楊志廣 李寧寧 張旭亮 孔輝華 郭 達(dá) 劉亞麗

(河南省周口師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院 466001)

細(xì)胞內(nèi)pH在生命體系許多生理過(guò)程中扮演著重要角色，包括細(xì)胞的代謝、生長(zhǎng)、增殖、凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及離子轉(zhuǎn)運(yùn)等。研究發(fā)現(xiàn)，pH值的微小變化就有可能導(dǎo)致細(xì)胞功能紊亂，如引起癌癥、腎衰竭、肺病、阿爾茨海默病等疾病。因此，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)pH的動(dòng)態(tài)變化對(duì)于研究細(xì)胞的生理和病理過(guò)程具有十分重要的意義。熒光探針?lè)ㄒ蚓哂胁僮骱?jiǎn)便、靈敏度高、選擇性好以及對(duì)細(xì)胞無(wú)損傷等特點(diǎn)，在檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)pH變化中得到了廣泛的應(yīng)用。pH熒光探針主要是通過(guò)識(shí)別基團(tuán)的質(zhì)子化或去質(zhì)子化來(lái)改變探針?lè)肿拥臒晒庑盘?hào)而實(shí)現(xiàn)pH響應(yīng)的一類(lèi)物質(zhì)，大體可分為兩類(lèi)：一類(lèi)是pH在6.80～7.40范圍內(nèi)靈敏響應(yīng)的細(xì)胞質(zhì)探針；另一類(lèi)是pH在4.50～6.00范圍內(nèi)靈敏響應(yīng)的酸性細(xì)胞器探針，如溶酶體探針。與傳統(tǒng)的單光子熒光探針相比，雙光子熒光探針具有近紅外光激發(fā)、光毒性小和光漂白、自發(fā)熒光干擾弱以及組織穿透深度大等優(yōu)點(diǎn)。特別是雙光子共聚焦成像在細(xì)胞中能夠延長(zhǎng)活細(xì)胞和組織的觀察時(shí)間[1～3]，這一獨(dú)特優(yōu)勢(shì)使得雙光子熒光探針技術(shù)在生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有強(qiáng)大的發(fā)展?jié)摿蛷V闊的應(yīng)用前景。本文介紹了有機(jī)雙光子吸收的基本原理以及近年有機(jī)雙光子pH熒光探針的研究現(xiàn)狀，同時(shí)對(duì)有機(jī)雙光子pH熒光探針未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了展望。

1 雙光子吸收基本原理

眾所周知，單光子吸收一般是利用紫外或可見(jiàn)光激發(fā)熒光分子，只有當(dāng)吸收的一個(gè)光子的能量與基態(tài)和激發(fā)態(tài)之間的能量差相匹配時(shí)才會(huì)發(fā)生。而雙光子吸收是指在脈沖激光等強(qiáng)光激發(fā)下，在較短的時(shí)間內(nèi)，經(jīng)過(guò)一個(gè)中間虛擬態(tài)，介質(zhì)分子同時(shí)或者先后吸收兩個(gè)相同或者不同頻率的光子，從基態(tài)向激發(fā)態(tài)躍遷的過(guò)程。與傳統(tǒng)的單光子吸收線性過(guò)程相比，雙光子吸收強(qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)度的平方成正比，是一個(gè)非線性過(guò)程。另外，雙光子吸收為長(zhǎng)波激發(fā)(700～1100 nm)短波發(fā)射，光損傷、光漂白、光毒性都較小，自發(fā)熒光干擾弱，而單光子吸收為短波激發(fā)(≤400 nm)長(zhǎng)波發(fā)射，容易造成光損傷、光漂白和背景顏色的干擾。因此，雙光子吸收在生物醫(yī)學(xué)、材料、信息等多領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

2 有機(jī)雙光子pH熒光探針研究現(xiàn)狀

目前文獻(xiàn)報(bào)道的有機(jī)pH熒光探針多數(shù)為單光子熒光探針。有關(guān)雙光子pH熒光探針的報(bào)道相對(duì)較少，特別能夠?qū)崟r(shí)成像活細(xì)胞內(nèi)pH值動(dòng)態(tài)變化的雙光子熒光探針更少。Park等[4]設(shè)計(jì)合成了一個(gè)比率雙光子pH熒光探針NP1。該探針雙光子活性吸收截面大，光穩(wěn)定性好，生物毒性低，能夠進(jìn)入活細(xì)胞，并能深入人體胃和食管組織90～180 μm處進(jìn)行雙光子熒光比率成像，為各種人體組織中pH的檢測(cè)與非糜爛性反流病的診斷提供了強(qiáng)有力的幫助。Kong等[5]首次報(bào)道了基于以碳點(diǎn)(C-Dot)為基礎(chǔ)的無(wú)機(jī)-有機(jī)納米復(fù)合體系雙光子pH熒光探針CD-TPY。該探針靈敏度高，選擇性好，檢測(cè)pH值范圍寬，具有低毒性、光穩(wěn)定性好、良好的生物相容性和細(xì)胞通透性，能夠成功應(yīng)用于活細(xì)胞生理pH值以及活組織深度達(dá)65～185 μm的雙光子生物熒光成像，為未來(lái)以碳點(diǎn)為基礎(chǔ)進(jìn)行設(shè)計(jì)合成檢測(cè)生物體內(nèi)金屬離子、蛋白質(zhì)、DNA和其他的生物相關(guān)分析物的雙光子熒光探針提供了新思路和方法。

