梁瑋 姚嵐 劉寶林

（上海理工大學(xué)生物系統(tǒng)熱科學(xué)研究所 上海 200093）

低溫保存對Hep?G2細(xì)胞凋亡的影響

梁瑋 姚嵐 劉寶林

（上海理工大學(xué)生物系統(tǒng)熱科學(xué)研究所 上海 200093）

樣本質(zhì)量是體現(xiàn)生物樣本庫價(jià)值的關(guān)鍵，但是低溫保存可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡及基因表達(dá)量的變化，影響樣本質(zhì)量。本文采用流式細(xì)胞術(shù)與實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）的方法，研究了Hep?G2細(xì)胞在不同條件下凍存后凋亡及相關(guān)基因表達(dá)量。結(jié)果表明：低溫保存影響Hep?G2細(xì)胞的成活率、凋亡情況及某些凋亡基因表達(dá)量。無論凍存過程中是否添加低溫保護(hù)劑，低溫保存都會對細(xì)胞的凋亡相關(guān)基因表達(dá)帶來不同程度的影響。不添加保護(hù)劑凍存會導(dǎo)致細(xì)胞死亡，添加10%DMSO凍存會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，復(fù)蘇培養(yǎng)24 h后細(xì)胞的成活率、凋亡情況與相關(guān)基因表達(dá)量基本與對照組水平一致。

低溫保存；細(xì)胞凋亡；流式細(xì)胞術(shù)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

表1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab.1 Design of the experiment

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1材料與試劑

Hep?G2細(xì)胞（中科院上海生命科學(xué)研究院），胎牛血清，DMEM培養(yǎng)基，臺盼藍(lán)染色液（2X），二甲亞砜（DMSO），Annexin V?FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，RNAiso Plus，反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptRRT reagent Kit，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR試劑盒 SYBR Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time），Sample Protector for RNA／DNA。

1.1.2儀器與設(shè)備

HH.CP?01W 細(xì)胞培養(yǎng)箱，低速臺式離心機(jī)，F(xiàn)ACS CaliburTM流式細(xì)胞儀，7900HT實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組

表1所示為實(shí)驗(yàn)分組及各組的凍存液選用、凍存條件等情況。實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均取于同一批次培養(yǎng)后的細(xì)胞，凍結(jié)并復(fù)溫后，立即用離心法收集細(xì)胞，用于后續(xù)檢測。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)及凍存

Hep?G2細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)箱條件為 5%CO2、飽和濕度、37℃，細(xì)胞覆蓋率達(dá)到90%時(shí)傳代，傳代4～5次后取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞收集后加入冷凍保護(hù)液重懸，4℃平衡5 min后，以1℃／min的速度降溫至 －80℃，穩(wěn)定4 h后長期儲存在－80℃冰箱或液氮中。

1.2.3細(xì)胞成活率［6］

取重懸細(xì)胞100 μL于1.5 mL離心管中，再加入100 μL臺盼藍(lán)染液染色，混勻后靜止3～5 min，吸取10 μL于血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，分別記錄活細(xì)胞和死細(xì)胞數(shù)量。按公式（1）計(jì)算細(xì)胞存活率，每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次。

1.2.4細(xì)胞凋亡檢測

收集各組細(xì)胞，D?hank′s重懸，按照Annexin V?FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒的說明進(jìn)行染色，然后上機(jī)測定。

1.2.5 qPCR檢測［7］

細(xì)胞收集后加入Sample Protector for RNA／DNA，于－20℃保存。用 RNAiso Plus提取各實(shí)驗(yàn)組的RNA，然后參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書除去其中混有的DNA，隨后以去除了DNA的RNA為模板，做反轉(zhuǎn)錄，制備出單鏈cDNA，保存于－20℃。

表2細(xì)胞凋亡相關(guān)基因引物序列Tab.2 The primer sequences of apoptosis?related genes

根據(jù)Genebank檢索凋亡相關(guān)基因，選取Bcl?2，F(xiàn)as，Caspase?8為研究對象，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物（見表2），引物長度20～0 bp，擴(kuò)增的產(chǎn)物在100～200 bp左右，所有引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

