淫羊藿富含多糖、黃酮、苷、萜和生物堿等活性成分[1]。

多糖是富含在植物、動物、菌類和微生物中的天然高分子化合物[2]，具有多種藥理活性，如抗氧化活性[3]、免疫調(diào)節(jié)活性[4]和抗腫瘤活性[5]，廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、功能食品和藥品中。從植物組織中提取多糖的傳統(tǒng)方法是浸漬、熱回流提取等方法，這些方法一般需要較長的超聲時(shí)間、較高的提取溫度和能量消耗。然而多糖的提取率卻很低，且容易導(dǎo)致多糖的降解和藥理學(xué)活性的降低[6]。近年來發(fā)展起來的超聲輔助提取[7]、酶解提取[8]、微波提取[9]等綠色環(huán)保提取技術(shù)，既提高了多糖得率，又最大限度地保持了多糖的結(jié)構(gòu)和活性[10]。

在姜虹等[11]響應(yīng)面優(yōu)化淫羊藿多糖超聲提取工藝的基礎(chǔ)上，采用超聲復(fù)合酶解提取法從淫羊藿葉中提取多糖，利用正交試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，對分離得到的多糖組分進(jìn)行了體外抗氧化活性評價(jià)，為淫羊藿多糖的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干的淫羊藿葉購于吉林省撫松縣興隆鎮(zhèn)。

葡萄糖、1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、三吡啶基吖三嗪（1,3,5-tri(2-pyridyl)-2,4,6-triazine，TPTZ）、VC 美國Sigma公司；木瓜蛋白酶（500 U/mg）、果膠酶（6 U/mg）、纖維素酶（15 U/mg）、α-淀粉酶（4 U/mg） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DEAE-Sepharose fast-flow、Sephadex G-100分子篩凝膠 美國Pharmacia公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛郎儀器有限公司；UV-1601紫外-可見分光光度計(jì) 北京北分瑞利分析儀器公司；X1R高速離心機(jī) 德國Heraeus Multifuge公司；SL-2010N超聲發(fā)生器 南京順流儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 粗多糖的提取

干的淫羊藿葉粉碎，依次用石油醚、95%乙醇溶液回流2 次，脫色、脫脂、去低聚糖和小分子物質(zhì)，揮干溶劑，得預(yù)處理樣品。稱取10 g預(yù)處理樣品置于燒瓶中，加入復(fù)合酶液、蒸餾水，用醋酸調(diào)節(jié)溶液的pH值。樣品在室溫條件下浸泡6 h，按照選定的超聲功率、時(shí)間、溫度和溶液pH值進(jìn)行提取，提取液用Sevag法去除游離蛋白質(zhì)[11]，減壓濃縮至一定體積，加入乙醇至最終乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，在4 ℃的溫度條件下沉淀24 h，離心，收集沉淀用流水透析48 h，凍干得到粗多糖。用苯酚-硫酸光度法測多糖含量[12]，計(jì)算提取得率。

1.3.2 復(fù)合酶添加量正交試驗(yàn)優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，固定其他提取條件為提取溫度45 ℃、超聲時(shí)間40 min、pH 5和超聲功率300 W，分別考察木瓜蛋白酶添加量（50、100、150 U/g）、果膠酶添加量（150、200、250 U/g）、纖維素酶添加量（100、150、200 U/g）和α-淀粉酶添加量（50、100、150 U/g）對粗多糖提取得率的影響，并采用四因素三水平的L9（34）正交試驗(yàn)來確定復(fù)合酶的最佳添加量。

1.3.3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在正交試驗(yàn)確定復(fù)合酶配比以及單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇提取溫度（X1）、超聲時(shí)間（X2）、溶液pH值（X3）和超聲功率（X4）4 個(gè)因素為自變量，每個(gè)因素選取3 個(gè)水平，以多糖提取得率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化超聲復(fù)合酶解提取條件。利用Design-Expert軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立四元二次回歸模型。

