鄭萍+余芳+蔣彩云+李婷

摘要：采用超聲提取法對(duì)迷迭香中的抗氧化活性物質(zhì)進(jìn)行了提取，并研究了該提取液的抑菌效果。通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定了提取的最佳工藝條件：提取溶劑為50%乙醇，料液比1 g ∶[KG-3]22 mL，時(shí)間1.0 h，溫度40 ℃。此外，抑菌試驗(yàn)表明迷迭香提取物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌皆有良好的抑菌效果，其抑菌圈的平均大小分別為196、20.9 mm，最低抑菌濃度分別為0.782、0.391 mg/mL。

關(guān)鍵詞：迷迭香；抗氧化；抑菌圈；最低抑菌濃度

中圖分類號(hào)： R151.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號(hào)：1002-1302（2016）08-0370-03

迷迭香是一種新型資源植物，所需生長條件特殊，在我國較少見，屬于稀有植物。因其全身都是寶的特點(diǎn)，被研究和應(yīng)用的也較為廣泛，迷迭香不僅具有抗氧化成分，還具有抑菌功效[1-3]。迷迭香已作為解熱、鎮(zhèn)痛、消炎的藥物投放市場(chǎng)，同時(shí)也可以作為開發(fā)抗血栓的新藥。迷迭香活性物已被廣泛提取，但提取方法仍須進(jìn)一步完善，以提高其應(yīng)用價(jià)值[4-5]。本研究采用超聲提取法對(duì)迷迭香中的抗氧化活性物質(zhì)進(jìn)行了提取，同時(shí)對(duì)該提取物的天然抑菌功效進(jìn)行了研究。

1材料與方法

1.1主要儀器

超聲波清洗器（FA2104N）、萬能高速粉碎機(jī)（FW100）、紫外分光光度計(jì)（UV-6300）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（PE3000）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（HG 303-4）。

1.2試劑與材料

迷迭香、無水乙醇、1，3-丁二醇、1，3-丙二醇、正丁醇、丙三醇（甘油）、甲醇、石油醚、異丙醇、1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH）、1，3-丁二醇，皆為分析純，試驗(yàn)用水為純凈水。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌。

培養(yǎng)基（牛肉營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基）：蛋白胨10 g，牛肉膏 5 g，酵母浸粉2 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，水100 mL，調(diào)pH值至7.2～7.6。

菌種培養(yǎng)與純化：將供試菌種分別挑于無菌的培養(yǎng)基上，倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，從中挑選單個(gè)菌落進(jìn)行試管斜面培養(yǎng)，備用。取活化的斜面菌種分別用接種環(huán)挑取菌苔，用無菌水制成含菌數(shù)為106 CFU/mL的菌懸液待用。

提取液的制備：將提取液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，再用1，3-丁二醇溶解制備濃度為0.5 g/mL的迷迭香提取原液，經(jīng)高壓滅菌后備用。

濾紙片的制備：取直徑為6 mm的圓形高壓滅菌濾紙片若干，分別浸入迷迭香原液中，浸泡使其充分吸收，再烘至干燥備用。

1.3DPPH·法評(píng)價(jià)迷迭香提取液的抗氧化性

將提取液稀釋500倍后進(jìn)行以下操作：取3支比色管，精確量取提取溶劑2 mL和2 mL LDPPH·溶液到1號(hào)比色管，即為空樣溶液；精確量取2 mL提取液和2 mL DPPH·溶液到2號(hào)比色管，即為反應(yīng)溶液；精確量取2 mL提取液和2 mL無水乙醇溶劑到3號(hào)比色管，即為空白溶液。分別將振蕩搖勻后的上述溶液置于暗處避光反應(yīng)30 min后，于517 nm波長處測(cè)定吸光度（D）分別得到D空樣液、D反應(yīng)液、D空白液，按公式（1）進(jìn)行計(jì)算。

DPPH·清除率=[1-（D反應(yīng)液-D空白）/D空樣液]×100%。[JY]（1）

1.4迷迭香中活性成分的提取

將烘干至恒質(zhì)量的迷迭香樣品用粉碎機(jī)粉碎后，稱取一定量的迷迭香粉分別放入相應(yīng)的提取劑中，在不同的條件下進(jìn)行提取，得到含迷迭香活性成分的提取溶液。

1.5抑菌試驗(yàn)

1.5.1抑菌活性取0.1 mL的菌懸液，均勻涂抹在平板培養(yǎng)基表面，制成含菌平板。用無菌鑷子小心取出干燥的濾紙片于各含菌平皿上，每皿5片（求其平均值），同時(shí)做無菌生理鹽水、無菌平皿、無菌空白濾紙、50%乙醇、1，3-丁二醇、純水和培養(yǎng)基對(duì)照試驗(yàn)。平行3次，然后將各平皿置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，取出后測(cè)其抑菌圈直徑大小并比較抑菌活性。