以Actin為內(nèi)參基因，按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）的說明書配置PCR反應(yīng)液20 uL，并振蕩搖勻，使其充分混合。隨后放入PCR儀器中，設(shè)置首先在50℃作用2 min、95℃作用2 min，然后95℃作用15 s、53℃作用20 s、72℃作用20 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)，最后95℃作用2 min終止反應(yīng)。用2－ΔΔC（t）方法對qPCR結(jié)果進(jìn)行分析，其中正常對照組的結(jié)果均為1，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.6統(tǒng)計(jì)分析

采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS11.0對細(xì)胞成活率數(shù)據(jù)及qPCR數(shù)據(jù)進(jìn)行配對t檢驗(yàn)，各處理組與正常對照組進(jìn)行比較，P＜0.05即認(rèn)為差異顯著，P＜0.01認(rèn)為差異非常顯著。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 成活率

臺盼藍(lán)染色計(jì)算成活率的結(jié)果如圖1所示，實(shí)驗(yàn)2和實(shí)驗(yàn)3組細(xì)胞凍存時(shí)未添加保護(hù)劑，全部死亡，實(shí)驗(yàn)4組添加DMSO后在常溫下放置30 min也會造成一部分細(xì)胞死亡，經(jīng)過凍存后，細(xì)胞成活率均有所下降，并且－80℃凍存9 d的成活率（實(shí)驗(yàn)5組）比液氮中凍存30 d（實(shí)驗(yàn)6組）成活率低。復(fù)蘇培養(yǎng)24 h后（實(shí)驗(yàn)7組）成活率又恢復(fù)至對照組水平。

圖1 Hep?G2的成活率Fig.1 The survival rate of Hep?G2

2.2 細(xì)胞凋亡結(jié)果

流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率的結(jié)果如圖2所示，各個(gè)時(shí)期細(xì)胞占比見表3。對照組有94.32%的細(xì)胞為正常細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)2和實(shí)驗(yàn)3組細(xì)胞全部死亡，幾乎檢測不到正常大小的細(xì)胞，超大細(xì)胞及碎片率分別達(dá)到99.87%及97.14%，其各個(gè)時(shí)期細(xì)胞所占百分比并無實(shí)際意義。實(shí)驗(yàn)4組細(xì)胞在DMSO保護(hù)液中室溫放置30 min后，凋亡早期細(xì)胞由2.34%增加到27.83%。冷凍后凋亡早期細(xì)胞減少，而凋亡晚期和壞死的細(xì)胞增多。但是在液氮中冷凍保存的細(xì)胞正常細(xì)胞所占比率更高一些。實(shí)驗(yàn)7組細(xì)胞復(fù)蘇后培養(yǎng)24 h細(xì)胞凋亡率明顯降低，達(dá)到對照組的水平。

圖2流式細(xì)胞儀檢測凍存前后細(xì)胞凋亡率的結(jié)果（（a）～（g）分別為實(shí)驗(yàn)1～7組細(xì)胞檢測結(jié)果。右上象限為凋亡晚期及壞死細(xì)胞，右下象限為凋亡早期細(xì)胞，左下象限為正常細(xì)胞）Fig.2 The apoptosis of cells before and after cryopreservation（The results of No.1?7 are shown from a to g respectively，the upper right，lower right and lower left quadrants indicate the late?stage apoptotic and necrotic cells，early?stage apoptotic cells and the normal cells respectively）

表3 凍存前后細(xì)胞凋亡情況Tab.3 The apoptosis of cells in different stage before and after cryopreservation

2.3 qPCR檢測結(jié)果

如表4所示，實(shí)驗(yàn)2和實(shí)驗(yàn)3組細(xì)胞不添加任何保護(hù)劑凍存，抑制凋亡的基因Bcl?2表達(dá)量沒有顯著變化，而促進(jìn)凋亡的基因Caspase?8與Fas在－80℃凍存9 d后表達(dá)量略有下降，液氮凍存30 d后表達(dá)量顯著增加。