1.3.4 粗多糖的分離和純化

稱取一定質(zhì)量的粗多糖用蒸餾水溶解為10 mg/mL的溶液，然后用截留分子質(zhì)量6 kU超濾裝置循環(huán)至截留液為原來體積的1/5左右，收集截留溶液，濃縮、過0.45 μm膜，通過離子交換瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離，用Tris-HCl緩沖溶液平衡，隨后用0.1～0.8 mol/L NH4HCO3溶液（流速0.8 mL/min）梯度洗脫。用自動留分收集儀收集洗脫液（每管5 mL），用苯酚-硫酸法跟蹤檢測多糖含量，合并各吸收峰的洗脫液，得到3 個(gè)組分，然后分別上葡聚糖G-100凝膠色譜柱（16 cm×500 mm）進(jìn)一步純化，用0.1 mol/L NaCl溶液（流速1.0 mL/min）進(jìn)行洗脫，收集洗脫液（5 mL/管），苯酚-硫酸法跟蹤檢測多糖含量，合并主要洗脫峰留分，減壓濃縮，然后用蒸餾水透析、凍干，得到純化多糖組分EPs-1、EPs-2和EPs-3。

1.3.5 抗氧化活性測定

1.3.5.1 DPPH自由基清除活性測定

取1.0 mL（0.1 mmol/L）DPPH-甲醇溶液與3.0 mL與不同質(zhì)量濃度（0.1～5.0 mg/mL）多糖溶液混合，于25 ℃避光處反應(yīng)30 min，然后在517 nm波長條件下測定其吸光度。樣品對DPPH自由基清除率計(jì)算如式（1）所示：

式中：A0為只加DPPH溶液的吸光度；A1為加樣品和DPPH溶液的吸光度；A2為只加樣品溶液的吸光度。

1.3.5.2 羥自由基清除活性測定

羥自由基清除實(shí)驗(yàn)按文獻(xiàn)[13]報(bào)道的方法，并作稍微修改。1 mL不同質(zhì)量濃度的多糖樣品（0.5～5 mg/mL）與1 mL（10 mmol/L）FeSO4、1 mL（2 mmol/L）水楊酸-乙醇溶液和1 mL（5 mmol/L）H2O2混合，于37 ℃水浴中反應(yīng)1 h，在波長510 nm條件下測量其吸光度。樣品對羥自由基清除率計(jì)算如式（2）所示：

式中：A0為蒸餾水代替樣品的吸光度；A1為樣品反應(yīng)后的吸光度；A2為樣品和蒸餾水替代H2O2的吸光度。1.3.5.3 超氧陰離子自由基清除活性測定

超氧陰離子自由基清除實(shí)驗(yàn)按照文獻(xiàn)[14]報(bào)道的方法，并作稍微修改。5 mL pH值為8.2的Tris-HCl緩沖溶液（0.05 mol/L）分別與0.1 mL不同質(zhì)量濃度樣品（0.5～5 mg/mL）混合，在25 ℃水浴中恒溫20 min，加入0.2 mL（3 mmol/L）鄰苯三酚，然后在25 ℃水浴中恒溫4 min，在325 nm波長條件下測定吸光度，樣品對超氧陰離子自由基清除率計(jì)算如式（3）所示：

式中：A1為樣品的吸光度；A0為水代替樣品的吸光度。

1.3.5.4 總抗氧化能力測定

樣品的總抗氧化能力用鐵離子還原能力實(shí)驗(yàn)（FRAP）來測定[15]。新鮮FRAP試劑3.9 mL（300 mmol/L醋酸鹽緩沖溶液、10 mmol/L TPTZ溶解在40 mmol/L HCl溶液中、20 mmol/L FeCl3按照體積比10∶1∶1混合）與0.1 mL樣品混合，在37 ℃溫度條件下恒溫8 min，在593 nm波長處測定吸光度。分別用0.1 mL不同濃度的（0.1～1.0 mmol/L）的FeSO4與3.9 mL FRAP試劑混合，在37 ℃條件下反應(yīng)8 min，在593 nm波長處測定吸光度，以FeSO4濃度和吸光度回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的總抗氧化能力，總抗氧化能力以達(dá)到同樣吸光度所需的FeSO4的濃度表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶添加量對多糖提取得率的影響

