代謝物生物傳感器：微生物細胞工廠構(gòu)建中的合成生物學(xué)工具

周益康 吳亦楠 王天民 鄭翔 邢新會 張翀（清華大學(xué)化學(xué)工程系 教育部工業(yè)生物催化重點實驗室 清華大學(xué)合成與系統(tǒng)生物學(xué)研究中心，北京 100084）

代謝物生物傳感器：微生物細胞工廠構(gòu)建中的合成生物學(xué)工具

周益康 吳亦楠 王天民 鄭翔 邢新會 張翀
（清華大學(xué)化學(xué)工程系 教育部工業(yè)生物催化重點實驗室 清華大學(xué)合成與系統(tǒng)生物學(xué)研究中心，北京 100084）

代謝物生物傳感器作為重要的合成生物學(xué)工具，能夠感應(yīng)細胞內(nèi)代謝物濃度的變化，轉(zhuǎn)化為特定信號輸出，在微生物細胞工廠的構(gòu)建中顯現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。其主要組成部分通常包括生物識別元件和信號輸出元件，前者來源于自然界中豐富的調(diào)控元件，如轉(zhuǎn)錄因子、核糖開關(guān)等，有著不同的響應(yīng)機理，后者可以為熒光信號、生長優(yōu)勢、特定代謝通路的開閉等，取決于應(yīng)用所需。著重介紹了近年來代謝物生物傳感器在微生物細胞工廠構(gòu)建中的應(yīng)用實例，主要包括目標化合物菌株的高通量篩選、選擇、胞內(nèi)代謝動態(tài)調(diào)控和非遺傳異質(zhì)性選擇，同時也著重討論了代謝物生物傳感器的性能對于應(yīng)用的影響和在實際應(yīng)用中可能面臨的機遇與挑戰(zhàn)。

代謝物生物傳感器；響應(yīng)機理；響應(yīng)性能；微生物細胞工廠

生物體內(nèi)廣泛存在一類基因編碼的蛋白質(zhì)或RNA元件（例如轉(zhuǎn)錄因子、核糖體開關(guān)），它們能夠響應(yīng)細胞內(nèi)特定代謝物效應(yīng)物的濃度，通過改變自身結(jié)構(gòu)調(diào)控下游基因元件特定信號的輸出。代謝物生物傳感器就是基于這一原理，通過特定的生物識別元件響應(yīng)目標代謝物化合物，并將其轉(zhuǎn)化為目的輸出信號（如熒光、細胞的存活、特定代謝通路的開閉）［1］。

代謝物生物傳感器作為一種重要的合成生物學(xué)工具，可以視作微生物中的儀表，將代謝物濃度轉(zhuǎn)化為特定信號的輸出，因而能夠在線的感應(yīng)細胞體內(nèi)代謝物濃度及其變化，為代謝途徑設(shè)計及優(yōu)化提供工具。近年來，研究者逐漸嘗試將代謝物生物傳感器應(yīng)用到微生物細胞工廠的構(gòu)建領(lǐng)域，由于其能在單細胞層次實現(xiàn)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的濃度響應(yīng)，在微生物細胞工廠的改造和優(yōu)化中日益顯現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。目前已經(jīng)有相關(guān)綜述論述了代謝物生物傳感器的原理和應(yīng)用［2-6］，本文將著重綜述近年來代謝物生物傳感器在微生物細胞工廠構(gòu)建中的應(yīng)用實例及其存在的挑戰(zhàn)。

1 代謝物生物傳感器構(gòu)建原理

代謝物生物傳感器的主要組成部分包括生物識別元件和信號輸出元件，前者能夠響應(yīng)特定的代謝物造成自身結(jié)構(gòu)變化，后者將響應(yīng)元件結(jié)構(gòu)變化信號轉(zhuǎn)化為目的輸出信號。自然界中存在豐富的響應(yīng)機理不同的生物識別元件，其中轉(zhuǎn)錄因子（Transcription factors，TFs）和核糖開關(guān)是目前最常見的生物識別元件。

1.1 基于轉(zhuǎn)錄（激活、抑制）因子的代謝物生物傳感器

轉(zhuǎn)錄因子能夠結(jié)合在調(diào)控基因DNA的增強子或啟動子區(qū)域，獨自或與其它蛋白組成復(fù)合體，通過促進或阻止RNA聚合酶對于特定基因的結(jié)合，進而調(diào)控DNA到信使RNA的轉(zhuǎn)錄速率［7］。轉(zhuǎn)錄因子特異的與目標代謝物結(jié)合，發(fā)生別構(gòu)作用，對基因的調(diào)控作用發(fā)生變化，如轉(zhuǎn)錄抑制因子結(jié)合代謝物后對RNA聚合酶的空間位阻效應(yīng)消失。利用轉(zhuǎn)錄因子的這一特性，將目標代謝物濃度轉(zhuǎn)化為熒光蛋白、細胞存活等輸出信號，從而構(gòu)建出響應(yīng)目標代謝物的生物傳感器（圖1-A）。