表4 qPCR檢測Hep?G2細(xì)胞目的基因的2－ΔΔC（t）值（±s，n＝3）Tab.4 2－ΔΔC（t）value of the genes in Hep?G2 by qPCR（±s，n＝3）

表4 qPCR檢測Hep?G2細(xì)胞目的基因的2－ΔΔC（t）值（±s，n＝3）Tab.4 2－ΔΔC（t）value of the genes in Hep?G2 by qPCR（±s，n＝3）

注：?：P＜0.05，??：P＜0.01，n＝3。

編號 Bcl?2 Fas Caspase?8 1 1.01±0.20 1.01±0.16 1.03±0.32 2 0.60±0.11?0.38±0.25?0.92±0.33 3 0.76±0.10 1.98±0.12??2.83±0.14??4 2.50±0.05??0.36±0.07??1.13±0.39 5 1.85±0.22??0.52±0.01??0.90±0.12 6 0.32±0.09??0.60±0.03?0.41±0.09?7 0.95±0.11 0.55±0.02??0.95±0.11

實(shí)驗(yàn)4組細(xì)胞在室溫下DMSO處理30 min，Bcl?2表達(dá)量增加。實(shí)驗(yàn)5組細(xì)胞－80℃凍存9 d后Bcl?2依舊保持較高的表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)6組細(xì)胞在液氮凍存30 d后Bcl?2、Caspase?8與Fas表達(dá)量有顯著降低。復(fù)蘇后培養(yǎng)24 h表達(dá)量有所恢復(fù)。

3 討論

細(xì)胞凋亡是醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究的重要內(nèi)容。生物樣本庫低溫保存的樣本主要服務(wù)于轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究，用于新藥開發(fā)的實(shí)驗(yàn)，這需要在樣本保存后不發(fā)生凋亡特性的改變，并且凋亡相關(guān)的基因表達(dá)水平也不能發(fā)生改變。添加冷凍保護(hù)劑保存樣本可以使凍存的樣本具有活性，應(yīng)用于樣本擴(kuò)大化或PDX模型的建立。細(xì)胞凋亡也是器官組織深低溫保存后喪失功能的重要原因［8］。因此研究冷凍對細(xì)胞凋亡的影響具有重要意義。本文以Hep?G2細(xì)胞為模型，對低溫保存后細(xì)胞的成活率、凋亡率及幾個(gè)凋亡相關(guān)基因表達(dá)量三個(gè)方面進(jìn)行了研究。

3.1 細(xì)胞成活率、凋亡率及凋亡相關(guān)基因表達(dá)量之間的關(guān)系

實(shí)驗(yàn)中得到的細(xì)胞的成活率與細(xì)胞凋亡的結(jié)果一致。用臺盼藍(lán)染色法測定細(xì)胞成活率時(shí)，正常細(xì)胞及凋亡早期細(xì)胞均檢測為活細(xì)胞，而凋亡晚期及壞死細(xì)胞則檢測為死細(xì)胞。不加保護(hù)劑凍存后的細(xì)胞全部死亡，成為細(xì)胞碎片，在流式細(xì)胞儀上檢測為非正常大小細(xì)胞，不會被計(jì)入有效細(xì)胞進(jìn)行凋亡統(tǒng)計(jì)。因此，檢測細(xì)胞凋亡是一項(xiàng)更準(zhǔn)確判斷細(xì)胞狀態(tài)的方法。在進(jìn)行組織器官保存研究時(shí)，要盡可能采取檢測細(xì)胞凋亡的方法對保存效果進(jìn)行判斷。

實(shí)驗(yàn)6組（75.92%）比實(shí)驗(yàn)4組（65.94%）正常細(xì)胞的比例高，這是因?yàn)镈MSO的毒性隨著溫度和時(shí)間的增加而增加［9］。實(shí)驗(yàn)4組在室溫暴露于DM?SO溶液30 min，而實(shí)驗(yàn)6組僅僅在4℃平衡5 min后就開始程序降溫，因此實(shí)驗(yàn)6組中DMSO的毒性帶來的損傷更小，凋亡細(xì)胞的比例也小一些。