其他提取參數(shù)分別固定為：浸泡時(shí)間6 h、超聲頻率40 kHz、提取溫度45 ℃、超聲功率300 W、超聲時(shí)間40 min、水料比30∶1（mL/g）、pH 4。

圖1 不同種類酶添加量對多糖提取得率的影響Fig. 1 Effect of enzyme dose on the yield of CEPs

如圖1a所示，木瓜蛋白酶添加量50～100 U/g，粗多糖的提取得率逐漸增加，當(dāng)添加量超過100 U/g提取得率保持相對不變。這表明粗多糖中大多數(shù)蛋白質(zhì)由Sevag試劑除去，但在多糖中會有一定量的糖蛋白，適當(dāng)增加木瓜蛋白酶添加量對多糖的提取是有利的。當(dāng)這些結(jié)合蛋白酶解趨于完全時(shí)，再增加木瓜蛋白酶添加量粗多糖提取得率不再增加。所以，木瓜蛋白酶較為適宜的添加量是100 U/g。

如圖1b所示，果膠酶添加量在50～200 U/g提取得率快速增加。超過這一添加量范圍，增加果膠酶添加量，粗多糖提取得率隨添加量的增加緩慢增加。增加果膠酶的添加量可以有效酶解提取液中的果膠，適當(dāng)降低提取液的黏度，這些都有利于多糖的提取。然而，較高的添加量會導(dǎo)致更高的成本。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇的最佳果膠酶添加量為200 U/g。

如圖1c顯示，纖維素酶添加量在50～150 U/g，添加量對提粗多糖取得率有顯著的影響。隨著纖維素酶添加量增加提取得率快速增加，在150 U/g時(shí)得率達(dá)到峰值。超過這個(gè)添加量，隨著纖維素酶添加量增加提取得率反而降低。這是由于更高添加量的纖維素酶會導(dǎo)致細(xì)胞壁的快速水解，利于胞內(nèi)多糖向周圍提取溶劑的擴(kuò)散，粗多糖得率快速增加，過量的纖維素酶會抑制底物水解，導(dǎo)致多糖提取得率降低[16]。所以，較為適宜的纖維素酶添加量為150 U/g。

如圖1d所示，α-淀粉酶添加量在100 U/g以內(nèi)，提取得率逐漸增加。然而，當(dāng)α-淀粉酶的添加量超過100 U/g時(shí)，隨著α-淀粉酶添加量增加多糖提取得率增加并不明顯。因此，α-淀粉酶較為適宜的添加量為100 U/g。

2.2 復(fù)合酶添加量的正交試驗(yàn)結(jié)果

表1 復(fù)合酶添加量正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table1 Orthogonal array design with experimental results

如表1所示，不同酶添加量對多糖提取得率的影響次序是：纖維素酶＞果膠酶＞木瓜蛋白酶＞α-淀粉酶。纖維素酶在復(fù)合酶解提取過程中起著重要的作用，接下來是果膠酶、木瓜蛋白酶和α-淀粉酶。通過正交試驗(yàn)得到復(fù)合酶添加量的最佳條件是A1B3C3D2，即木瓜蛋白酶50 U/g、果膠酶250 U/g、纖維素酶200 U/g、α-淀粉酶100 U/g，在該條件下可以實(shí)現(xiàn)超聲復(fù)合酶解效率的最大化。以下實(shí)驗(yàn)的復(fù)合酶添加量采用A1B3C3D2條件。

2.3 提取參數(shù)單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖2 不同提取參數(shù)對粗多糖提取得率的影響Fig. 2 Effect of different extraction parameters on the yield of CEPs