轉(zhuǎn)錄因子在生物體內(nèi)廣泛存在，以大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）為例，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了超過230種轉(zhuǎn)錄因子，響應(yīng)的代謝物包括糖類、糖磷酸、氨基酸和脂類等［8］。隨著生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)有一些調(diào)控相互作用和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的數(shù)據(jù)庫，如Regulon DB、RegTransBase等。其中RegTransBase數(shù)據(jù)庫提供了原核生物轉(zhuǎn)錄因子，其結(jié)合位點以及小分子效應(yīng)物的信息，涵蓋了875個效應(yīng)物，1 488個轉(zhuǎn)錄因子，為轉(zhuǎn)錄因子的應(yīng)用奠定了堅實的基礎(chǔ)。目前研究者利用天然轉(zhuǎn)錄因子，已開發(fā)了不同的生物傳感器，可以響應(yīng)木糖［9］、1-丁醇［10］、支鏈氨基酸［11，12］、堿性氨基酸［8，13］、酪氨酸［14］、葡糖糖酸、柚皮素［15］以及乙酰輔酶A［16］、丙二酰輔酶A［17］、NADPH［18］等代謝物。

盡管天然存在的轉(zhuǎn)錄因子能夠響應(yīng)許多不同種類的小分子代謝物，但是在實際應(yīng)用中，目標代謝物往往不存在天然響應(yīng)或者響應(yīng)性能不理想的轉(zhuǎn)錄因子，通過工程化改造的手段能夠改變轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)的特異性。例如，來自于E.coli的能夠天然響應(yīng)L-阿拉伯糖的轉(zhuǎn)錄因子AraC已經(jīng)被改造為能夠特異性響應(yīng)D-阿拉伯糖［19］、甲羥戊酸［20］、三乙酸內(nèi)酯（TAL）［21，22］和四氫嘧啶［23］，為基于轉(zhuǎn)錄因子的代謝物生物傳感器的應(yīng)用提供了更多的潛力。此外，通過對傳感器元件的改造，還可實現(xiàn)傳感器的跨種屬應(yīng)用。例如，來源于E.coli的甲羥戊酸傳感器通過改造已經(jīng)成功應(yīng)用于扭脫甲基桿菌（Methylobacterium extorquens，M. extorquens）AM1中，實現(xiàn)對甲羥戊酸的響應(yīng)［24］。

1.2 基于核糖開關(guān)的代謝物生物傳感器

核糖開關(guān)是一類在mRNA的前導(dǎo)區(qū)中被發(fā)現(xiàn)的cis-編碼的調(diào)控RNAs，它們能夠在對應(yīng)的效應(yīng)物存在或不存在的情況下發(fā)生形變［25］。一般地，核糖開關(guān)通過在對應(yīng)配體存在時，采用能夠誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄終止或者抑制翻譯起始結(jié)構(gòu)構(gòu)象，在對應(yīng)配體不存在時，采用能夠使得轉(zhuǎn)錄延長或翻譯開始的替代構(gòu)象來控制下游基因的表達［26］。利用這種機制，將下游基因設(shè)計為易于檢測的輸出信號，同樣能夠構(gòu)建代謝物生物傳感器（圖1-B）。

目前為止，已經(jīng)有至少19個不同的效應(yīng)物-結(jié)合核糖開關(guān)種類被鑒定［27］，核糖開關(guān)能夠結(jié)合的效應(yīng)物包括一些重要的代謝物，如葡糖-6-磷酸［28］、賴氨酸［29］和甘氨酸［30］，輔酶因子［31-35］如維生素B12，S-腺苷甲硫氨酸（S-Adenosyl-L-methionine，SAM）、硫胺素焦磷酸、黃素單核苷酸（Flavin mononucleotide，F(xiàn)MN），以及鎂離子［36］、氟離子［37］等?；诤颂情_關(guān)的特性，許多研究組致力于發(fā)展基于核糖開關(guān)的代謝物生物傳感器［38-40］，例如通過將維生素B12的核糖開關(guān)與報告基因β-半乳糖苷酶，熒光素酶或者紅色熒光蛋白相結(jié)合，研究維生素B12的代謝轉(zhuǎn)運機理［41］。此外，還有基于適體酶核糖開關(guān)設(shè)計的代謝物生物傳感器［42］，適體酶能夠利用配體來控制錘頭狀核酶，進而控制mRNA轉(zhuǎn)錄的穩(wěn)定性或翻譯的可行性。

盡管基于核糖開關(guān)的代謝物生物傳感器潛力巨大，但是在代謝工程中的應(yīng)用仍舊受到限制［43］，主要原因是能夠響應(yīng)目標代謝物的核酸適配體缺乏以及核酸適配體與驅(qū)動區(qū)域的連接研究不充分［5］。近年來隨著合成生物學(xué)的迅速發(fā)展，已經(jīng)出現(xiàn)了一些能夠輔助設(shè)計核糖開關(guān)的工具［44］，將有可能極大促進基于核糖開關(guān)的代謝物生物傳感器在代謝工程中的應(yīng)用。

