合成生物學(xué)在天然產(chǎn)物研究中的應(yīng)用

王麗蘋(píng) 羅云孜，2（. 四川大學(xué)華西醫(yī)院生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 生物治療協(xié)同創(chuàng)新中心，成都 6004；2. 四川大學(xué)華西醫(yī)院消化內(nèi)科，成都 6004）

合成生物學(xué)在天然產(chǎn)物研究中的應(yīng)用

王麗蘋(píng)1羅云孜1，2
（1. 四川大學(xué)華西醫(yī)院生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 生物治療協(xié)同創(chuàng)新中心，成都 610041；2. 四川大學(xué)華西醫(yī)院消化內(nèi)科，成都 610041）

天然產(chǎn)物作為臨床用藥的重要組成部分和新藥發(fā)現(xiàn)的重要來(lái)源，已經(jīng)成為醫(yī)藥領(lǐng)域不可或缺的成員之一。但是傳統(tǒng)的天然產(chǎn)物篩選方法在一定程度上制約了新型天然產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)，鑒別與改造天然產(chǎn)物的生物合成路徑為全新天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)提供了思路。近年來(lái)，生物信息學(xué)和合成生物學(xué)技術(shù)的蓬勃發(fā)展為天然產(chǎn)物的探索與改造帶來(lái)了新的曙光。歸納總結(jié)了合成生物學(xué)技術(shù)相關(guān)的基因重組策略和基因簇調(diào)控方法，并討論了其在天然產(chǎn)物研究中的應(yīng)用及存在的問(wèn)題。

天然產(chǎn)物；合成生物學(xué)；基因重組；基因編輯；底盤細(xì)胞設(shè)計(jì)；異源表達(dá)；CRISPR/Cas9

迄今，大量來(lái)源于植物、真菌和微生物中的天然產(chǎn)物被廣泛的應(yīng)用于制藥、醫(yī)療行業(yè)和工業(yè)。在過(guò)去30年制藥行業(yè)的發(fā)展中，61%抗癌藥物和49%的抗感染藥物來(lái)源于天然產(chǎn)物［1］。然而傳統(tǒng)天然產(chǎn)物研究的策略，即通過(guò)常規(guī)分離萃取方法獲得植物中的天然產(chǎn)物或通過(guò)培養(yǎng)條件和工藝優(yōu)化篩選微生物中的天然產(chǎn)物［2］，往往具有盲目性，且耗時(shí)長(zhǎng)、成本高，重復(fù)發(fā)現(xiàn)已知的化合物，已經(jīng)漸漸不能滿足當(dāng)前人們對(duì)天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)的需要。此時(shí)，合成生物學(xué)的出現(xiàn)與應(yīng)用無(wú)疑對(duì)其產(chǎn)生了巨大的影響。合成生物學(xué)主要是以生物技術(shù)和工程化理念為基礎(chǔ)，綜合了系統(tǒng)生物學(xué)、生物化學(xué)、生物物理學(xué)、生物信息學(xué)等學(xué)科，旨在設(shè)計(jì)、改造、重構(gòu)或創(chuàng)造生物系統(tǒng)，進(jìn)而使這些生物系統(tǒng)滿足人類的需求。在過(guò)去的10年中，從青蒿素的生物合成到嗎啡在酵母中的表達(dá)［3，4］，從達(dá)托霉素等的生物合成途徑鑒定到應(yīng)用組合生物合成方法得到其類似物［5，6］，合成生物學(xué)為天然產(chǎn)物的研究帶來(lái)了一場(chǎng)新的革命。隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，天然產(chǎn)物的研究得到了相應(yīng)的促進(jìn)。一方面，生物信息學(xué)的發(fā)展和完善，使天然產(chǎn)物研究的靶向性更明確；另一方面，合成生物學(xué)技術(shù)的蓬勃發(fā)展為設(shè)計(jì)、重構(gòu)、改造天然產(chǎn)物生物合成系統(tǒng)提供了全新的思路和技術(shù)。

在植物中，天然產(chǎn)物主要通過(guò)植物內(nèi)不同酶元件串聯(lián)反應(yīng)得到。對(duì)于結(jié)構(gòu)復(fù)雜、高活性的植物天然產(chǎn)物，如抗癌藥物紫杉醇，因其提取產(chǎn)量低、全合成效率低，其產(chǎn)量往往難以滿足市場(chǎng)要求，故重構(gòu)其生物合成途徑并在底盤細(xì)胞中成功表達(dá)將為解決該問(wèn)題提供新思路［7-10］?；诰┒蓟蚝突蚪M百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）［11］和PhytoMetaSyn［12］等數(shù)據(jù)庫(kù)的代謝途徑分析和相關(guān)酶的篩選，為植物天然產(chǎn)物合成路徑在底盤細(xì)胞中異源表達(dá)的設(shè)計(jì)提供了更多信息和素材。在微生物中，有生物活性的天然產(chǎn)物多為微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物。常用的次級(jí)代謝產(chǎn)物預(yù)測(cè)工具有 antiSMASH（antibiotics and Secondary Metabolites Analysis SHell）［13］和SMURF［14］等，以放線菌為例，平均每個(gè)放線菌含有20-40個(gè)次級(jí)代謝生物合成途徑，其中大多數(shù)未被研究或在原始菌株生長(zhǎng)狀態(tài)下不表達(dá)（這類基因簇即“沉默”基因簇），激活這些基因簇將會(huì)為新型天然產(chǎn)物的挖掘提供新的來(lái)源。