如圖2a所示，在25～45 ℃的范圍內(nèi)，粗多糖提取得率隨溫度的升高快速增加；當(dāng)溫度超過45 ℃時(shí)，隨溫度升高提取得率逐漸下降。說明在一定的溫度范圍內(nèi)較高溫度對多糖的快速溶解有利。在相同的時(shí)間內(nèi)，更高的溫度可以有效降低提取劑的黏度和密度，利于提取溶劑向固體組織內(nèi)部的滲透和多糖由組織內(nèi)部向周圍溶劑的擴(kuò)散，從而使多糖的提取得率升高。此外，在一定范圍內(nèi)升高溫度會增加酶的催化活性，提高酶解的效率。然而，當(dāng)提取溫度超過45 ℃時(shí)，粗多糖的提取得率隨著溫度進(jìn)一步升高而降低。分析可能的原因是較高的溫度使空化氣泡數(shù)目減少，降低了超聲波的空化作用和復(fù)合酶的活性，也可能導(dǎo)致多糖降解[17]。而且較高的溫度可能會導(dǎo)致溶劑的揮發(fā)和雜質(zhì)溶出量的增加。因此，提取溫度選擇45 ℃左右較為合適。

如圖2b所示，在最初的30 min內(nèi)，提取得率隨超聲時(shí)間延長快速增加。超過40 min時(shí)提取得率開始降低。一方面，延長超聲時(shí)間，超聲波對固體組織的空化、剪切效能累積量增加，組織細(xì)胞破碎程度和多糖的溶出量增加，因此提取率明顯提高。另一方面，過分延長超聲時(shí)間，可能會導(dǎo)致復(fù)合酶失活和多糖的降解，最終導(dǎo)致提取得率降低[18-19]，因此，超聲復(fù)合酶解的時(shí)間為40 min左右較為適宜。

如圖2c所示，pH值升高提取得率持續(xù)增加，當(dāng)pH 4時(shí)提取得率達(dá)到最大值。當(dāng)pH值超過4時(shí)，提取得率不再增加。這一現(xiàn)象說明復(fù)合酶的pH值在2～4時(shí)是比較合適的，當(dāng)pH值超過4時(shí)，復(fù)合酶的活性降低。因此，適宜的pH值為4。

如圖2d所示，超聲功率從100 W增加至300 W時(shí)，提取得率隨功率的增加顯著增加。超聲功率超過300 W后提取得率隨功率的增加緩慢降低。對于一個(gè)給定的介質(zhì)和單位體積的提取溶劑，振動與超聲功率呈正比。高的超聲功率產(chǎn)生更強(qiáng)的振動，導(dǎo)致更強(qiáng)空化和剪切效應(yīng)，多糖的傳質(zhì)效率提高，提取得率增加。然而，過高超聲功率可能造成多糖解聚和黏度降低，從而導(dǎo)致提取得率降低[20]。因此，300 W超聲功率是最佳的選擇。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果及方差分析

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table2 Box-Behnken design (BBD) matrix with response values for the yield of CEPs

在正交試驗(yàn)和單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取提取溫度（X1）、超聲時(shí)間（X2）、pH值（X3）和超聲功率（X4）4 個(gè)因素、每個(gè)因素取3 個(gè)水平的Box-Behnken設(shè)計(jì)對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。

利用Design-Expert 8.0軟件對表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，所得的回歸方程為：

表3 回歸模型方差分析Table3 Analysis of variance for the fitted quadratic polynomial model

對回歸模型進(jìn)行方差分析，從表3可以看出，一次項(xiàng)X3，二次項(xiàng)和交互項(xiàng)X1X2、X1X3、X1X4、X2X3、X3X4對粗多糖提取得率影響極顯著（P＜0.000 1）。一次項(xiàng)X1、X2，二次項(xiàng)和交互項(xiàng)X2X4對提取得率有顯著的影響（P＜0.05）。其他項(xiàng)對提取得率影響不顯著（P＞0.05）。其中pH值是影響粗多糖提取得率的主要因素。