現(xiàn)階段生物樣本庫保存的樣本主要用于提取生物大分子（DNA、RNA和蛋白質(zhì)等），此時(shí)保存的目標(biāo)是凋亡基因表達(dá)量不發(fā)生改變，并不需要保證樣本存活，本文的研究也說明細(xì)胞凋亡基因表達(dá)量的變化與成活率沒有明顯的聯(lián)系。

3.2 細(xì)胞凋亡機(jī)制及相關(guān)基因表達(dá)量的變化

關(guān)于冷凍后細(xì)胞發(fā)生凋亡機(jī)制的研究已有很多，J.M.Baust等［10］和U.Rauen等［11］的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞在冷凍過程中受到外界環(huán)境的刺激，如氧化應(yīng)激反應(yīng)，滲透壓損傷、冰晶形成、Na＋／K＋?ATP酶抑制使離子內(nèi)環(huán)境紊亂等，均會發(fā)生凋亡，此時(shí)細(xì)胞內(nèi)發(fā)生一系列的級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡相關(guān)的酶活化，促使細(xì)胞發(fā)生凋亡反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)還對凋亡過程中若干關(guān)鍵的基因表達(dá)水平進(jìn)行了研究，為抑制冷凍保存過程中凋亡發(fā)生的研究提供參考。

Caspase?8主要出現(xiàn)在凋亡的早期，是細(xì)胞凋亡的啟動者，有研究表明冷凍損傷造成的凋亡是由Caspase死亡受體依賴的線粒體途徑介導(dǎo)，而不涉及非Caspase蛋白酶［12?13］。Fas是誘導(dǎo)多種細(xì)胞凋亡的最主要的死亡受體之一，在Fas誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡體系中，F(xiàn)as通過激活 Caspase?8傳導(dǎo)凋亡信號［14?15］。不加任何保護(hù)劑凍存時(shí)，細(xì)胞在降溫過程中承受冷凍刺激帶來的冰晶與滲透壓損傷，自身會發(fā)生調(diào)節(jié)作用，此時(shí)一些基因表達(dá)量也可能發(fā)生變化。如Caspase?8 與Fas在液氮中凍存30 d后表達(dá)量都顯著增高，這說明細(xì)胞在無保護(hù)劑凍存時(shí)，雖然細(xì)胞全部死亡，但是在這個(gè)過程中也發(fā)生了細(xì)胞凋亡。而DMSO雖然本身具有一定的毒性，但是卻可以抑制Caspase?8的表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)與丁麗等［16］的研究都證明了這個(gè)結(jié)果。

Bcl?2是目前研究較多的凋亡抑制基因［17］，研究表明：Bcl?2通過抑制細(xì)胞色素 C的釋放，阻斷Caspase的激活來抑制凋亡，同時(shí)Bcl?2表達(dá)產(chǎn)物可阻止許多刺激物誘發(fā)的細(xì)胞凋亡［18］。DMSO能夠誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生［19－20］，常溫下細(xì)胞受到DMSO刺激，Bcl?2過量表達(dá)，原因可能是細(xì)胞的自我保護(hù)機(jī)制抑制了凋亡的發(fā)生。但是在凍存過程中，DMSO不僅可以保護(hù)細(xì)胞免于冰晶與滲透壓的損傷，提高細(xì)胞的存活率，其對細(xì)胞的刺激作用也有所減小，這點(diǎn)可以從Bcl?2的表達(dá)量在凍存后有所降低體現(xiàn)。