因此，系統(tǒng)的生物技術(shù)策略與高通量的操作方法對(duì)于天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)和改造有重要的意義［15］?；谟行У幕蛑亟M技術(shù)［16］和編輯手段，或異源表達(dá)策略［17-19］，可快速準(zhǔn)確的實(shí)現(xiàn)新天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)或已知高價(jià)值天然產(chǎn)物的產(chǎn)量提高［20］。本文主要就近幾年應(yīng)用于天然產(chǎn)物研究的基因編輯和重組表達(dá)策略做了簡(jiǎn)要介紹，討論了這些方法用于天然產(chǎn)物表達(dá)簇的重組和對(duì)底盤細(xì)胞的編輯調(diào)控，最后對(duì)這些相關(guān)合成生物學(xué)技術(shù)在天然產(chǎn)物研究領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行簡(jiǎn)要敘述。

1 合成生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展

為實(shí)現(xiàn)新天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)和高價(jià)值化合物的高量表達(dá)，目標(biāo)基因簇的構(gòu)建與合適底盤細(xì)胞的選擇十分重要。在過(guò)去的10年里，科研工作者們基于合成生物學(xué)技術(shù)開(kāi)發(fā)和優(yōu)化了許多基因編輯與重組的技術(shù)以用于大片段DNA的組裝和編輯以及宿主細(xì)胞的改造和優(yōu)化［21］。就基因重組技術(shù)而言，主要包含兩大類：體內(nèi)重組與體外重組。其基本原理大都是基于限制性內(nèi)切酶的酶連反應(yīng)或同源序列介導(dǎo)的重組（表1）?；蚓庉嫾夹g(shù)也在近幾年有飛速的發(fā)展，同時(shí)促進(jìn)和協(xié)助了底盤細(xì)胞的優(yōu)化以及基因簇的定向改造。

表1 基因重組策略

1.1 生物合成路徑的重構(gòu)方法

1.1.1 體外重組方法

1.1.1.1 基于限制性內(nèi)切酶的重組系統(tǒng) 這類方法主要是利用限制性內(nèi)切酶剪切，暴露出黏性末端，具有互補(bǔ)性質(zhì)的黏性末端在連接酶作用下末端識(shí)別進(jìn)行重組。

2008年，Engler等［35］利用具有特殊性質(zhì)的IIS型內(nèi)切酶構(gòu)建了一個(gè)多片段的一步克隆法，命名為Golden Gate。IIS型內(nèi)切酶的特點(diǎn)在于，其剪切位點(diǎn)大都在識(shí)別位點(diǎn)的外側(cè)2-4 bp，因此剪切后載體不易自連，同時(shí)由于暴露的末端與酶切位點(diǎn)序列無(wú)關(guān)，故可以通過(guò)設(shè)計(jì)利用同一內(nèi)切酶實(shí)現(xiàn)多片段組裝和連接。2011年，Weber等［36］基于Golden Gate發(fā)明了新的多片段重組系統(tǒng)模塊克隆（Modular Cloning，MoClo），并且通過(guò)三步克隆，成功實(shí)現(xiàn)了總長(zhǎng)33 kb共11個(gè)轉(zhuǎn)錄單元（共來(lái)自44個(gè)基因片段）的基因簇構(gòu)建。MoClo主要思路為：a.設(shè)計(jì)最終的載體結(jié)構(gòu)及確認(rèn)實(shí)驗(yàn)中所需的工具載體與基因片段；b.以基本的基因片段平行組裝所有的轉(zhuǎn)錄單元（一級(jí)載體）；c.將上一步得到的轉(zhuǎn)錄單元組裝得到二級(jí)載體（由于組裝效率的限制，每次最多組裝6個(gè)單元），最后一步根據(jù)實(shí)際情況可能要多次重復(fù)才能得到最終的載體（圖1）［37］。2012年，Werner等［22］通過(guò)在該系統(tǒng)一級(jí)載體與二級(jí)載體間引入過(guò)渡載體，實(shí)現(xiàn)了總長(zhǎng)50 kb共17個(gè)轉(zhuǎn)錄單元的基因簇構(gòu)建（來(lái)自68個(gè)基因片段）。2016年，Iverson等［38］基于MoClo建立了新的跨學(xué)科的整合設(shè)計(jì)自動(dòng)化研究實(shí)驗(yàn)室（Cross-disciplinary Integration of Design Automation Research lab，CIDAR）模塊克隆庫(kù)，其中包含了一系列在E.coli中可通用的模塊組分，包括啟動(dòng)子、終止子、載體和核糖體結(jié)合位點(diǎn)等。該系統(tǒng)的建立使MoClo的使用更加自動(dòng)化，大大節(jié)約了設(shè)計(jì)和操作的時(shí)間。除此之外，2016年Moore等［39］基于MoClo開(kāi)發(fā)了另一適用于E.coli合成生物學(xué)操作的工具包EcoFlex，并且成功實(shí)現(xiàn)總長(zhǎng)31 kb、共20個(gè)基因的組裝。EcoFlex系統(tǒng)引入了標(biāo)準(zhǔn)元件庫(kù)（與CIDAR相似），以及熒光報(bào)告系統(tǒng)（CIDAR無(wú)該設(shè)計(jì)），然后基于標(biāo)準(zhǔn)元件實(shí)現(xiàn)用戶自定義的模塊組裝。與CIDAR側(cè)重于自動(dòng)化模塊組裝相比，EcoFlex在實(shí)時(shí)檢測(cè)和設(shè)計(jì)靈活上有更明顯的優(yōu)勢(shì)。相比于傳統(tǒng)的酶切連接，在多片段克隆上，MoClo具有設(shè)計(jì)簡(jiǎn)便、操作流程簡(jiǎn)潔、省時(shí)高效的優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，CIDAR和EcoFlex系統(tǒng)的建立，進(jìn)一步從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上優(yōu)化了多片段克隆。