圖1 代謝物生物傳感器響應(yīng)機制

1.3 其他類型的代謝物生物傳感器

除了轉(zhuǎn)錄因子與核糖開關(guān)外，其他的能夠響應(yīng)特定代謝物的生物識別元件也被應(yīng)用于代謝物生物傳感器的設(shè)計。例如，壓力響應(yīng)的啟動子［45-47］，核糖體干擾肽［48］，能夠發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）的代謝物-感應(yīng)蛋白［49，50］等。這些生物識別元件的挖掘?qū)⒂辛Φ赝苿哟x物生物傳感器在代謝工程中的應(yīng)用。

2 代謝物生物傳感器的性能評價

代謝物生物傳感器的響應(yīng)性能決定了其能否在微生物細胞工廠構(gòu)建中實際發(fā)揮作用。其性能評價的主要依據(jù)是輸入輸出響應(yīng)曲線（圖2），代謝物濃度與生物傳感器響應(yīng)輸出（Arbitrary reporter units，AU）之間的關(guān)系刻畫了生物傳感器的轉(zhuǎn)換函數(shù)，提供了生物傳感器的性能信息，包括靈敏度（Sensitivity）、響應(yīng)范圍、線性檢測范圍、檢測閾值等信息，為實際應(yīng)用提供參考［51］。其中靈敏度表示響應(yīng)曲線的斜率，描述了在兩個樣品輸入產(chǎn)物濃度之間的最小的可微變化。響應(yīng)范圍表示代謝物生物傳感器輸出信號在最高上限和背景狀態(tài)之間的差異。線性檢測范圍表示代謝物濃度能夠與輸出表達信號線性相關(guān)聯(lián)的范圍。轉(zhuǎn)化函數(shù)表示代謝物生物傳感器輸入和輸出之間的數(shù)學(xué)關(guān)系。

圖2 代謝物生物傳感器響應(yīng)曲線

代謝物生物傳感器響應(yīng)效應(yīng)物的靈敏度和特異性是其在應(yīng)用過程中重點關(guān)注的性能，因而在實際應(yīng)用中，需要首先測定生物傳感器的響應(yīng)曲線，以確定其能否滿足應(yīng)用需求。實際操作中，往往通過外源添加目標代謝物的方法來測定響應(yīng)曲線，但是由于細胞膜具有選擇透過性，代謝物可能通過主動運輸進入細胞，使得胞內(nèi)與胞外代謝物濃度并不一定線性相關(guān)，因而需要測定胞內(nèi)代謝物的濃度。

3 代謝物生物傳感器在微生物細胞工廠中的應(yīng)用

代謝物生物傳感器在微生物細胞工廠中典型的應(yīng)用包括高產(chǎn)目標化合物菌株的高通量篩選和微生物胞內(nèi)代謝動態(tài)調(diào)控（Dynamic control）等［5］。例如代謝物生物傳感器可以在單細胞水平上將代謝物化合物濃度轉(zhuǎn)化為熒光輸出或者細胞生長優(yōu)勢，進而通過高通量的流式細胞儀（Fluorescence activated cell sorting，F(xiàn)ACS）或者細胞優(yōu)勢表型壓力選擇，實現(xiàn)對特定高產(chǎn)菌株的高通量篩選（Screen）或者選擇（Selection）。在代謝動態(tài)調(diào)控方面，利用人工構(gòu)建的代謝物生物傳感器模擬微生物原有的精細調(diào)控體系，實現(xiàn)目的代謝途徑根據(jù)效應(yīng)物的濃度動態(tài)開閉，可以幫助微生物體內(nèi)的代謝流實時響應(yīng)宿主細胞的代謝狀態(tài)或者宿主所處的外部環(huán)境的變化，使代謝網(wǎng)絡(luò)有更強的魯棒性和更高的生產(chǎn)效率。此外，近期有報道利用代謝物生物傳感器實現(xiàn)非遺傳細胞間異質(zhì)性選擇（Nongenetic selection），提高代謝途徑的生物合成。

3.1 高通量篩選

生物體系的復(fù)雜性使得工程化改造菌株往往需要通過多輪設(shè)計-構(gòu)造-檢驗循環(huán)（Design-Build-Test cycle，DBT循環(huán)）才能夠找到基因元件的最優(yōu)組合。DBT循環(huán)的通量決定了菌株優(yōu)化所需要的時間。近年來，隨著合成生物技術(shù)的發(fā)展，設(shè)計和構(gòu)建的通量迅速提高，已經(jīng)能夠構(gòu)建庫容超過109的多樣性庫，但是目前檢驗的通量仍舊限制在102/d或103/d的水平，極大地限制了DBT循環(huán)的通量［52］。代謝物生物傳感器能夠在單細胞水平將效應(yīng)物濃度轉(zhuǎn)化為熒光輸出，結(jié)合FACS技術(shù)（圖3-A），篩選的通量能夠達到109細胞/d，使得DBT循環(huán)的通量提高106倍。