3.3 復(fù)蘇及再培養(yǎng)對細(xì)胞凋亡的影響

－80℃冰箱與液氮罐是樣本庫保存樣本常用的兩種保存條件，一般認(rèn)為在液氮中樣本能得到更好的保存［21］，因?yàn)榇藭r(shí)細(xì)胞的生命活動幾乎完全停止，可以長久保存并且不會引起基因蛋白等表達(dá)量的變化。但是細(xì)胞在降溫與儲存過程中通?？梢员４嫱旰?，卻極可能在復(fù)溫過程中遭受損傷而死亡［22］。復(fù)溫時(shí)活細(xì)胞會再次經(jīng)歷滲透壓的變化，胞內(nèi)冰也可能發(fā)生重結(jié)晶。這些物理因素的改變也極有可能再次導(dǎo)致某些基因表達(dá)量的變化，因此凍存與復(fù)溫過程共同影響著凋亡基因的表達(dá)。由于技術(shù)條件限制，本實(shí)驗(yàn)無法在細(xì)胞復(fù)溫前的冷凍狀態(tài)檢測其成活率、凋亡情況和基因表達(dá)水平，因此也無法判斷這些損傷是在哪個(gè)階段造成的。但是從應(yīng)用的角度講，復(fù)溫是必經(jīng)過程，研究復(fù)溫后的細(xì)胞凋亡情況也具有實(shí)際意義。關(guān)于如何減少冷凍保存帶來的細(xì)胞凋亡，C.Stroch等［23］的研究表明，無論在冷凍還是復(fù)溫過程中加入Caspase抑制劑，都可以阻止Caspase的激活，提高冷凍后細(xì)胞的復(fù)蘇率。

凍存是目前保存細(xì)胞與組織常用的方法，但是細(xì)胞在冷凍及復(fù)蘇過程中會發(fā)生一些變化，那么再培養(yǎng)就是細(xì)胞恢復(fù)正常所必經(jīng)的過程，細(xì)胞進(jìn)行自我修復(fù)和生長，可達(dá)到最佳生長狀態(tài)。但是復(fù)蘇培養(yǎng)24 h 后Fas基因表達(dá)量依然很低，這可能是因?yàn)椴煌虮磉_(dá)量的恢復(fù)時(shí)間不同，可延長培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)一步觀察。然而復(fù)蘇培養(yǎng)后的細(xì)胞已與凍存前的細(xì)胞完全不同，其基因表達(dá)水平是否能真正代表凍存前的狀態(tài)，復(fù)蘇培養(yǎng)技術(shù)能否應(yīng)用于生物樣本庫還需要斟酌。因此目前可行的辦法是通過添加凋亡抑制劑或改進(jìn)保護(hù)劑配方以穩(wěn)定RNA的表達(dá)。

4 結(jié)論

本文通過用流式細(xì)胞術(shù)與實(shí)時(shí)熒光定量PCR對Hep?G2細(xì)胞進(jìn)行凋亡情況的研究，得到如下結(jié)論：

1）無論凍存過程中是否添加低溫保護(hù)劑，低溫保存都會對細(xì)胞的凋亡相關(guān)基因表達(dá)帶來不同程度的影響。

2）不加保護(hù)劑凍存會導(dǎo)致細(xì)胞死亡，添加10% DMSO凍存會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，復(fù)蘇培養(yǎng)24 h后細(xì)胞的成活率和凋亡情況與相關(guān)基因表達(dá)量基本與對照組水平一致。

3）本文僅對一種細(xì)胞凍存后的凋亡情況和幾個(gè)凋亡相關(guān)基因表達(dá)量進(jìn)行了研究，還有許多凋亡通路中的相關(guān)基因需要進(jìn)一步研究。

4）實(shí)驗(yàn)中所選的保護(hù)劑DMSO會對細(xì)胞凋亡帶來較大影響，可通過添加凋亡抑制劑或更換保護(hù)劑以減少細(xì)胞凋亡，穩(wěn)定凋亡相關(guān)基因表達(dá)。

本文受上海東方學(xué)者跟蹤計(jì)劃項(xiàng)目資助。（The project was supported by the Project Tracing Program of Oriental Schol?ars.）

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Effects of Cryopreservation on Apoptosis in Hep?G2 Cells

Liang Wei Yao Lan Liu Baolin

（Institute of Biothermal and Technology，University of Shanghai for Science and Technology，Shanghai，200093，China）