從表3還可以看出，優(yōu)化建立的回歸模型P小于0.000 1，說明回歸模型達(dá)到極顯著水平，方程對實(shí)際實(shí)驗(yàn)有較好的擬合性；相關(guān)系數(shù)R2為0.990 6，修正相關(guān)系數(shù)為0.981 2也顯示模型擬合程度較好，試驗(yàn)誤差較?。皇M項(xiàng)不顯著（P = 0.105 2＞0.05），說明非試驗(yàn)因素對結(jié)果的影響不大，可以用此模型對超聲復(fù)合酶解提取淫羊藿葉多糖進(jìn)行預(yù)測分析。

2.5 響應(yīng)面分析

圖3 各因素交互作用對粗多糖提取得率影響的響應(yīng)面圖Fig. 3 Response surface plots showing the effects of various factors on the yield of CEPs

固定提取溶液pH 4和超聲功率300 W，如圖3a所示，提取得率隨提取溫度升高和超聲時(shí)間延長呈先增大后減小的趨勢。說明在一定的范圍內(nèi)增加提取溫度和延長超聲時(shí)間都有利于多糖的提取，但過高的提取溫度和較長超聲時(shí)間可能會造成多糖的降解，提取得率的降低。

固定超聲時(shí)間40 min、超聲功率300 W，如圖3b所示，當(dāng)溶液pH值一定時(shí)，提取溫度升高提取得率快速提高，當(dāng)溫度超過47 ℃后，提取得率隨溫度升高快速降低。而在試驗(yàn)的pH值范圍內(nèi)，隨溶液pH值的升高提取得率逐漸提高，說明在試驗(yàn)范圍內(nèi)較高pH值對提取是有利的。

固定提取溶液pH 4、超聲時(shí)間40 min，如圖3c所示，隨超聲功率和超聲溫度水平增大，多糖提取得率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。在一定范圍內(nèi)，超聲波的空化、剪切作用與溫度對植物組織的影響是一致的，增大提取溫度和超聲功率水平，單位提取溶劑得到的能量都會增加，較高的超聲功率和溫度利于提取得率的增加。超過一定值后，繼續(xù)升高溫度和增加功率會破壞多糖分子的結(jié)構(gòu)，使提取得率降低[21]。超聲功率和溫度對提取得率的交互影響相對較小。

固定超聲功率300 W和超聲溫度46.8 ℃，如圖3d所示，隨著pH值升高提取得率逐漸增加，說明pH值升高對復(fù)合酶的活性影響較大，在試驗(yàn)的范圍升高溶液pH值有利于多糖的提取。隨著超聲時(shí)間的延長多糖提取得率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，超聲時(shí)間對提取得率的影響相對較小，當(dāng)達(dá)到合適的值后繼續(xù)延長超聲時(shí)間就會破壞多糖的結(jié)構(gòu)，使多糖提取得率降低。

固定提取溶液pH 4和超聲溫度46.8 ℃，如圖3e所示，提取得率隨超聲時(shí)間和超聲功率水平的增大呈先增大后減小的趨勢，超聲時(shí)間和超聲功率對提取得率的影響呈現(xiàn)相似的趨勢。隨著時(shí)間的延長和功率的增大，有效地增加了多糖的提取得率，當(dāng)達(dá)到一定值時(shí)繼續(xù)增加提取功率和時(shí)間水平，產(chǎn)生無用空化氣泡增加散射衰減，導(dǎo)致多糖提取得率降低[22]。

當(dāng)超聲溫度46.8 ℃和超聲時(shí)間40 min時(shí)，如圖3f所示，提取得率隨著溶液pH值的升高而增加。隨著超聲功率的增大，超聲功率產(chǎn)生空化氣泡使植物組織破裂，細(xì)胞內(nèi)多糖向周圍溶劑擴(kuò)散速率增加，提取得率提高，當(dāng)超聲功率達(dá)到一定限度時(shí)繼續(xù)增大，破壞多糖結(jié)構(gòu)使其提取得率快速降低。