2013年，Chen等［23］設(shè)計(jì)了一個(gè)多基因片段連接的新方法——甲基化輔助的末端剪切連接（Methylational-ASsisted Tailorable Ends Rational ligation，MASTER ligation），并成功組裝4個(gè)基因片段得到總長(zhǎng)29 kb的DNA片段。MASTER主要根據(jù)同時(shí)兼具IIS與IIM性質(zhì)的限制性內(nèi)切酶（restriction enzyme，RE），如Chen等采用MspJI，特異性識(shí)別甲基化的4-bpmCNNR（R=A/G），并在識(shí)別位點(diǎn)外側(cè)剪切形成黏性末端，產(chǎn)生4 bp隨意的黏性末端，從而實(shí)現(xiàn)多基因的按序無(wú)縫連接。與MoClo相比，由于其組裝過(guò)程與序列無(wú)關(guān)（sequence-independent）的性質(zhì)，故更適于基因片段相似性高的多片段組裝。

1.1.1.2 體外同源重組方法 體外的同源重組方法主要有序列與連接獨(dú)立型克?。⊿equence and Ligation-Independent Cloning，SLIC）［40］、無(wú)縫克隆試劑盒（Seamless Ligation Cloning Extract，SLiCE）［41］、尿嘧啶-定點(diǎn)切除試劑克?。║racil-site Specific Excision Reagent cloning，USER）［42］等。以上方案大都僅適用于10 kb以下的片段重組，但它們可用于一些基礎(chǔ)工具載體的構(gòu)建，從而進(jìn)一步用于基因編輯。2009年，Gibson等［21］報(bào)道了一種高效快捷的一步克隆法——Gibson assembly，并實(shí)現(xiàn)了大于50個(gè)基因片段的組裝，也可實(shí)現(xiàn)總長(zhǎng)約900 kb的基因序列組裝，故Gibson assembly可作為大片段組裝時(shí)的優(yōu)先選擇。該方法原理是利用T5外切酶剪切基因片段得到單鏈DNA臂，經(jīng)Taq連接酶與聚合酶的作用，使各基因片段按序組裝。2015年4月，Wang等［43］將CRISPR/Cas9系統(tǒng)與Gibson assembly結(jié)合實(shí)現(xiàn)基因簇構(gòu)建或編輯，成功克隆組裝出最長(zhǎng)約29 kb的DNA片段。同年9月，Jiang等［44］發(fā)表文章，利用策略-CATCH（Cas9-Assisted Targeting of Chromosome segments）（圖2），成功克隆組裝得到最長(zhǎng)約150 kb的DNA片段。CRISPR/Cas9-Gibson assembly的作用原理是在CRISPR/Cas9定向剪切后，得到目的基因片段，最后采用Gibson assembly重組得到目的序列。但此方法對(duì)于大片段的操作效率仍然較低。基于CRISPR/Cas9的大片段克隆技術(shù)，由于其一步克隆得到目的片段的特點(diǎn)，且其片段克隆受酶切位點(diǎn)等的限制，操作的靈活性強(qiáng)，故尤適于完整大基因片段克隆。2016年，Jin等［27］發(fā)明了一個(gè)類似Gibson assembly的無(wú)縫克隆方法DATEL（DNA Assembly method using Thermostable Exonucleases and Ligase），驗(yàn)證對(duì)于2-10片段的基因組裝均有效，但對(duì)于大片段的操作效率依然較低。

圖1 MoClo的基本操作原理［36］

圖2 CATCH與CRISPR/Cas9-TAR的操作流程

另一種多片段組裝策略基于隨機(jī)組裝的位點(diǎn)特異性重組（Site-Specific Recombination-based Tandem Assembly，SSRTA）由Zhang等［45］研究報(bào)道的。2010年，其課題組研究wBT1和wC31介導(dǎo)重組的同時(shí)，發(fā)現(xiàn)并鑒定了一系列attB與attP位點(diǎn)，次年，Zhang等［24］構(gòu)建了SSRTA，完成了總長(zhǎng)62.4 kb（10片段）的埃博霉素生物合成途徑的構(gòu)建。SSRTA主要是利用wBT1整合酶的重組機(jī)制，利用wBT1特異性剪切aat位點(diǎn)形成末端，再經(jīng)過(guò)重組酶作用形成DNA產(chǎn)物，該方法可以快捷高效有序的組裝多片段。2014年，Colloms等［25］報(bào)道了另一種基于絲氨酸整合酶重組的方法絲氨酸整合酶重組系統(tǒng)（Serine Integrase Recombinational Assembly，SIRA），可有效組裝總長(zhǎng)小于10 kb的4-5個(gè)基因片段。這兩種方法除了可以有效的組裝多片段外，且驗(yàn)證可以對(duì)已有的基因進(jìn)行片段的增刪等。