1.5.2抑菌濃度固體平板培養(yǎng)基稀釋法[6]：取無菌試管10支，分別加入1 mL無菌蒸餾水，取迷迭香提取物原液 1.0 mL 移入1號(hào)試管，混勻后，取出1.0 mL混合液移入2號(hào)試管，依次操作。從9號(hào)管取出1.0 mL棄去。迷迭香提取物原液按1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256、1/512的比例進(jìn)行稀釋。使1～8號(hào)管中均含有1 mL不同稀釋度的提取液，9號(hào)管為無提取物對(duì)照。然后在每支試管中加入融化至55 ℃的固體瓊脂培養(yǎng)基（9 mL）充分混勻，傾注平板（10 mL/平皿），形成12.5、6.25、3.15、1.563、0.782、0.391、0.195、0.098、0 mg/mL含迷迭香原液的普通培養(yǎng)基，平板凝固后，分別取大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的菌懸液（濃度均為106 CFU/mL ） 0.1 mL涂布于平板表面，同時(shí)做50%乙醇、1，3-丁二醇、蒸餾水及培養(yǎng)基的空白試驗(yàn)，置于37 ℃培養(yǎng) 18～24 h，平行3次，觀察結(jié)果。

2結(jié)果與分析

本試驗(yàn)采用二苯基苦基苯肼（簡(jiǎn)稱DPPH）分光光度法評(píng)價(jià)迷迭香提取物的抗氧化活性，該方法是評(píng)價(jià)自由基清除效果和挑選天然抗氧化劑最常用的方法[7]。通過比較紫外可見分光光度計(jì)檢測(cè)DPPH·與提取液反應(yīng)后的吸光度的變化，從而建立了評(píng)價(jià)提取液的清除率體系，在該評(píng)價(jià)體系的基礎(chǔ)上，進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，從而確定最佳提取工藝。

2.1單因素試驗(yàn)

2.1.1不同提取劑對(duì)迷迭香中抗氧化物提取效果的影響稱1.5 g迷迭香粉末于45 mL溶劑中，溶劑分別采用純水、無水乙醇、50%乙醇、75%乙醇、1，3-丁二醇、1，3-丙二醇、正丁醇、丙三醇（甘油）、甲醇、石油醚、異丙醇，在40 ℃下超聲 1 h，抽濾得到樣品的提取液。計(jì)算提取液對(duì)DPPH的清除率，結(jié)果見圖1。

因?yàn)橐掖嫉奶崛⌒Ч己茫紤]到經(jīng)濟(jì)節(jié)約的原則，又分別采用純水、10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、75%乙醇、無水乙醇作為溶劑進(jìn)行提取試驗(yàn)，結(jié)果見圖2。

從圖2中可以看出，對(duì)于相同的迷迭香粉量，用50%乙醇提取時(shí)，得到的提取物抗氧化能力最強(qiáng)，75%乙醇次之，純水的提取效果最差?？紤]到經(jīng)濟(jì)，選用50%乙醇最為合適。

2.1.2不同提取方式對(duì)迷迭香中抗氧化物提取效果的影響稱1.5 g迷迭香粉加入到45 mL的50%乙醇中，于40 ℃下分別采用水浴振蕩、攪拌、超聲波輔助、微波（2 min）、靜置5種提取方式進(jìn)行提取，提取時(shí)間為1 h，抽濾得到提取液。從圖3可知，超聲提取效果最佳，水浴振蕩次之，微波的效果最差。

2.1.3料液比對(duì)迷迭香中抗氧化物提取效果的影響稱 1.0 g 迷迭香粉，在提取溫度為40 ℃，提取液濃度為50%乙醇，提取時(shí)間1 h的條件下，依次在料液比為1 ∶[KG-3]10、1 ∶[KG-3]15、1 ∶[KG-3]20、1 ∶[KG-3]25、1 ∶[KG-3]30、1 ∶[KG-3]35（g ∶[KG-3]mL）的條件下進(jìn)行提取。從圖4中可以看出，隨著料液比的增加，提取效果先增強(qiáng)后降低，當(dāng)原料一定時(shí)，溶劑用量越多原料顆粒周圍濃度越低，細(xì)胞壁內(nèi)外濃度差越大，這樣有利于有效成分的溶出，但當(dāng)溶劑用量繼續(xù)增加時(shí)，因溶劑揮發(fā)帶來的損失會(huì)增大，導(dǎo)致提取率有所減小，故最佳提取料液比為1 g ∶[KG-3]20 mL。