代謝物傳感器在目的產(chǎn)物高通量篩選領(lǐng)域的應(yīng)用最早報道于2012年，基于來源于谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum，C. glutamicum）的能夠響應(yīng)精氨酸、組氨酸和賴氨酸的轉(zhuǎn)錄因子LysG，以及其對應(yīng)的啟動子lysE，以黃色熒光蛋白（Yellow fluorescent protein，YFP）作為輸出信號，構(gòu)建的代謝物生物傳感器被應(yīng)用于在化學(xué)誘變微生物突變庫中篩選賴氨酸高產(chǎn)菌株［8］。這一傳感器隨后也被用于篩選合成途徑中酶的突變體，消除了原有的反饋抑制作用，提高了對應(yīng)氨基酸的積累量［13］。另一個同樣來源于C. glutamicum的轉(zhuǎn)錄因子Lrp能夠響應(yīng)包括纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸在內(nèi)的支鏈氨基酸，也被應(yīng)用于優(yōu)化C. glutamicum中氨基酸的生產(chǎn)［11，12］。高通量篩選系統(tǒng)同樣可以應(yīng)用于對酶的進化?；诜宇愄禺愋皂憫?yīng)的轉(zhuǎn)錄激活子DmpR在E.coli中構(gòu)建的高通量篩選有機磷酸酯降解酶活性的篩選系統(tǒng)，在3輪突變和FACS篩選后，分離出了發(fā)生3個氨基酸替換的突變體MPH，kcat/Km提高100倍［53，54］。

代謝物生物傳感器結(jié)合高通量篩選的技術(shù)能夠輔助微生物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的工程化改造（Sensor-assisted transcriptional regulator engineering，SATRE）。本文作者團隊在M. extorquens AM1中成功應(yīng)用這一策略，利用工程化改造后能夠響應(yīng)甲羥戊酸的生物傳感器，結(jié)合FACS手段，實現(xiàn)了M. extorquens AM1中代謝流的再分配，將來源于甲醇的乙酰輔酶A更多的導(dǎo)向甲羥戊酸合成，使得其產(chǎn)量提高60%［24］。

來源于細菌的轉(zhuǎn)錄因子通過改造也能夠應(yīng)用于真核細胞中，例如來源于細菌的響應(yīng)木糖的轉(zhuǎn)錄因子XylR被改造為能夠在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，S. cerevisiae）中響應(yīng)木糖的基因元件［9］。研究者優(yōu)化了多種來源的XylR抑制子和操縱子在報告基因上游區(qū)域的插入位點，利用優(yōu)化后的生物傳感器進行木糖轉(zhuǎn)運蛋白的改造，將該蛋白的轉(zhuǎn)運效率提高了6.5倍。

除了可以應(yīng)用目標化合物直接作為效應(yīng)物應(yīng)用于基因表達調(diào)控，目標化合物的前體或者指示劑也能夠作為效應(yīng)物。還原反應(yīng)是細胞代謝過程的核心，大約1/4的已知酶為氧化還原酶，其中大多數(shù)為NADPH依賴型［55］。在E.coli內(nèi)能夠間接響應(yīng)胞內(nèi)NADPH/NADP+的比例的轉(zhuǎn)錄因子SoxR被應(yīng)用于NADPH依賴的酶的高通量改造［16］。將色氨酸作為紫色桿菌素合成途徑中的重要節(jié)點，本文作者團隊開發(fā)了基于色氨酸新生肽tnaC的新型生物傳感器，利用正向熒光信號篩選色氨酸高產(chǎn)菌株，進一步利用負向熒光信號篩選消耗色氨酸的高效下游途徑，進而成功構(gòu)建了從葡萄糖合成色氨酸及高產(chǎn)下游衍生物的E.coli工程菌［48］。來源于枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，B. subtilis）的特異性響應(yīng)丙二酰輔酶A的轉(zhuǎn)錄因子FapR和操縱子fapO已經(jīng)成為途徑工程中的重要工具，在E.coli［56，57］與S. cerevisiae［17］中都得到了成功應(yīng)用。此外通過報告菌株將目標產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為可檢測的信號的雙菌篩選系統(tǒng)為高通量檢測工業(yè)上全細胞催化菌株分泌代謝物的產(chǎn)量提供了可行性［58］。作為概念驗證，研究者利用E.coli將B. subtilis生產(chǎn)的維生素B2轉(zhuǎn)化為FMN，利用能夠特異性響應(yīng)FMN的核糖開關(guān)調(diào)控輸出信號綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）的表達，提高了在B. subtilis中維生素B2的合成。

通過人為設(shè)計條件，模擬自然進化的機制，使得不同基因型的菌株之間存在生長差異，使得具有生長優(yōu)勢的突變體在培養(yǎng)過程中富集，進而得到理想表型的過程稱為選擇。若代謝物生物傳感器的輸出信號為與生長相關(guān)的基因，能夠?qū)崿F(xiàn)代謝物產(chǎn)量與菌株生長優(yōu)勢相關(guān)聯(lián)（圖3-B），實現(xiàn)通量1010細胞/輪的篩選。