1.1.2 體內(nèi)重組方法 2009年，Shao等［46］基于酵母體內(nèi)重組的機(jī)制構(gòu)建了一個(gè)新的體內(nèi)克隆方法-DNA assembler，并成功完成約19 kb，共8個(gè)片段的組裝。2011年，其課題組利用該系統(tǒng)完成約45 kb的spectinabilin合成基因簇的構(gòu)建［29］。該方案的顯著優(yōu)點(diǎn)在于：設(shè)計(jì)靈活、不受酶切位點(diǎn)限制、效率高以及操作簡(jiǎn)單。與DNA assembler類似的另一種方法TAR（Transformation-Associated Recombination），于2002年由Resnick等［47］構(gòu)建，是一種基于轉(zhuǎn)化偶聯(lián)重組的酵母重組技術(shù)，由于其組裝基因長(zhǎng)度小于15 kb而使應(yīng)用受限。通過(guò)不斷優(yōu)化，現(xiàn)已成為大片段構(gòu)建的常用方法之一，如Yamanaka等［30］利用TAR組裝得到總長(zhǎng)67 kb的它納霉素合成基因簇。2014年，Lee等［34］將CRISPR/Cas9系統(tǒng)與TAR聯(lián)合，最終實(shí)現(xiàn)約55 kb的基因簇克隆。TAR-CRISPR/Cas9原理與CATCH類似（圖2），即利用Cas9作為“剪刀”，從基因組中獲得目的片段，再將目的片段與載體利用TAR進(jìn)行組裝，得到最終目的載體。DNA assembler與TAR均為利用酵母體內(nèi)可自行發(fā)生同源重組的特性，二者對(duì)于組裝的基因片段均需要具有相應(yīng)的同源序列；雖然TAR最終形成的是環(huán)形的酵母人工染色體，而DNA assembler則可將基因片段組裝到目的質(zhì)粒上，也可直接整合至酵母基因組上，但是這兩類方法均可有效的組裝天然產(chǎn)物的合成基因簇。

在E. coli內(nèi)的同源重組系統(tǒng)也有相應(yīng)發(fā)展。2011年，基于全長(zhǎng)的Rac噬菌體前蛋白R(shí)ecE及其協(xié)同作用蛋白R(shí)ecT的發(fā)現(xiàn)鑒定［32］，Bian等［48］在E. coli中，建立了一個(gè)直接將DNA大片段克隆至表達(dá)載體的方法：線性-線性同源重組（Liner-Liner Homologous Recombination，LLHR），并成功克隆了10個(gè)基因（大小為10-52 kb不等）至表達(dá)載體，且其中兩個(gè)表達(dá)載體在異源宿主中表達(dá)得到相應(yīng)產(chǎn)物luminmycin A 和luminmide A/B。LLHR的基本原理是基于E.coli中類似于重組酶系統(tǒng)的噬菌體前蛋白R(shí)ecE在其協(xié)同蛋白R(shí)ecT的協(xié)同調(diào)節(jié)下使載體與目的片段進(jìn)行高效的線性-線性同源重組。2015年，Yin等［33］利用LLHR組裝得到總長(zhǎng)106 kb的salinomycin合成基因簇。另外也有研究者將CRISPR/Cas9系統(tǒng)引入E.coli進(jìn)行重組系統(tǒng)設(shè)計(jì)［26，49］，并成功組裝長(zhǎng)約10 kb的丁醇表達(dá)途徑［49］。雖然在E.coli中引入CRISPPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)于大片段的組裝不存在明顯優(yōu)勢(shì)，但由于該方法可一步實(shí)現(xiàn)從基因片段到基因組的整合，故可利用其進(jìn)行一些簡(jiǎn)單的生物合成途徑的組裝。

2014年，Du等［50］建立了一個(gè)直接克隆的策略-基于噬菌體wBT1整合酶調(diào)節(jié)的位點(diǎn)特異性重組。與SSTAR不同，該方法使得鏈霉菌基因組編輯與抗生素合成基因簇克隆可以同時(shí)進(jìn)行，且整個(gè)過(guò)程在鏈霉菌中完成。其原理是在鏈霉菌中，3個(gè)導(dǎo)入的外源質(zhì)粒中其中兩個(gè)質(zhì)粒分別對(duì)基因組的特定位點(diǎn)進(jìn)行剪切，另一質(zhì)粒對(duì)剪切片段進(jìn)行重組并復(fù)制。Du等［50］成功利用該方法從天藍(lán)鏈霉菌中克隆得到放線菌紫素的合成基因簇，從玫瑰包鏈霉菌NRRL15998中克隆得到納它霉素和達(dá)托霉素的合成基因簇，且效率高達(dá)80%。相比于SSRAR，該方案在克隆大片段的基因簇操作上更簡(jiǎn)潔，同時(shí)通過(guò)外源質(zhì)粒的優(yōu)化，更適用于高GC含量的鏈霉菌基因的操作。隨后2015年，Jin等［51］設(shè)計(jì)了一個(gè)新的大片段克隆系統(tǒng)FACs（Fungal Artificial Chromosomes），并成功獲得56個(gè)來(lái)源于土曲霉的次級(jí)代謝產(chǎn)物合成途徑。該方案主要是構(gòu)建一個(gè)同時(shí)具有E.coli復(fù)制起始位點(diǎn)和曲霉復(fù)制起始位點(diǎn)的人工染色體，使其可在E.coli與模式的曲霉中穿梭，從而攜帶目的基因片段（可達(dá)150 kb）。真菌人工染色體能夠快捷地從自然宿主基因組DNA上捕獲不同大小的基因，通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)化子末端測(cè)序來(lái)鑒定是否含有自然宿主的完整基因簇，將攜帶完整基因簇的真菌人工染色體在構(gòu)巢曲霉中表達(dá)完成天然產(chǎn)物的異源生產(chǎn)。與基于噬菌體wBT1整合酶調(diào)節(jié)的位點(diǎn)特異性重組類似，F(xiàn)ACs也是一步完成大片段基因克隆，但其目前僅限于對(duì)某些特定的真菌系統(tǒng)的操作。

