鄒華鋒+馮宇紅+蘭兆輝+呂為群

摘要：選取斑馬魚在28、18 ℃條件下處理2周，對(duì)尾部神經(jīng)系統(tǒng)CNSS組織的U[QX（Y15]Ⅰ[QX）]、CRH、U[QX（Y15]Ⅱ[QX）]α、U[QX（Y15]Ⅱ[QX）]β、[WTBX][STBX]M2[WTBZ][STBZ]基因表達(dá)以及斑馬魚的游泳運(yùn)動(dòng)行為進(jìn)行了研究。經(jīng)過寒冷應(yīng)激后，試驗(yàn)組應(yīng)激相關(guān)基因CRH、U[QX（Y15]Ⅱ[QX）]α、U[QX（Y15]Ⅱ[QX）]β、[WTBX][STBX]M2[WTBZ][STBZ]表達(dá)與對(duì)照組相比均明顯上升，但對(duì)U[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因表達(dá)沒有影響。對(duì)斑馬魚的運(yùn)動(dòng)軌跡進(jìn)行分析表明，2個(gè)組的斑馬魚在快速游泳距離、慢速游泳距離、平均游泳速度方面均存在明顯差異，低溫處理組斑馬魚的慢速游泳時(shí)間明顯高于對(duì)照組，平均游泳速度明顯低于對(duì)照組。行為學(xué)數(shù)據(jù)和基因表達(dá)分析均表明，寒冷處理對(duì)斑馬魚造成了應(yīng)激反應(yīng)，低溫條件下斑馬魚活動(dòng)行為的減少可能是降低機(jī)體能量消耗的一種生存策略。

關(guān)鍵詞：斑馬魚；尾部神經(jīng)系統(tǒng)；尾加壓素；基因表達(dá)；低溫

中圖分類號(hào)： Q344+.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號(hào)：1002-1302（2016）08-0043-04

水體溫度是影響魚類生長發(fā)育的重要環(huán)境因子，對(duì)魚類生長、繁殖、遷移等生命過程具有重要影響[1]。與陸地哺乳動(dòng)物不同，魚類屬于變溫動(dòng)物，魚類生活的環(huán)境溫度波動(dòng)范圍更為劇烈，經(jīng)常遭遇多種不可避免的劇烈溫差變化，如晝夜氣溫驟降、季節(jié)交替等引起的溫度驟變，從而對(duì)魚類產(chǎn)生各種短期或長期的應(yīng)激反應(yīng)[2]。如果魚類不能適應(yīng)這種劇烈溫度變化引起的應(yīng)激反應(yīng)，通常會(huì)導(dǎo)致死亡，對(duì)漁業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[3]。

應(yīng)激是生物生存和進(jìn)化必不可少的生理反應(yīng)，魚類尾部神經(jīng)系統(tǒng)（CNSS）作為應(yīng)激系統(tǒng)的一部分，與下丘腦-神經(jīng)-垂體系統(tǒng)共同參與維持魚類應(yīng)激狀態(tài)下內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，在環(huán)[JP3]境適應(yīng)、應(yīng)激過程中起到至關(guān)重要的作用[4-5]。CNSS在魚類中是CRH、UⅠ、UⅡ等激素表達(dá)和分泌的主要場所[6]，開展對(duì)斑馬魚CNSS的研究有利于了解其在低溫變化過程中適應(yīng)環(huán)境變化的生理機(jī)制，為其他經(jīng)濟(jì)魚類抗寒冷應(yīng)激的研究提供依據(jù)。

斑馬魚（Danio rerio）是近幾十年來被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、遺傳學(xué)、醫(yī)學(xué)等生命科學(xué)領(lǐng)域的重要模式生物，可在5～38 ℃下生存[7-8]，是研究魚類對(duì)不同環(huán)境溫度適應(yīng)性的良好模型。根據(jù)已有研究，本試驗(yàn)對(duì)正常環(huán)境溫度28 ℃與寒冷溫度18 ℃下飼養(yǎng)的斑馬魚進(jìn)行比較[9-10]，以揭示斑馬魚在低溫環(huán)境溫度下CNSS參與應(yīng)激反應(yīng)的相關(guān)基因變化，并結(jié)合行為學(xué)分析初步研究斑馬魚在寒冷應(yīng)激條件下的適應(yīng)機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1斑馬魚養(yǎng)殖

試驗(yàn)所用斑馬魚由筆者所在實(shí)驗(yàn)室斑馬魚房自行繁育，屬野生型Tuebingen純系后代。斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)購自上海海圣水族設(shè)備有限公司，每10～15尾養(yǎng)殖于3 L水循環(huán)系統(tǒng)魚缸中。養(yǎng)殖房水溫和室溫均控制在26～28 ℃，光照度約為200 lx，光—暗周期為14 h—10 h。