2013年報道了在E.coli中開發(fā)的1-丁醇生物傳感器/生長選擇體系［10］。四環(huán)素外排泵TetA的表達受到來源于丁香假單胞菌（Pseudomonas butanovora，P. butanovora）特異性響應(yīng)乙醇的轉(zhuǎn)錄因子BmoR調(diào)控，從而使的1-丁醇的產(chǎn)量與菌株在四環(huán)素中的生長情況相關(guān)聯(lián)。該體系應(yīng)用于篩選丁醇合成途徑上游基因的RBS序列優(yōu)化的突變體，成功提高了丁醇的產(chǎn)量。另一個成功的案例是2014年報道的結(jié)合多重自動基因工程（Multiplex genome engineering，MAGE）和代謝物生物傳感器進行定向進化。來源于惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida，P. putida）的抑制蛋白TtgR在結(jié)合包含柚皮素在內(nèi)的黃酮類化合物時產(chǎn)生去除抑制效果，利用該機制可構(gòu)建柚皮素生物傳感器。研究者結(jié)合該生物傳感器，并利用TolC外膜孔蛋白作為選擇標記，實現(xiàn)在十二烷基硫酸鈉存在時正向篩選，在E.coli毒素E1存在時反向篩選［15］。在4輪MAGE靶向突變和篩選后，獲得了柚皮素產(chǎn)量提高36倍的菌株。相同的策略應(yīng)用于葡萄糖二酸合成途徑中，基于特異性響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子CdaR，葡萄糖二酸的產(chǎn)量提高22倍。核糖開關(guān)同樣能夠應(yīng)用于菌株進化。在E. coli 中，應(yīng)用賴氨酸-OFF核糖開關(guān)將賴氨酸生產(chǎn)與菌株生長相關(guān)聯(lián)。在賴氨酸存在時，該核糖開關(guān)能夠抑制下游tetA基因的表達，而TetA對Ni2+敏感，使得在Ni2+存在時，高產(chǎn)賴氨酸的突變菌株具有生長優(yōu)勢，進而產(chǎn)生富集［59］。

除了E.coli，將代謝物生物傳感器與影響微生物生長的基因相耦合的策略同樣能夠應(yīng)用于S. cerevisiae中。結(jié)合來源于E.coli的轉(zhuǎn)錄因子MetJ和其對應(yīng)的操縱子metO，在S. cerevisiae中構(gòu)建了SAM的生物傳感器［60］。通過融合MetJ和轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域B42，并將metO放置在報告基因上游，MetJ-B42混合體在S. cerevisiae中成為一個SAM誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活子。為了更好地調(diào)制報告基因，研究者構(gòu)建了雙輸入元件，報告基因受到TetR的調(diào)控。選用his3和leu2作為缺陷型報告信號，篩選了S. cerevisiae基因組突變庫，鑒定出目標基因GAL11能夠?qū)AM產(chǎn)量提高7倍。

3.3 動態(tài)調(diào)控

代謝工程中，最大程度的表達生物合成途徑中相應(yīng)的酶通常不能夠獲得最高產(chǎn)量，這是由于酶和途徑的過表達會給細胞帶來代謝壓力，導(dǎo)致途徑中的有毒中間產(chǎn)物積累，或者使得重要代謝物的缺乏影響細胞生長。雖然目前已經(jīng)有一些有效的優(yōu)化途徑基因表達的策略，如優(yōu)化啟動子強度，核糖體結(jié)合位點強度，酶的降解速率，以及近期發(fā)展迅速的能夠?qū)崿F(xiàn)多目標基因的調(diào)控dCas9［61］和反義-RNA［62］技術(shù)，但是這些策略大多是將表達水平控制在固定水平。利用代謝物生物傳感器響應(yīng)胞內(nèi)代謝狀態(tài)動態(tài)調(diào)控細胞內(nèi)基因的代謝水平，模擬微生物天然存在的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，能夠避免有毒代謝中間產(chǎn)物的過量積累，平衡細胞生長所需的前提供應(yīng)與目標代謝產(chǎn)物的合成（圖3-C）。

早在2000年，已經(jīng)實現(xiàn)通過能夠響應(yīng)胞內(nèi)乙酰磷酸的水平的調(diào)節(jié)因子Ntr，控制E.coli中番茄紅素合成途徑中的兩個關(guān)鍵酶基因的表達水平，使得番茄紅素產(chǎn)量提高約18倍［63］。另一個經(jīng)典的案例是利用脂肪酰輔酶-A的生物傳感器FadR動態(tài)調(diào)控脂肪酸乙酯（Fatty acid ethyl ester，F(xiàn)AEE）合成基因的表達［47］。FAEE合成包含乙醇和脂肪?；o酶A的合成反應(yīng)，而這兩個的前體物質(zhì)對于生長有毒害或抑制作用。轉(zhuǎn)錄抑制因子FadR與?；o酶A和脂肪酸都有相對較弱的親和作用。這一效應(yīng)物的偏好性順序，使得脂肪酸的積累誘導(dǎo)?；o酶A合酶的表達，隨后脂肪?；o酶A合成反過來誘導(dǎo)從丙酮酸到乙醇的合成以及蠟質(zhì)合成酶表達。這一動態(tài)調(diào)控元件避免了乙醇的過度累積，同時平衡了細胞生長和FAEE合成所需要的脂肪酸代謝流，在進一步優(yōu)化啟動子強度后，F(xiàn)AEE產(chǎn)量達到1.5 g/L，相比于沒有動態(tài)調(diào)控的對照菌株提高了3.5倍。