目標(biāo)基因簇的重構(gòu)有時(shí)還涉及到一些優(yōu)化與改造，如利用“Plug and Play”策略對(duì)目標(biāo)基因插入模塊化的啟動(dòng)子，或利用CRISPR/Cas9對(duì)調(diào)控基因進(jìn)行編輯等，以實(shí)現(xiàn)基因簇的表達(dá)優(yōu)化和調(diào)控改造［52，53］?；趥鹘y(tǒng)的基因重組策略，優(yōu)化和發(fā)現(xiàn)新的基因重組編輯方法為不同目的的基因簇重構(gòu)提供了更多的選擇性。

1.2 底盤細(xì)胞的選擇與改造

底盤細(xì)胞往往是異源表達(dá)效率的決定因素之一，故其選擇和改造也是天然產(chǎn)物生物合成路徑構(gòu)建的重要考慮方向。底盤細(xì)胞改造主要涉及到基因組的精簡(jiǎn)與優(yōu)化、代謝流的控制優(yōu)化和調(diào)控因子的改造等。

對(duì)于底盤細(xì)胞的精簡(jiǎn)與優(yōu)化，最經(jīng)典的方法為Cre-LoxP，例如2010年，Komatsu等［54］利用Cre-LoxP策略敲除了阿維鏈霉菌（Streptomyces avermitilis）全基因（9.02 Mb）組中約1.4 Mb的非必需基因，獲得“最小基因組”阿維鏈霉菌底盤細(xì)胞，并成功表達(dá)外源基因簇鏈霉素、頭孢菌素C等，且產(chǎn)量?jī)?yōu)于原始菌株表達(dá)量。該方法的主要原理是利用Cre重組酶可以特異性的識(shí)別LoxP位點(diǎn)并介導(dǎo)其發(fā)生重組。該系統(tǒng)適應(yīng)性強(qiáng)，適用范圍廣，但其介導(dǎo)重組后會(huì)留下引入的LoxP位點(diǎn)，故對(duì)于需要多次非連續(xù)的基因編輯時(shí)，其應(yīng)用則受到LoxP位點(diǎn)設(shè)計(jì)的限制。CRISPR/Cas9技術(shù)的出現(xiàn)則給了底盤細(xì)胞基因組精簡(jiǎn)與優(yōu)化的另一種選擇。CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因刪除原理是 Cas9蛋白在sgRNA（single guide RNA）的作用下，識(shí)別特異性的PAM位點(diǎn)，繼而發(fā)生重組。例如，Cobb等［55］，利用CRISPR/ cas9系統(tǒng)敲除20 bp-30 kb的DNA時(shí)，效率可達(dá)70%-100%。相比于Cre/LoxP系統(tǒng)，CRISPR/cas9系統(tǒng)在選擇靶點(diǎn)上更為靈活，且對(duì)于非連續(xù)性的多片段敲除上更易設(shè)計(jì)與操作。

對(duì)于代謝流的控制和調(diào)控因子的改造多通過(guò)對(duì)原始基因編輯或引入新的基因元件實(shí)現(xiàn)。其主要思路有：（1）引入啟動(dòng)元件或高表達(dá)正調(diào)控因子。例如，Bai等［56］通過(guò)定量法鑒別了一系列可通用的合成模塊調(diào)控元件（核糖體結(jié)合位點(diǎn)+啟動(dòng)子），并成功將其應(yīng)用于S.avermitilis中番茄紅素表達(dá)基因簇的激活與過(guò)表達(dá)；為更好地在E.coli中表達(dá)異戊二烯，Chen等［57］通過(guò)協(xié)同過(guò)表達(dá)對(duì)異戊二烯合成有利的甲基赤磷酸化途徑和甲戊磷酸化途徑，成功將異戊二烯產(chǎn)量提高20倍；（2）負(fù)調(diào)控因子的沉默或敲除。例如，已知在阿維鏈霉菌中阿維菌素生物合成分別受到SdrA和avaR2調(diào)控，Ulanova等［58］和Komatsu等［59］通過(guò)敲除SdrA和avaR2，不僅實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物產(chǎn)量的提高；對(duì)于已改造的阿維鏈霉菌底盤細(xì)胞SUKA17引入ptlB，成功提高紫穗槐-1，4-二烯異源表達(dá)產(chǎn)量［59］。

底盤細(xì)胞作為生物合成途徑表達(dá)的載體，為天然產(chǎn)物的合成提供了初始零件，即底盤細(xì)胞決定了生物合成底物與代謝通量，底物與代謝通量決定了天然產(chǎn)物合成的性質(zhì)與產(chǎn)量。故根據(jù)實(shí)際生物合成途徑選擇合適的底盤細(xì)胞，并對(duì)其代謝過(guò)程的酶與調(diào)控因子加以優(yōu)化，將為天然產(chǎn)物的異源表達(dá)錦上添花。