1.1.2樣品處理

選取健康、性成熟的6月齡雄性斑馬魚為研究對(duì)象，隨機(jī)選取同批次體長為（3.05±0.30） cm、體質(zhì)量為（0.36±0.10） g的雄魚。將斑馬魚移至恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行試驗(yàn)處理，分為常溫對(duì)照組、冷應(yīng)激組，處理溫度分別為28、18 ℃。光照周期與養(yǎng)殖系統(tǒng)內(nèi)養(yǎng)殖環(huán)境相同，2個(gè)組的斑馬魚分別在各自溫度下處理14 d。試驗(yàn)結(jié)束后迅速斷頭、斷尾，在冰上對(duì)斑馬魚尾部完成CNSS取樣。

1.2方法

1.2.1行為學(xué)試驗(yàn)和分析

每組取6尾魚進(jìn)行行為學(xué)分析，于20：00將待觀察的斑馬魚從恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)取出，轉(zhuǎn)移至 Zebrafish 行為學(xué)觀察裝置中，待斑馬魚適應(yīng)后（約10 min）對(duì)其游泳行為進(jìn)行連續(xù)記錄并分析。采用Viewpoint系統(tǒng)（法國眾為公司產(chǎn)品）對(duì)斑馬魚的游泳行為進(jìn)行攝像分析，每尾斑馬魚連續(xù)觀察5 min并記錄。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，將斑馬魚游泳速度在2 cm/s以下定義為慢速游泳，將2 cm/s以上定義為快速游泳。采用Zebrafish行為學(xué)分析軟件對(duì)5 min內(nèi)快速游泳時(shí)間和距離、慢速游泳時(shí)間和距離、平均游泳速度進(jìn)行分析。

1.2.2反轉(zhuǎn)錄與熒光定量PCR

按照說明書采用Trizol（TaKaRa）提取斑馬魚CNSS樣品RNA，提取的RNA在Nanodrop儀器上進(jìn)行濃度測定。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，A047）按照說明書取1 μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將得到的cDNA稀釋10倍后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。采用2× SRBR熒光分析酶（Roche公司）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析，PCR反應(yīng)體系共20 μL，其中上下游引物各1 μL、cDNA模版2 μL、SYBR酶10 μL，剩余體積用水補(bǔ)足。采用abi7500型儀器行熱循環(huán)反應(yīng)，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃變性和延伸40 s，共設(shè)置40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后設(shè)置溶解曲線檢驗(yàn)反應(yīng)產(chǎn)物的特異性。以β-actin為內(nèi)進(jìn)標(biāo)，采用2-ΔΔCT方法對(duì)目的基因進(jìn)行相對(duì)定量分析，所用引物序列見表1。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graphpad prism 5（Graphpad Software. San Diego，CA）軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。采用T-test方法對(duì)對(duì)照組和試驗(yàn)組的基因表達(dá)、行為學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2結(jié)果與分析

2.1斑馬魚的游泳行為

采用Viewpoint行為學(xué)觀察儀（法國眾維公司產(chǎn)品）對(duì)斑馬魚5 min內(nèi)的游泳軌跡進(jìn)行攝像。游泳軌跡見圖1，綠色曲線、紅色曲線分別表示低速、快速游泳運(yùn)動(dòng)。[FL）]

采用行為學(xué)分析軟件對(duì)斑馬魚的運(yùn)動(dòng)軌跡進(jìn)行分析。結(jié)果表明：從時(shí)間分布來看，2個(gè)組的斑馬魚在運(yùn)動(dòng)時(shí)間分布上具有顯著差異，在觀察記錄的5 min運(yùn)動(dòng)行為中，寒冷組斑馬魚慢速運(yùn)動(dòng)所占時(shí)間明顯多于對(duì)照組（圖2-A），而快速游泳運(yùn)動(dòng)的時(shí)間明顯少于對(duì)照組（圖2-B）；從游泳距離來看，寒冷應(yīng)激組的慢速游泳距離顯著高于對(duì)照組（圖2-C），而快速游泳距離顯著低于對(duì)照組（圖2-D）；寒冷應(yīng)激組斑馬魚的平均游泳速度明顯小于對(duì)照組（圖2-E）。

應(yīng)激是生物應(yīng)對(duì)外界環(huán)境變化重新調(diào)整體內(nèi)動(dòng)態(tài)平衡過程而進(jìn)行特異和非特異級(jí)聯(lián)放大的生理反應(yīng)，應(yīng)激的重要神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)之一是HPA軸即下丘腦-垂體-腎上腺軸的激活。魚類不僅具有下丘腦-垂體系統(tǒng)，還具有一套類似的神經(jīng)分泌系統(tǒng)CNSS，即尾部神經(jīng)分泌系統(tǒng)[11]。CNSS系統(tǒng)內(nèi)的Dahlgren細(xì)胞分泌物通過軸突運(yùn)送至尾垂體中貯存，再由尾垂體直接分泌進(jìn)入尾靜脈，以便分泌物迅速抵達(dá)腎臟、腸、性腺、肝臟等靶器官，參與機(jī)體對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)過程[5，12]。