丙二酰輔酶A是脂肪酸合成、黃酮類化合物合成途徑中的重要前體，但是過表達丙二酰輔酶A的合成途徑乙酰輔酶A羧化酶（accABCD編碼）對細胞生長有害?；陧憫?yīng)丙二酰輔酶A的轉(zhuǎn)錄因子FapR構(gòu)建的負反饋元件，使脂肪酸合成產(chǎn)量提高了34%［56］。轉(zhuǎn)錄因子FapR通過結(jié)合在fapO上抑制基因表達，F(xiàn)apR與丙二酰輔酶A結(jié)合后，從結(jié)合位點脫離下來。隨后的研究工作進一步揭示了FapR介導(dǎo)的E.coli啟動子PGAP表達激活作用，和取決于丙二酰輔酶A的抑制作用，并采用了類似的動態(tài)調(diào)控設(shè)計，使得脂肪酸的產(chǎn)量相比于靜態(tài)表達提高了2.1倍［64］。在S. cerevisiae中應(yīng)用FapR和葡萄糖濃度響應(yīng)的啟動子PHXT1，圍繞關(guān)鍵中間產(chǎn)物丙二酰輔酶A設(shè)計得分層動態(tài)調(diào)控系統(tǒng)，使得3-羥基丙酸的產(chǎn)量提高10倍［65］。

各劑量組實驗中期及實驗結(jié)束前采尾血測定各劑量組血常規(guī)各項血液學(xué)指標（血紅蛋白、紅細胞計數(shù)、白細胞計數(shù)及其分類）。結(jié)果與對照組比較均無顯著性差異(p＞0.05)，且各項指標均在本實驗室正常值范圍內(nèi)。

核糖開關(guān)同樣被應(yīng)用于動態(tài)調(diào)控系統(tǒng)。作為概念驗證，來源于E.coli和B. subtilis的賴氨酸-OFF的核糖開關(guān)被整合在C. glutamicum染色體中g(shù)ltA基因（編碼檸檬酸合酶）上游，使得賴氨酸產(chǎn)量分別提高63%和38%［66］。為了進一步提高C. glutamicum中賴氨酸的產(chǎn)量，研究者開發(fā)了賴氨酸-ON核糖開關(guān)［67］，動態(tài)上調(diào)賴氨酸轉(zhuǎn)運蛋白（gltA）表達量。為了構(gòu)造新的核糖開關(guān)，簡并堿基被插入到賴氨酸核酸適配體與雙重選擇標記tetA上游的RBS區(qū)域。3輪正-反篩選后，成功構(gòu)建了能夠在賴氨酸存在時激活上游基因表達的核糖開關(guān)。利用這一賴氨酸-ON的核糖開關(guān)動態(tài)控制gltA表達量，賴氨酸產(chǎn)量提高了21%。

實現(xiàn)動態(tài)調(diào)控的另一重要策略在于實現(xiàn)細胞生長和目標產(chǎn)物生產(chǎn)過程的解耦。例如，利用良好表征的lux群體相應(yīng)系統(tǒng)，當E.coli細胞密度達到理想水平，動態(tài)調(diào)控代謝流從TCA循環(huán)到異丙醇合成，異丙醇產(chǎn)量提高了3倍［68］。當酰基同型絲氨酸內(nèi)酯（N-（β-ketocaproyl）-L-Homoserine lac- tone，AHL）濃度達到一定水平時，調(diào)節(jié)因子LuxR激活啟動子Plux的表達。異丙醇生產(chǎn)途徑和TetR抑制蛋白表達受到AHL-LuxR響應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控，而編碼檸檬酸合酶的gltA基因受到TetR控制。同時能夠通過控制添加的IPTG濃度和LacI蛋白表達調(diào)控LuxR開關(guān)發(fā)生時細胞濃度和AHL水平。