對回歸模型進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化，得到最優(yōu)的提取條件是：提取溫度46.8 ℃、超聲時(shí)間42.3 min、pH 4.3、超聲功率311 W。在最優(yōu)的條件下，實(shí)際實(shí)驗(yàn)中粗多糖的提取得率為（5.98±0.13）%，接近預(yù)測值6.2%。

2.6 粗多糖的分離純化

圖4 淫羊藿粗多糖的分離純化洗脫曲線Fig. 4 Isolation and purification of CEPs

超聲復(fù)合酶解提取得到的粗多糖經(jīng)過截留分子質(zhì)量6 ku超濾膜純化，然后用離子交換瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離純化，得到3 個(gè)組分CEPs-1、CEPs-2、CEPs-3，洗脫分離曲線見圖4a。得到的主要組分分別用分子篩凝膠進(jìn)一步純化，收集3 個(gè)主要洗脫峰的洗脫液凍干，得到3 個(gè)多糖組分，分別記為EPs-2、EPs-1和EPs-3（洗脫曲線見圖4b～d），得率分別為20.86%、26.02%和14.52%，其中的總糖含量EPs-2＜EPs-1＜EPs-3。

2.7 抗氧化活性

2.7.1 DPPH自由基清除活性

圖5 DPPH自由基清除活性Fig. 5 DPPH radical-scavenging capacity of three CEP fractions

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的自由基，甲醇溶液顯紫色，自由基清除劑能夠與DPPH的單電子被配對，在最大吸收波長處顏色變淺，吸光度也會隨之變小[23]。DPPH自由基清除率越高表明其抗氧化能力越大。以VC作為參照品，如圖5所示，3 個(gè)多糖組分都有顯著的清除活性，清除率隨質(zhì)量濃度的增加快速增加，其中EPs-3清除率最高，EPs-1清除率最低。分析可能的原因是多糖抗氧化活性與多糖的分子質(zhì)量分布有關(guān)，較小的分子質(zhì)量其抗氧化活性相對較高。

2.7.2 羥自由基清除活性

圖6 羥自由基清除活性Fig. 6 Hydroxyl radical-scavenging capacity of three CEP fractions

如圖6所示，3 個(gè)多糖組分都具有相對較高的羥自由基清除活性，都具有量效依賴關(guān)系，特別是在較高的質(zhì)量濃度時(shí)，其清除活性接近于VC，清除率的大小順序?yàn)椋篍Ps-2＞EPs-1＞EPs-3。

2.7.3 超氧陰離子自由基清除活性

如圖7所示，3 個(gè)多糖組分都有一定的超氧陰離子自由基的清除活性，其清除率隨多糖質(zhì)量濃度的增加逐漸增加，與VC比較3 個(gè)組分的超氧陰離子自由基清除活性相對較低，其清除活性順序?yàn)椋篍Ps-3＞EPs-2＞EPs-1，與DPPH自由基的清除效果一致。

圖7 超氧陰離子自由基清除活性Fig. 7 Superoxide anion radical-scavenging of three CEP fractions

2.7.4 總抗氧化活性

圖8 總抗氧化活性Fig. 8 Ferric-reducing antioxidant power (FRAP) of three CEP fractions

Fe3＋-TPTZ可被樣品中的多糖還原成Fe2＋的形式，溶液顏色由無色變?yōu)闇\藍(lán)色，在593 nm波長處有最大吸收，根據(jù)吸光度的大小可以計(jì)算樣出品總的抗氧化活性。如圖8所示，在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)其活性與VC接近，說明3 個(gè)多糖組分都具有較高的抗氧化活性，且都有顯著的量效依賴關(guān)系，總抗氧化活性順序?yàn)镋Ps-3＞EPs-2＞EPs-1，其抗氧化能力的不同與多糖的單糖組成、分子質(zhì)量分布和結(jié)構(gòu)等多種因素有關(guān)，采用超聲復(fù)合酶解提取多糖，可以有效降低多糖的分子質(zhì)量分布，增加多糖的抗氧化活性[24]。