2 合成生物學(xué)在天然產(chǎn)物研究中的應(yīng)用

隨著基因信息學(xué)的不斷完善和編輯新方法與策略的不斷發(fā)現(xiàn)及改造，從微生物或植物中鑒別次級(jí)代謝產(chǎn)物合成途徑變得更加有靶向性（圖3）。合成生物學(xué)方法用于天然產(chǎn)物的研究從結(jié)果上可分為兩大類：重構(gòu)天然產(chǎn)物的合成基因簇進(jìn)行異源表達(dá)，通過(guò)對(duì)原始宿主的調(diào)控實(shí)現(xiàn)合成基因簇的激活或過(guò)表達(dá)。

2.1 異源表達(dá)

異源表達(dá)作為天然產(chǎn)物研究的重要策略之一，主要應(yīng)用可包含以下幾類：第一，已知生物合成途徑的高價(jià)值化合物的基因簇異源表達(dá)或調(diào)控，提高已有表達(dá)量。例如將來(lái)源于Streptomyces spheroides的新生霉素合成基因簇導(dǎo)入Streptomyces coelicolor M512中進(jìn)行表達(dá)，使其產(chǎn)量提高了3.4倍［60］。第二，通過(guò)異源表達(dá)功能模糊或“沉默”的合成基因簇，實(shí)現(xiàn)新天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)。其主要應(yīng)用的策略包含：?jiǎn)?dòng)子的優(yōu)化，即替換原始基因簇的弱啟動(dòng)子或加入新的啟動(dòng)子；調(diào)控基因的編輯，即過(guò)表達(dá)正向調(diào)控子或沉默負(fù)調(diào)控子等。例如，Luo等［61］重構(gòu)源于Streptomyces griseus中的未知基因簇，并在其上游加入啟動(dòng)子，成功使該基因簇在變鉛青鏈霉菌（Streptomyces lividans）中表達(dá)，發(fā)現(xiàn)了具有重要生理活性的一類抗真菌化合物。Yamanaka等［30］通過(guò)編輯來(lái)源于Saccharomonospora sp. CNQ-490中的未知NRP基因簇，使其去除其中的LuxR型的負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控子，并將該基因簇轉(zhuǎn)入底盤細(xì)胞天藍(lán)鏈霉菌中表達(dá)，成功分離鑒定得到一個(gè)新的脂多肽化合物taromycin A。第三，對(duì)植物源天然產(chǎn)物的生物合成途徑進(jìn)行重構(gòu)，實(shí)現(xiàn)其在模式微生物內(nèi)的表達(dá)。如阿片類化合物在酵母中的成功表達(dá)［4］。

2.1.1 Anthracimycin Anthracimycin作為一類結(jié)構(gòu)獨(dú)特的14元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，最先于2013年從Streptomyces sp. CNH365中分離鑒定得到其化學(xué)結(jié)構(gòu)［62］。2015年，Alt等［63］從Streptomyces sp. T767中分離得到Anthracimycin，并通過(guò)異源表達(dá)分析推斷得到其生物合成路徑，為其進(jìn)一步調(diào)控和衍生物的獲得提供了依據(jù)。

圖3 天然產(chǎn)物生物合成研究的整體思路

從Anthracimycin的結(jié)構(gòu)分析，其主要骨架來(lái)源于PKS（polyketide synthase）合成途徑，但其萘烷部分形成類似于［4+2］的環(huán)加成，且其中3組雙鍵的位置與典型的PKS作用結(jié)果不同。于是Silke等首先通過(guò)基因信息學(xué)的分析，對(duì)推斷得到的Anthracimycin合成基因（來(lái)源于Streptomyces sp. T767，后面以act 表示）進(jìn)行功能的判斷，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證（同位素追蹤等）確定得到其生物合成途徑（圖4）。Anthracimycin很可能只通過(guò)actC-F四個(gè)PKS基因作用形成，而不涉及后修飾基因作用。然后其課題組將鑒定的act 基因簇（actC-F）克隆并轉(zhuǎn)入異源宿主S. coelicolor中表達(dá)并成功分離鑒定得到Anthracimycin。通過(guò)對(duì)act 基因簇的模型（一類新的PKS）構(gòu)建，有利于了解這類新的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的研究。另一方面，通過(guò)推斷了解其生物合成過(guò)程，也為基因重構(gòu)實(shí)現(xiàn)其類似物的發(fā)現(xiàn)奠定了基礎(chǔ)。

圖4 Anthracimycin合成基因簇

從傳統(tǒng)的發(fā)酵手段獲得新的化合物依然是天然產(chǎn)物研究中的重要策略，但是某些生理活性較好的化合物若沒(méi)有經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的優(yōu)化難以成為臨床藥物成分。另一方面，闡明高活性化合物的生物合成途徑也有利于其類似物的發(fā)現(xiàn)。

2.1.2 nisin類似物 nisin是屬于羊毛硫抗生素類，由34個(gè)氨基酸組成，是一種天然抑菌劑，該類物質(zhì)多具有良好的抑制革蘭氏陽(yáng)性菌的作用，且由于其安全性高，故也作為食品防腐劑用于食物保鮮，但該類化合物目前被分離得到的種類卻不甚可觀。

2016年，Van Heel等［64］通過(guò)BAGEL3等數(shù)據(jù)庫(kù)分析，得到了72條與nisin中心肽類似的序列。隨后其基于nisin合成基因的模塊，保留先導(dǎo)肽部分從而構(gòu)建了一個(gè)可適用不同核心多肽表達(dá)的元件（圖5）。最后將預(yù)測(cè)的序列與先導(dǎo)肽元件結(jié)合，引入乳酸菌中表達(dá)得到18種全新的結(jié)構(gòu)差異較大的類似物，且其中5種表現(xiàn)出良好的藥理活性。相較于傳統(tǒng)的培養(yǎng)條件篩選，該系統(tǒng)能較快的實(shí)現(xiàn)未知基因的表達(dá)，同時(shí)能更具目的性的對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析。