Kim等[6]報(bào)道了一系列基于苯并咪唑衍生物檢測(cè)酸性pH的雙光子比率熒光探針BH(BH1-3和BH1L)。研究表明，這些探針具有細(xì)胞加載方便、毒性低、光穩(wěn)定好等特點(diǎn)，當(dāng)酸度指數(shù)(pKa)值在4.9～6.1時(shí)范圍時(shí)，具有較強(qiáng)的雙光子激發(fā)熒光，熒光顏色從藍(lán)色向綠色轉(zhuǎn)變，同時(shí)出現(xiàn)一個(gè)明顯的等發(fā)射點(diǎn)，可以定量分析細(xì)胞內(nèi)pH的變化。利用雙光子熒光顯微技術(shù)，探針BH1L還可以直接實(shí)時(shí)地觀測(cè)活細(xì)胞內(nèi)和活老鼠大腦組織中溶酶體隔室的pH變化情況。這些研究成果證實(shí)，BH系列探針在生物醫(yī)學(xué)研究中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

Wang等[7]設(shè)計(jì)合成了一個(gè)用于活細(xì)胞和活組織成像并能定量測(cè)量活細(xì)胞內(nèi)pH的雙光子比率熒光探針CBT 。該探針擁有大的雙光子吸收截面、低毒性、較高的光學(xué)穩(wěn)定性、良好的細(xì)胞膜穿透性和優(yōu)良的生物相容性等特點(diǎn)，成功地實(shí)現(xiàn)了在HeLa細(xì)胞內(nèi)H+的雙光子熒光比率成像。同時(shí)該探針還可應(yīng)用于大鼠肝臟活組織切片的雙光子熒光顯微成像，成像深度可達(dá)66 μm，為進(jìn)一步的生物細(xì)胞病理研究和臨床應(yīng)用提供了有力的支持。

Mao等[8]設(shè)計(jì)合成了首個(gè)利用激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移(ESIPT)和分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT) 雙重響應(yīng)機(jī)理檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)pH變化的多色雙光子熒光探針BNO。研究表明，由于ESIPT效應(yīng)，該探針在中性和弱堿性環(huán)境中無(wú)熒光，一旦在酸性和強(qiáng)堿性環(huán)境中，熒光迅速增強(qiáng)，同時(shí)發(fā)射不同顏色的熒光(酸性環(huán)境顯示綠色，堿性環(huán)境顯示青色)。此外，該探針具有pH值響應(yīng)范圍寬、靈敏度高、選擇性好、光穩(wěn)定好、探針毒性低等特點(diǎn)，成功實(shí)現(xiàn)了跟蹤細(xì)胞內(nèi)pH的動(dòng)態(tài)變化和雙光子熒光顯微成像。

Sarkar等[9]以三苯基季磷鹽陽(yáng)離子為線粒體識(shí)別基團(tuán)成功開(kāi)發(fā)了一個(gè)能夠定量成像活細(xì)胞和活組織線粒體內(nèi)pH變化的雙光子比率熒光探針CMP1。該探針具有細(xì)胞加載方便、選擇性好、細(xì)胞毒性低、較強(qiáng)的線粒體定位能力等優(yōu)點(diǎn)，當(dāng)pH在6.0～9.0范圍變化時(shí)，熒光發(fā)生從黃色到紅色的顏色變化，實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞中線粒體內(nèi)pH的雙光子比率熒光成像。而成像結(jié)果表明細(xì)胞線粒體內(nèi)pH分布存在異質(zhì)性，細(xì)胞核處的線粒體內(nèi)pH高于細(xì)胞外圍的線粒體，該探針為在生物醫(yī)學(xué)中研究線粒體內(nèi)pH變化提供了一個(gè)強(qiáng)有力的工具。

Chen等[10]基于 A-π-D-π-A共軛體系設(shè)計(jì)合成了兩個(gè)專(zhuān)一性檢測(cè)活細(xì)胞中pH變化的雙光子比率熒光探針L1和L2。探針L1和L2具有靈敏度高、熒光量子產(chǎn)率高、雙光子吸收截面大、細(xì)胞毒性低以及生物相容性好等特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞中pH變化的雙光子比率熒光成像，為重要的生物過(guò)程研究提供了一種有效的工具。

Dong等[11]首次報(bào)道了一個(gè)標(biāo)記腫瘤細(xì)胞中溶酶體pH變化的雙光子熒光探針BN-lys。該探針在正常細(xì)胞中熒光較弱，而對(duì)腫瘤細(xì)胞中溶酶體pH表現(xiàn)出了較強(qiáng)的單-雙光子熒光響應(yīng)活性，具有靈敏度高、響應(yīng)速度快、生物毒性低、優(yōu)異的光穩(wěn)定性和可逆性等特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞中溶酶體pH變化的雙光子熒光成像，有望在生物研究中具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3 展望

綜上所述，目前有機(jī)單光子pH熒光探針已有很多報(bào)道，而雙光子pH熒光探針報(bào)道相對(duì)較少，雖然取得了一定的發(fā)展，但仍存在一些問(wèn)題，主要表現(xiàn)為以下幾個(gè)方面：①進(jìn)一步探索合成雙光子pH熒光探針的新方法和種類(lèi)，尋找大雙光子吸收截面、高熒光量子產(chǎn)率及大Stokes位移的有機(jī)雙光子pH熒光探針具有重要的研究意義；②開(kāi)發(fā)生物透膜性好、生物相溶性好、能夠?qū)罴?xì)胞和深層組織成像(尤其對(duì)細(xì)胞器內(nèi)pH變化)的有機(jī)雙光子pH熒光探針是人們未來(lái)的一個(gè)研究重點(diǎn)；③發(fā)展毒性很低甚至無(wú)毒，實(shí)現(xiàn)多種活體細(xì)胞內(nèi)比率熒光成像的雙光子pH熒光探針是一個(gè)重要的發(fā)展方向?？傊?，有機(jī)雙光子pH熒光探針在生物、化學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)等方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。