The quality of biospecimens is a very important factor of evaluating a biobank.Cryopreservation may induce apoptosis and changes of gene expression in cells.In this research the apoptosis profiles were assessed by flow cytometry and the expression of RNAs re?lated to apoptosis were estimated by real?time fluorescent quantitative PCR（qPCR）in Hep?G2 cells after cryopreservation.The results showed that with the addition of 10%DMSO or no cryoprotectant during cryopreservation，the cryopreservation progress made some impact on apoptosis and the expression of RNAs related to apoptosis in Hep?G2 cells.During cryopreservation，the cells were all dead with no cryoprotectant，but more cells apoptosis occurred with 10%DMSO.The cells could be recovered to normal level when the cells were re?cultured for 24 hours after cryopreservation.

cryopreservation；apoptosis；flow cytometry；real?time fluorescent quantitative PCR

TB61＋1；R318.52；R73?3

A

0253－4339（2017）01－0113－06

10.3969／j.issn.0253－4339.2017.01.113

2016年4月29日研究了其在不同條件下凍存前后的凋亡情況及其幾 個(gè)凋亡相關(guān)基因凍存前后表達(dá)量的變化。

國家自然科學(xué)基金（51076108）資助項(xiàng)目。（The project was supported by the National Natural Science Foundation of China（No. 51076108）.）

生物樣本庫（biobank）也叫生物銀行，是指標(biāo)準(zhǔn)化收集、處理、儲存和應(yīng)用健康和疾病生物體的生物大分子、細(xì)胞、組織和器官等樣本（包括人體器官組織、全血、血漿、血清、生物體液或經(jīng)處理過的生物樣本（DNA、RNA、蛋白等）以及與這些生物樣本相關(guān)的臨床、病理、治療、隨訪、知情同意等資料及其質(zhì)量控制、信息管理與應(yīng)用系統(tǒng)［1］。生物樣本庫是轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究的戰(zhàn)略資源［2］，一個(gè)高質(zhì)量的生物樣本庫不僅要有種類豐富的大量樣本，更重要的是能夠保證這些樣本的質(zhì)量［3］?；谏飿颖編斓难芯慷家云渲斜４鏄颖镜馁|(zhì)量未發(fā)生改變?yōu)榍疤?，只有徹底排除在保存過程中發(fā)生的基因、蛋白質(zhì)等變化，才能準(zhǔn)確判斷患病前后或治療前后基因表達(dá)之間真正的關(guān)聯(lián)［4］。因此為了研究結(jié)果的可靠性，需要迫切了解在低溫保存過程中樣本質(zhì)量是否發(fā)生改變。目前已有學(xué)者針對樣本庫中保存樣本的RNA質(zhì)量進(jìn)行了研究［5］，但是少有對比樣本凍存前后質(zhì)量變化的結(jié)果。此外，對細(xì)胞在不同凍存條件下凍存前后RNA質(zhì)量的變化進(jìn)行研究，也可以為改進(jìn)組織和血液的凍存方法提供參考。

凋亡是腫瘤基礎(chǔ)研究中非常重要的特性，Bcl?2、Fas、Caspase?8是研究細(xì)胞凋亡的重要基因，由于組織的結(jié)構(gòu)和成分比較復(fù)雜，一般在研究前先選取簡易的細(xì)胞系模型進(jìn)行初步研究。肝癌是一種常見的腫瘤疾病，很多樣本庫都保存有肝癌樣本。因此本文選取了常用的細(xì)胞模型——人肝癌上皮細(xì)胞Hep?G2，

劉寶林，男，教授，博士，上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，（021）55277768，E?mail：blliuk＠163.com。研究方向：生物材料的低溫保存。

About the corresponding author

Liu Baolin，male，Ph.D.／professor，School of Medical Instru?ment and Food Engineering，University of Shanghai for Science and Technology，＋86 21?55277768，E?mail：blliuk＠163.com. Research fields：cryopreservation of biomaterials.