圖5 nisin類似物研究思路

2.1.3 阿片類化合物 阿片類化合物作為西方最初使用的鎮(zhèn)痛劑和姑息治療藥物，目前其唯一來(lái)源依然是罌粟的提取，因此其產(chǎn)量嚴(yán)重的受到氣候、地域和蟲(chóng)害等的影響。作為重要的臨床藥物，不確定的產(chǎn)量制約了其市場(chǎng)需求。另外，阿片的衍生物諸如嗎啡、蒂巴因等都是具有高價(jià)值的化合物，而化學(xué)合成這些結(jié)構(gòu)復(fù)雜的化合物并不具有經(jīng)濟(jì)上的競(jìng)爭(zhēng)性。大約30多種關(guān)于阿片類化合物的化學(xué)合成途徑，但沒(méi)有一種適用于大規(guī)模生產(chǎn)［65］。于是重構(gòu)其生物合成途徑在模式微生物中表達(dá)則具有突破性的意義（圖6）。

植物源天然產(chǎn)物的異源表達(dá)，首先需要篩選得到相應(yīng)的酶；其次是在重構(gòu)基因簇后，對(duì)底盤細(xì)胞的代謝流進(jìn)行相應(yīng)調(diào)控，最后完成途徑的優(yōu)化。

2008年，Hawkins等［66］首次通過(guò)在酵母中引入6OMT、CNMT、4OMT三種甲基轉(zhuǎn)移酶，實(shí)現(xiàn)了BIAS合成的前體物質(zhì)（S）-牛心果堿的獲得（圖6橙色框）。2014年，Thodey等［67］以蒂巴因?yàn)榈孜?，在酵母中引入蒂巴因到嗎啡合成途徑中的脫甲基酶T6ODM和醛酮合成酶COR，最終在發(fā)酵液檢測(cè)得到嗎啡。此外，其在以上基礎(chǔ)引入源于惡臭假單胞菌中的嗎啡脫氫酶（MorA）和嗎啡還原酶（MorB），最終生物合成得到氫可酮、氫化嗎啡酮和氧可酮（圖6藍(lán)色框）。2015年，Deloache等［68］基于酶偶聯(lián)法發(fā)明了一種新的生物傳感器，并成功篩選得到來(lái)源于甜菜中的CYP716AD1具有酪氨酸羥化酶活性。通過(guò)PCR優(yōu)化CYP716AD1，并將其引入酵母表達(dá)，成功實(shí)現(xiàn)從葡萄糖到阿片類化合物中間體（S）-牛心果堿的生物合成（圖6綠色框）。同年，F(xiàn)ossati等［69］首先引入罌粟中沙羅泰里啶合成酶（PsSAS），沙羅泰里啶還原酶（PsSAR）和salutaridinol乙酰轉(zhuǎn)移酶（PsSAT）以及T6ODM、COR、CODM，構(gòu)建得到從（R）-牛心果堿到阿片類化合物的生物合成途徑，并且在酵母中以（R）-牛心果堿為底物時(shí)，成功分離得到嗎啡（圖6紫色框）。誠(chéng)如傳統(tǒng)的化學(xué)反應(yīng)，隨著生物內(nèi)反應(yīng)鏈的加長(zhǎng)，產(chǎn)物的積累變得更加困難，另外如何成功實(shí)現(xiàn)（S）-reticuline到（R）-reticuline的生物體內(nèi)轉(zhuǎn)化成為阿片類化合物從頭合成的障礙。同年Galanie等［4］通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，DRR-DRS酶的作用，可將（S）-reticuline成功轉(zhuǎn)化為（R）-reticuline，并通過(guò)改進(jìn)底物來(lái)源的木糖輔助途徑從源頭提高阿片類化合物形成的代謝流，同時(shí)在實(shí)驗(yàn)中不斷優(yōu)化作用酶的表達(dá)和代謝流，從而最終實(shí)現(xiàn)了從頭合成阿片類化合物（圖6）。雖然產(chǎn)量較低，但從無(wú)到有的合成給進(jìn)一步的產(chǎn)量?jī)?yōu)化奠定了基礎(chǔ)。

圖6 阿片類化合物的生物合成途徑［4］

就阿片類化合物而言，生物合成一方面可以解決傳統(tǒng)植物提取所面臨的環(huán)境依賴性和產(chǎn)量不確定性；另一方面，相較于復(fù)雜冗長(zhǎng)的化學(xué)合成，其更適合于大規(guī)模生產(chǎn)，且以葡萄糖為底物使其在經(jīng)濟(jì)上更具競(jìng)爭(zhēng)性。

當(dāng)前，利用模式微生物成功表達(dá)植物來(lái)源的天然產(chǎn)物的成功案例已經(jīng)屢見(jiàn)不鮮，如在E.coli中成功表達(dá)過(guò)紫杉醇的前體紫杉二烯和紫杉酚，在酵母中成功表達(dá)過(guò)紫杉醇［9，70，71］、人參皂苷［72］、依托泊苷［73］等。