已有研究表明，魚類在寒冷條件下運(yùn)動(dòng)能力顯著下降，機(jī)體內(nèi)參與代謝的各種酶的活性隨著溫度下降而下降，提供給肌肉運(yùn)動(dòng)的能量也隨之減少[13]。本試驗(yàn)中，18 ℃寒冷條件下斑馬魚慢速游泳的時(shí)間顯著長于28 ℃條件下的對(duì)照組，且其游泳距離顯著小于對(duì)照組，表明寒冷處理對(duì)斑馬魚的正常游泳機(jī)能造成了影響。在試驗(yàn)前期對(duì)斑馬魚1、24 h等長時(shí)間的游泳運(yùn)動(dòng)行為進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)低溫條件下魚的運(yùn)動(dòng)行為均顯著下降，因此本研究只分析具有代表性的5 min內(nèi)游泳軌跡。

以往關(guān)于魚類對(duì)溫度應(yīng)激的研究多集中于魚類腦部[10]，而魚類CNSS是機(jī)體除腦部外參與應(yīng)激的主要部位，CNSS內(nèi)的Dahlgren細(xì)胞通過分泌CRH、UⅠ、UⅡ等激素進(jìn)入血液參與應(yīng)激反應(yīng)[14]。在大鼠和虹鱒魚的研究中，應(yīng)激導(dǎo)致CRH mRNA表達(dá)上升[15-16]，這與本研究中斑馬魚經(jīng)冷應(yīng)激處理后CRH基因表達(dá)顯著上升相一致，但本研究中U[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因表達(dá)并未表現(xiàn)出差異。盡管CRH和U[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因同屬于CRH超家族一類，且CRH和U[QX（Y15]Ⅰ[QX）]在魚腦和尾部CNSS系統(tǒng)存在共表達(dá)的現(xiàn)象[17]，但參與CRH和U[QX（Y15]Ⅰ[QX）]的具體轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制可能并不同。在大麻哈魚腦組織內(nèi)，8—9月時(shí)雌性、雄性腦組織CRH mRNA均顯著升高，但U[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因卻沒有差異[18]。將虹鱒從淡水環(huán)境轉(zhuǎn)移至海水中，24 h后進(jìn)行基因表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)腦前區(qū)組織中CRH表達(dá)升高，但U[QX（Y15]Ⅰ[QX）]并未發(fā)生變化[19]。

對(duì)低等脊椎動(dòng)物硬骨魚UⅡ的研究表明，該激素參與動(dòng)物體內(nèi)的滲透壓調(diào)節(jié)[20]。國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，UⅡ能刺激離體蝦虎魚膀胱，并適應(yīng)淡水生活的歐洲鰻鱺后腸組織對(duì)鈉離子的吸收和重吸收能力[21]。UⅡ能增加魚類在低滲環(huán)境中對(duì)鈉離子和氯離子的保存能力，從而減少機(jī)體內(nèi)離子的流失。牙鲆血液中Urotensin激素的含量與外部鹽度密切相關(guān)，當(dāng)歐洲川鰈從鹽水環(huán)境轉(zhuǎn)移至淡水中時(shí)，血液Urotensin水平顯著上調(diào)[14]，表明UⅡ在離子調(diào)節(jié)方面具有重要作用。已有研究表明，寒冷條件下斑馬魚鰓組織中Na-K-ATP酶的活性下降，伴隨體內(nèi)鈣離子和鈉離子顯著下降[22]。本研究中，U[QX（Y15]Ⅱ[QX）]α和U[QX（Y15]Ⅱ[QX）]β基因mRNA升高可能是寒冷刺激引起斑馬魚離子丟失后，體內(nèi)離子濃度恢復(fù)平衡的一種彌補(bǔ)機(jī)制。

毒蕈堿樣乙酰膽堿受體（M受體）屬于G蛋白相偶聯(lián)的受體超大家族，參與運(yùn)動(dòng)、體溫調(diào)節(jié)、學(xué)習(xí)記憶等多種重要生理功能[23-24]。M2激動(dòng)劑可以劑量依賴性地增強(qiáng)老鼠血液內(nèi)皮質(zhì)醇的濃度，如果將[WTBX][STBX]M2[WTBZ][STBZ]基因進(jìn)行敲除，M2激動(dòng)劑的效果被抑制，表明M2信號(hào)通路在應(yīng)激過程中起到了重要作用[25]。本研究中，寒冷應(yīng)激處理后斑馬魚CNSS組織中的M2受體表達(dá)明顯上調(diào)，進(jìn)一步證明寒冷處理對(duì)斑馬魚產(chǎn)生了明顯的應(yīng)激反應(yīng)，同時(shí)體現(xiàn)了[WTBX][STBX]M2[WTBZ][STBZ]基因在應(yīng)激中的重要性。

18 ℃的寒冷處理對(duì)斑馬魚造成了應(yīng)激反應(yīng)，并嚴(yán)重影響斑馬魚的運(yùn)動(dòng)機(jī)能。寒冷造成斑馬魚的應(yīng)激反應(yīng)以及運(yùn)動(dòng)機(jī)能下降，可能是機(jī)體為了生存而減少運(yùn)動(dòng)、保存能量的一種策略，具體機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

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