除了以上提到的利用轉(zhuǎn)錄因子和核糖開關(guān)構(gòu)建的代謝物生物傳感器實現(xiàn)動態(tài)調(diào)控外，壓力響應(yīng)的啟動子實現(xiàn)代謝途徑的動態(tài)調(diào)控也是重要的策略。能夠特異性響應(yīng)特定效應(yīng)物的啟動子也可以歸為代謝物生物傳感。通過轉(zhuǎn)錄組分析鑒定出了對于法尼焦磷酸（Farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP）表現(xiàn)出壓力響應(yīng)啟動的特性，利用FPP-抑制的啟動子PgadE調(diào)節(jié)FPP合成，F(xiàn)PP-激活的啟動子PrstA調(diào)節(jié)下游紫穗槐二烯的合成，相比于靜態(tài)調(diào)控轉(zhuǎn)化率提高了兩倍［69］。相似的策略應(yīng)用在S. cerevisiae中，通過下調(diào)競爭性麥角固醇合成途徑，提高了紫穗槐二烯的產(chǎn)量［46］。通過結(jié)合修飾的GAL調(diào)控系統(tǒng)和葡萄糖濃度響應(yīng)的啟動子PHXT1分別調(diào)控的鯊烯合成途徑和β-胡蘿卜素途徑，使甲羥戊酸途徑和競爭性的鯊烯途徑順序響應(yīng)葡萄糖濃度實現(xiàn)動態(tài)調(diào)控，使類胡蘿卜素產(chǎn)量達到1 156 mg/L［45］。

3.4 非遺傳細胞間異質(zhì)性選擇

在蛋白和代謝物濃度水平上，細胞間天然存在非遺傳因素導(dǎo)致的異質(zhì)性。由于細胞內(nèi)蛋白表達機器在不同細胞間存在隨機分配現(xiàn)象，在任意培養(yǎng)體系中均存細胞間差異，針對目的產(chǎn)物的生產(chǎn)，也就是存在非遺傳因素造成的高效生產(chǎn)和低效生產(chǎn)細胞［70］。由于低效的細胞消耗了營養(yǎng)卻沒有有效合成目標產(chǎn)物，非遺傳細胞異質(zhì)性的存在影響了目標代謝物的合成效率。基于轉(zhuǎn)錄因子的細胞群體控制系統(tǒng)（Population quality control，PopQC）能夠持續(xù)富集高效生產(chǎn)的細胞，降低低效生產(chǎn)細胞的比例（圖3-D），進而提高合成效率［18］。PoPQC的概念在游離脂肪酸（Free fatty acid，F(xiàn)FA）生產(chǎn)中得到驗證。高FFA濃度水平對應(yīng)于細胞內(nèi)高濃度的?；o酶A，?；o酶A與轉(zhuǎn)錄因子FadR結(jié)合后，激活下游TetA外排泵的表達，使細胞具有四環(huán)素抗性。通過PopQC富集培養(yǎng)的高產(chǎn)FFA的亞群體細胞，使得FFA的產(chǎn)量提高3倍。類似的策略應(yīng)用于E.coli，利用特異性響應(yīng)酪氨酸的TyrR轉(zhuǎn)錄因子，提高了酪氨酸生產(chǎn)。

圖3 代謝物生物傳感器在微生物細胞工廠中的應(yīng)用

以往的提高生物合成效率的策略大多忽視了非遺傳細胞異質(zhì)性差異的影響。但是，低效生產(chǎn)細胞的大量存在，特別是在工業(yè)生產(chǎn)中，不同時間尺度上微環(huán)境的差異會放大細胞異質(zhì)性的影響，確實極大地限制了合成效率。因而易于設(shè)計和應(yīng)用的PopQC若能與傳統(tǒng)優(yōu)化的策略相結(jié)合，有望成為提高合成效率，實現(xiàn)低成本合成的通用策略。

4 展望

隨著代謝工程、系統(tǒng)生物學(xué)、合成生物學(xué)的迅速發(fā)展，使得微生物能夠生產(chǎn)一系列有價值的化合物。為了實現(xiàn)包括生物燃料、藥物、大宗化學(xué)品等在內(nèi)的化合物高效生產(chǎn)，需要在細胞中構(gòu)建高效的合成途徑，提高微生物細胞工廠的產(chǎn)量（Titer）、轉(zhuǎn)化率（Yield）和生產(chǎn)速率（Productivity）。代謝物生物傳感器作為合成生物學(xué)提供的有力工具，能夠大大加快微生物細胞工廠的構(gòu)建。高通量篩選和選擇將大大提高代謝途徑設(shè)計及優(yōu)化過程中DBT循環(huán)的通量，加快構(gòu)建的速度。而利用代謝物生物傳感器實現(xiàn)宿主內(nèi)代謝途徑的動態(tài)調(diào)控將使得微生物具有更高的生產(chǎn)效率?；诖x物生物傳感器的減少由于非遺傳差異導(dǎo)致的低效生產(chǎn)細胞比例的方法有望應(yīng)用于工業(yè)微生物發(fā)酵，提高合成效率。但是對于代謝物生物傳感器的生物元件的挖掘，對響應(yīng)機理的進一步認識以及如何將其更好地應(yīng)用于代謝工程仍舊是亟需研究的重點。