異源表達(dá)作為一種有效的天然產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)與鑒定的策略，不僅成功應(yīng)用于天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)，同時(shí)也為高價(jià)值化合物的高表達(dá)提供了新的策略。為成功實(shí)現(xiàn)目的天然產(chǎn)物的異源表達(dá)，需要注意以下3點(diǎn)：適宜的底盤細(xì)胞的選擇、合理的代謝調(diào)控的優(yōu)化以及待表達(dá)的基因簇的設(shè)計(jì)改造。當(dāng)然，構(gòu)建出多種不同高適應(yīng)性的底盤細(xì)胞庫(kù)與相應(yīng)的調(diào)控元件庫(kù)，將會(huì)加快基因簇的重構(gòu)與異源表達(dá)的進(jìn)程。

2.2 原始宿主調(diào)控

原始宿主的調(diào)控主要包括利用操作調(diào)控子，改變代謝途徑中的加工酶或轉(zhuǎn)運(yùn)酶或前體飼喂等實(shí)現(xiàn)天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)或產(chǎn)量提高。Wang等［74］在C-1027合成途徑中，通過(guò)過(guò)表達(dá)調(diào)控子sgcR1、sgcR2和sgcR3均使目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量增加。Gottelt等［75］通過(guò)敲除天藍(lán)鏈霉菌中一條PKS（Polyketide Synthase，聚酮合成酶）生物合成途徑中的轉(zhuǎn)錄抑制子scbR2，從而發(fā)現(xiàn)了新化合物coelimycin。Bai等［56］通過(guò)發(fā)明有一種基于啟動(dòng)子的生物感應(yīng)器，成功激活并過(guò)表達(dá)了S. avermitilis中番茄紅素。

Law等［76］在雷帕霉素的合成途徑中引入新的甲硫氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶，使其可識(shí)別不同甲基底物，得到多種新的16-位定點(diǎn)改變的雷帕霉素同系物。另外，Nguyen等［77］通過(guò)改變達(dá)托霉素合成途徑中DptBC次級(jí)單位上的一個(gè)或多個(gè)模塊從而改變達(dá)托霉素的環(huán)多肽中心；同時(shí)結(jié)合模塊的更換、NRPS次級(jí)單位的替換、沉默后修飾的谷氨酸3-甲基轉(zhuǎn)移酶等方法得到約30種達(dá)托霉素類似物，并且其中一種表現(xiàn)出優(yōu)于達(dá)托霉素的抗E.coil imp的能力。

原始宿主內(nèi)的調(diào)控主要集中于正向調(diào)控元件或生物傳感器的引入、負(fù)調(diào)控因子的刪除或沉默，從而實(shí)現(xiàn)未知基因簇的激活及過(guò)表達(dá)。另一方面，對(duì)于原始宿主內(nèi)基因簇中關(guān)鍵的合成元件的調(diào)整將會(huì)為快速發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物的類似物提供研究思路。所以建立可通用的生物傳感器、發(fā)明快速準(zhǔn)確的基因編輯手段是基于原始宿主研究天然產(chǎn)物的重要策略。

3 結(jié)語(yǔ)

當(dāng)前正是天然產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)的新紀(jì)元，生物信息學(xué)為天然產(chǎn)物的合成基因簇鑒定與重構(gòu)提供了理論參照數(shù)據(jù)，合成生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展影響著應(yīng)用的進(jìn)程。在理論分析得到目的基因簇后，選擇合適的基因簇改造方法，如異源表達(dá)、模塊調(diào)節(jié)、組合合成等，可更準(zhǔn)確的實(shí)現(xiàn)基因功能的鑒別及新化合物的發(fā)現(xiàn)［18，64，78］。同時(shí)，CRISPR/Cas9等新基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)，為大片段的獲得與組裝編輯提供了新的策略，使基因重構(gòu)表達(dá)更快速［34，52，79］。

雖然合成生物學(xué)方法應(yīng)用于天然產(chǎn)物研究已經(jīng)取得了一定成果，但是由于生物合成途徑的重構(gòu)隨基因簇的增大而變得復(fù)雜，最終得到的表達(dá)系統(tǒng)也不一定符合預(yù)期。所以，設(shè)計(jì)構(gòu)建更好的基因編輯系統(tǒng)和更具有優(yōu)勢(shì)的底盤細(xì)胞，將會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)天然產(chǎn)物領(lǐng)域的發(fā)展。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Applications of Synthetic Biology in the Research of Natural Product

WANG Li-ping1LUO Yun-zi1，2
（1. State Key Laboratory of Biotherapy，West China Hospital，Sichuan University and Collaborative Innovation Center of Biotherapy，Chengdu 610041；2. Department of Gastroenterology，West China Hospital，Sichuan University，Chengdu 610041）

As an important source of clinical medicine and new drug candidate，natural product plays an essential role in therapeutic and pharmaceutical industry. However，traditional methods for natural product discovery constrain the development of new compounds at certain extent，and identifying and refactoring the biosynthetic pathways of natural products provided new thoughts for the discovery of new natural product. Currently，with the prosperous development of bioinformatics and synthetic biology technologies，a new era of natural product discovery and engineering can be foreseen. Here，we summarize recent advances on the strategies of genetic recombination and gene cluster regulation related to synthetic biology techniques，and discuss their applications and issues in studying natural products.

natural product；synthetic biology；genetic recombination；gene editing；chassis design；heterologous expression；CRISPR/Cas9

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.01.004

2016-09-26

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81502966）

王麗蘋(píng)，女，碩士，研究方向：天然產(chǎn)物合成與結(jié)構(gòu)修飾；E-mail：2015224060103@stu.scu.edu.cn

羅云孜，女，博士，研究員，研究方向：合成生物學(xué)、天然產(chǎn)物；E-mail：luoyunzi@scu.edu.cn