2.1.4不同提取時(shí)間對(duì)迷迭香中抗氧化物提取效果的影響稱1.0 g迷迭香粉在20 mL 50%乙醇溶液中，溫度為40 ℃的條件下，依次在0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0 h的時(shí)間下進(jìn)行超聲提取，測(cè)定其抗氧化能力，隨著時(shí)間延長，提取液的抗氧化率有所增加。隨著時(shí)間的延長，一方面，抗氧化物浸出率增加；另一方面，抗氧化物被氧化的程度也相應(yīng)增加。綜合考慮，提取效果較佳的時(shí)間為1.0 h（圖5）。

2.1.5不同提取溫度對(duì)迷迭香中抗氧化物提取效果的影響稱迷迭香粉1.0 g，于20 mL提取液濃度為50%的乙醇溶液、提取時(shí)間為1 h條件下，依次在溫度為30、40、50、60、70、80、90 ℃下進(jìn)行提取，提取效果隨著溫度的增加，也有小幅度的上升趨勢(shì)， 但是，提取溫度升高，不僅會(huì)影響活性成分的穩(wěn)

通過分析表明，4因素對(duì)抗氧化率的影響順序?yàn)樘崛囟?gt;料液比>提取時(shí)間>乙醇溶液濃度。最佳的提取工藝條件是提取溫度為40 ℃，料液比 1 g ∶[KG-3]22 mL，提取時(shí)間為1.0 h，提取劑為50%乙醇。

根據(jù)正交試驗(yàn)中的最佳提取條件，稱1.0 g取3份迷迭香樣品，分別加入22 mL的50%乙醇，并在溫度為40 ℃下，超聲輔助提取1.0 h得到迷迭香提取液，分別測(cè)定每克清除率為90.15%、93.0%、91.45%。即平均每克清除率 91.53%，驗(yàn)證了正交試驗(yàn)的結(jié)果是可靠的。

2.3抑菌試驗(yàn)

2.3.1抑菌活性圖7是迷迭香提取液對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌抑菌活性情況，試驗(yàn)結(jié)果表明迷迭香提取液對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌有抑菌作用，抑菌圈的平均大小分別為19.6、20.9 mm。對(duì)比抑菌圈的大小可以得出，迷迭香提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用高于對(duì)大腸桿菌的抑制作用。

3結(jié)論

通過超聲提取法對(duì)迷迭香中的抗氧化活性物質(zhì)進(jìn)行提取，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，考查了不同因素（如提取劑濃度、提取溫度、提取時(shí)間、料液比等）對(duì)迷迭香抗氧化成分提取效果的影響，其影響主次為提取溫度>料液比>提取時(shí)間>提取溶劑。確定了迷迭香中的抗氧化活性物質(zhì)的最佳提取工藝條件為提取溶劑50%乙醇，料液比1 g ∶[KG-3]22 mL，提取時(shí)間10 h，溫度40 ℃。

此外，采用濾紙片法，研究了迷迭香提取物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌作用，研究結(jié)果顯示迷迭香活性提取物對(duì)上述2種細(xì)菌皆有良好的抑菌效果，其抑菌圈大小分別為大腸桿菌19.6 mm、金黃色葡萄球菌20.9 mm；最低抑菌濃度分別為大腸桿菌0.782 mg/mL、金黃色葡萄球菌0.391 mg/mL。

參考文獻(xiàn)：

[1]屠鵬飛，徐占輝，鄭家通，等. 新型資源植物迷迭香的化學(xué)成分及其應(yīng)用[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，1998，10（3）：62-68.

[2]程偉賢，陳鴻雁，張義平，等. 迷迭香化學(xué)成分研究[J]. 中草藥，2005，36（11）：1622-1624.[HJ1.85mm]

[3]吳建章，郁建平，趙東亮. 迷迭香酸的研究進(jìn)展[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2005，17（3）：383-388.

[4]吳建章，郁建平，艾長春，等. 迷迭香中微量元素與黃酮類化合物的含量分析[J]. 光譜實(shí)驗(yàn)室，2008，25（4）：627-629.

[5]張沖，馮玉紅，周雪晴，等. 迷迭香揮發(fā)油成分分析[J]. 海南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2008，26（1）：74-77.

[6]韓文瑜，何昭陽，劉玉斌. 病原細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)[M]. 長春：吉林科學(xué)技術(shù)出版社，1992.

[7]嚴(yán)敏，李琦，顧國賢. 利用DPPH自由基清除率評(píng)價(jià)啤酒內(nèi)源性抗氧化能力[J]. 食品工業(yè)科技，2005，26（8）：82-84.