3 結(jié) 論

用超聲復(fù)合酶解提取方法從淫羊藿葉中高效提取粗多糖。通過正交試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化得到最優(yōu)提取工藝如下：復(fù)合酶添加量（木瓜蛋白酶、果膠酶、纖維素酶和α-淀粉酶）分別為50、250、200、100 U/g，提取溫度46.8 ℃、超聲時(shí)間42.3 min、pH 4.3、超聲功率311 W。粗多糖經(jīng)過分離、純化得到3 個(gè)多糖組分，3 個(gè)多糖組分都具有顯著的抗氧化活性，活性呈量效依賴關(guān)系，組分EPs-3抗氧化活性最高，可以探索作為潛在的抗氧劑應(yīng)用于功能食品和藥品。超聲復(fù)合酶解提取作為一個(gè)高效的綠色提取技術(shù)，可以廣泛應(yīng)用于從植物原料中提取有效成分。

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Optimization of Extraction and Antioxidant Activity of Polysaccharides from Epimedium Leaves

TAN Li, CHEN Ruizhan*, CHANG Qingquan, LU Juan, JIN Chenguang, YIN Wei
(College of Chemistry, Changchun Normal University, Changchun 130032, China)

In this study, an ultrasonic-assisted enzymatic extraction (UAEE) method was proposed and optimized for the extraction of polysaccharides (CEPs) from Epimedium leaves. In the first step, the optimization of enzyme mixtures for the hydrolysis of Epimedium leaves was carried out by the combined use of one-factor-at-a-time method and orthogonal array design. Subsequently, the optimization of extraction parameters was done using Box-Behnken design with response surface methodology. The results showed that the influence of the dosage of enzymes on the extraction yield of CEPs was in the following order: cellulose ＞ pectinase ＞ papain ＞ α-amylase, and the optimal combination found were papain 50 U/g, pectinase 250 U/g, cellulase 200 U/g and α-amylase 100 U/g. The optimal extraction parameters were determined as 46.8 ℃, 42.3 min, 4.3 and 311 W for temperature, time, pH, and ultrasonic power, respectively. Under these conditions, the experimental yield of CEPs was 5.98%, which was well in close agreement with the value (6.2%) predicted by the proposed model. Three major fractions (EPs-1, EPs-2 and EPs-3) from the CEPs were purified by DEAE-Sepharose fast-flow and Sephadex G-100 column chromatography. The antioxidant activities of the three fractions were evaluated by 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical, hydroxyl radical and superoxide anion racial scavenging capacity assays, and ferricreducing antioxidant power (FRAP) assay in vitro. It was indicated that UCEE could be an effective and environmentfriendly technique for extracting active ingredients from plant materials. All the three polysaccharides exhibited significant antioxidant activities in a dose-dependent manner. These results suggested that Epimedium polysaccharides could be explored as potential antioxidants for use in functional foods or medicines.

Epimedium polysaccharide; ultrasonic-assisted enzymatic extraction (UAEE); response surface methodology; antioxidant activity

10.7506/spkx1002-6630-201702040

TS255.1

A

1002-6630（2017）02-0255-09

2016-05-10

吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（[2014]258；[2015]355）

譚莉（1991—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊挥袡C(jī)化合物分離結(jié)構(gòu)與活性。E-mail：litan1235@163.com

*通信作者：陳瑞戰(zhàn)（1967—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樘烊挥袡C(jī)化合物提取結(jié)構(gòu)與活性。E-mail： ruizhanchen@163.com

譚莉, 陳瑞戰(zhàn), 常清泉, 等. 淫羊藿葉多糖工藝優(yōu)化及抗氧化活性[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(2): 255-263. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201702040. http://www.spkx.net.cn

TAN Li, CHEN Ruizhan, CHANG Qingquan, et al. Optimization of extraction and antioxidant activity of polysaccharides from Epimedium leaves[J]. Food Science, 2017, 38(2): 255-263. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201702040. http://www.spkx.net.cn