雖然目前已經(jīng)報道了許多成功應(yīng)用代謝物生物傳感器的案例，但是想要實現(xiàn)廣泛應(yīng)用，仍舊需要進一步挖掘生物體內(nèi)廣泛存在的調(diào)控元件。生物信息學(xué)的發(fā)展為調(diào)控元件的挖掘奠定了基礎(chǔ)，但是傳統(tǒng)的基于全細胞挖掘代謝物生物傳感器的方法，由于存在細胞膜與細胞壁的束縛，同時細胞內(nèi)代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜程度高，以及細胞培養(yǎng)過程使得設(shè)計-構(gòu)建-檢驗的流程長，難以快速高通量定量評價代謝物生物傳感器的性能。近年來，利用細胞提取物來完成轉(zhuǎn)錄翻譯過程的無細胞體系迅速發(fā)展［71，72］。基于無細胞合成體系進行代謝物生物傳感器挖掘和構(gòu)建工作，有望大大加快設(shè)計-構(gòu)建-檢驗的進程。另一方面隨著合成生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，有望為來源不同生物的調(diào)控元件移植到宿主中進行應(yīng)用提供通用的策略，如將來源于細菌的轉(zhuǎn)錄激活子應(yīng)用于酵母細胞中［73］。

在實際應(yīng)用中，代謝物生物傳感器的響應(yīng)特性制約了應(yīng)用需求。對于目標菌株的高通量篩選和選擇而言，生物傳感器的響應(yīng)特性決定了其篩選和選擇所得菌株的閾值和分辨率。對于動態(tài)調(diào)控而言，生物傳感器的響應(yīng)特性也尤為重要，研究表明不同響應(yīng)特性的胞內(nèi)代謝物生物傳感器對回路動態(tài)調(diào)控的實際效果影響很大，目標產(chǎn)物的最終產(chǎn)量有時甚至相差數(shù)10倍［69］。如果要使代謝物生物傳感器真正廣泛應(yīng)用到代謝工程研究和實際應(yīng)用中，如何能夠工程化傳感器使其具備滿足應(yīng)用需求的響應(yīng)特性成為亟需解決的難題。目前已經(jīng)有一些經(jīng)驗性方法改造生物傳感器的特性，如在轉(zhuǎn)錄水平改變相關(guān)基因的啟動子強度［74-77］，或在轉(zhuǎn)錄后水平RBS序列優(yōu)化［78］、使用正交核糖體［79］、優(yōu)化密碼子［80］等策略，然而由于目前對蛋白質(zhì)或者mRNA序列-結(jié)構(gòu)-功能的認識仍舊處于非常初級的階段［81］，這些方法仍舊屬于假設(shè)-試錯循環(huán)的范疇，導(dǎo)致生物傳感器改造周期漫長，很難對最終的改造結(jié)果進行預(yù)測。這使得代謝物生物傳感器的應(yīng)用受到重大挑戰(zhàn)，急需解決如何從分子層次認識響應(yīng)機理，配體識別機制，解析序列-結(jié)構(gòu)-功能之間的關(guān)系等關(guān)鍵的科學(xué)問題。結(jié)合近年來快速發(fā)展的高通量分選技術(shù)和深度測序技術(shù)，有望開發(fā)快速、易于工程化應(yīng)用的生物傳感器改造方法。

隨著生物元件的不斷挖掘，對生物識別元件響應(yīng)機理認識的深入，工程化改造方法的成熟，將會有更多的代謝物生物傳感器應(yīng)用于微生物細胞工廠的構(gòu)建，結(jié)合快速發(fā)展的高通量測序技術(shù)、自動化技術(shù)等手段，有望實現(xiàn)微生物細胞工廠高通量、智能化構(gòu)建。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Metabolite Biosensor：A Useful Synthetic Biology Tool to Assist the Construction of Microbial Cell Factory

ZHOU Yi-kang WU Yi-nan WANG Tian-min ZHENG Xiang XING Xin-hui ZHANG Chong
（Department of Chemical Engineering，Tsinghua University，Key Lab of Industrial Biocatalysis of Ministry of Education，Center for Synthetic and Systems Biology，Tsinghua University，Beijing 100084）

Metabolite biosensor，which represents a useful synthetic biology tool，can sense the concentration of intracellular metabolites and then transfer it into specific signal output，showing great potential in the construction of microbial cell factory. It generally consists of two components，biological recognition element and signal output element. The former，typified by regulatory elements，is ubiquitous in nature，such as transcription factor and riboswitch，and has diverse response mechanism. The output can be fluorescence signals，fitness，pathway activation or silence，and so on. Here we reviewed recent progresses about applications of metabolite biosensor in the construction of microbial cell factory，including high-throughput screen/selection，dynamic control and non-genetic selection. We also discussed the effects of the metabolite biosensor performance in application and focused on the opportunities and challenges we might meet in practice.

metabolite biosensor；response mechanism；performance；microbial cell factory

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.01.001

2016-12-19

周益康，男，學(xué)士，研究方向：生物化工；E-mail：zyk15@mails.tsinghua.edu.cn

張翀，男，博士，副教授，研究方向：生物化工、合成微生物細胞工廠；E-mail：chongzhang@mail.tsinghua.edu.cn