天然產(chǎn)物合成生物學(xué)體系的優(yōu)化策略

匡雪君鄒麗秋孫超陳士林（. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 0093；. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 00700）

天然產(chǎn)物合成生物學(xué)體系的優(yōu)化策略

匡雪君1鄒麗秋1孫超1陳士林2
（1. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193；2. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700）

天然產(chǎn)物是新藥研發(fā)的重要源泉。天然產(chǎn)物合成生物學(xué)通過(guò)設(shè)計(jì)、重構(gòu)目標(biāo)化合物的高效生物合成途徑，借助宿主改造，利用發(fā)酵生產(chǎn)目標(biāo)化合物，可以有效彌補(bǔ)有機(jī)合成化學(xué)在復(fù)雜天然產(chǎn)物類(lèi)藥物生產(chǎn)方面的不足。雖然合成生物學(xué)已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，但是通過(guò)合成生物學(xué)技術(shù)使目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)水平依然是一項(xiàng)非常具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。綜述了天然產(chǎn)物合成生物學(xué)體系的優(yōu)化策略，通過(guò)綜合運(yùn)用單個(gè)元件、外源代謝途徑、底盤(pán)系統(tǒng)和發(fā)酵條件的優(yōu)化技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)生物合成系統(tǒng)的最優(yōu)化，最大化目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量，為來(lái)源稀缺的復(fù)雜天然產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)提供持續(xù)、穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)的原料供給，推動(dòng)天然產(chǎn)物類(lèi)新藥的研發(fā)。

天然產(chǎn)物；合成生物學(xué)；優(yōu)化；底盤(pán)

天然產(chǎn)物在藥物的發(fā)現(xiàn)和研制中發(fā)揮著重要作用，以天然產(chǎn)物為基礎(chǔ)研制和開(kāi)發(fā)新藥一直是化學(xué)界和醫(yī)藥界重點(diǎn)關(guān)注的領(lǐng)域［1，2］。 天然產(chǎn)物雖然在整個(gè)已知化合物中所占比例很小，但以之為基礎(chǔ)發(fā)展成為新藥的比例卻很大。1981-2014年間批準(zhǔn)上市的1 562個(gè)藥物中約有一半與天然產(chǎn)物有關(guān)；1940-2014年間，國(guó)際上共有175個(gè)小分子藥物被批準(zhǔn)用于癌癥治療，其中有85個(gè)（即約49%）來(lái)源于天然產(chǎn)物或其衍生物［3］。這些有價(jià)值的天然產(chǎn)物通常在原物種中含量很低，化學(xué)提取不僅成本高，而且會(huì)對(duì)環(huán)境資源造成破壞；有些天然產(chǎn)物由于含有多個(gè)手性中心或結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，用化學(xué)方法全合成難度很大，因此，利用合成生物學(xué)技術(shù)合成具有藥用價(jià)值的天然產(chǎn)物受到越來(lái)越多的關(guān)注。目前，已有學(xué)者在工程菌中成功異源合成了萜類(lèi)化合物青蒿素和人參皂苷、生物堿類(lèi)化合物諾斯卡品、黃酮類(lèi)化合物兒茶素和柚皮素等重要天然產(chǎn)物［2，4］。

雖然天然產(chǎn)物合成生物學(xué)研究進(jìn)展迅速，但是使異源合成的目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)水平依然是一項(xiàng)富有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。由于底盤(pán)細(xì)胞是非常復(fù)雜的系統(tǒng)，外源途徑的導(dǎo)入會(huì)使底盤(pán)系統(tǒng)產(chǎn)生一系列反應(yīng)，包括生長(zhǎng)速率的調(diào)節(jié)、熱激反應(yīng)、壓力反應(yīng)、嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)等［5］，進(jìn)而引起質(zhì)粒的不穩(wěn)定、細(xì)胞的裂解和細(xì)胞遺傳信息的改變，導(dǎo)致產(chǎn)物無(wú)法合成或產(chǎn)量極低。本文提出了天然產(chǎn)物合成生物學(xué)體系的優(yōu)化策略（圖1），綜合運(yùn)用單個(gè)元件、外源代謝途徑、底盤(pán)系統(tǒng)和發(fā)酵條件的優(yōu)化技術(shù)，對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行改造，人工精確調(diào)控外源基因，實(shí)現(xiàn)多基因的聯(lián)合協(xié)同表達(dá)，使生物合成系統(tǒng)最優(yōu)化，最大化目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量，為天然藥物的研發(fā)提供新的先導(dǎo)化合物。

圖1 天然產(chǎn)物合成生物學(xué)體系的優(yōu)化策略

1 單個(gè)元件的優(yōu)化

合成生物學(xué)中的元件包括核糖體結(jié)合位點(diǎn)（Ribosome-binding site，RBS）序列、復(fù)制起始位點(diǎn)、啟動(dòng)子、終止子、功能蛋白等［6］。單個(gè)元件的微調(diào)能有效改善基因線路的性能，增加途徑中酶基因的表達(dá)量和生化反應(yīng)的效率。

1.1 RBS優(yōu)化

核糖體結(jié)合位點(diǎn)是調(diào)節(jié)翻譯強(qiáng)度的重要元件，人工設(shè)計(jì)的RBS文庫(kù)可以方便地通過(guò)引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增來(lái)實(shí)現(xiàn)與特定基因的連接，從而在翻譯水平上對(duì)基因的表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行調(diào)節(jié)［7］。可以通過(guò)RBS計(jì)算器（RBS Calculator）［8］或者RBS 設(shè)計(jì)器（RBS Designer）［9］對(duì)RBS文庫(kù)的范圍和強(qiáng)度進(jìn)行預(yù)測(cè)。需要注意的是，此方法一般用于大腸桿菌系統(tǒng)，在酵母中不適用。目前，已有研究者成功在大腸桿菌中通過(guò)修改途徑中關(guān)鍵酶的RBS優(yōu)化了抗癌類(lèi)化合物紫蘇醇、抗腫瘤類(lèi)物質(zhì)司帕霉素和脫氧紫色桿菌素在工程菌中的產(chǎn)量［10］。

1.2 啟動(dòng)子修飾

啟動(dòng)子是結(jié)構(gòu)基因上游起始轉(zhuǎn)錄的一段序列。啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)會(huì)影響其本身與RNA聚合酶的親和力，從而影響該啟動(dòng)子對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄效率。啟動(dòng)子的強(qiáng)度決定了結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度［11］。對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行修飾（如對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行突變、改變啟動(dòng)子序列的長(zhǎng)度或使用強(qiáng)啟動(dòng)子）可以調(diào)控代謝途徑中酶基因的表達(dá)效率［12］。Redding-Johanson 等［13］的實(shí)驗(yàn)表明，使用強(qiáng)啟動(dòng)子能增加甲羥戊酸激酶和磷酸甲羥戊酸激酶的表達(dá)活性，進(jìn)而提高工程菌中紫穗槐-4，11-二烯的產(chǎn)量。Anthony等［14］通過(guò)優(yōu)化啟動(dòng)子的長(zhǎng)度來(lái)平衡甲羥戊酸激酶（MK）和紫穗槐-4，11-二烯合酶（ADS）基因的表達(dá)，使抗癌藥物的前體紫穗槐-4，11-二烯（AD）的產(chǎn)量提高了5倍。

1.3 質(zhì)粒拷貝數(shù)優(yōu)化

增加基因的拷貝數(shù)是調(diào)節(jié)異源基因在底盤(pán)系統(tǒng)中表達(dá)最常用的工具之一。將基因克隆到多拷貝的表達(dá)質(zhì)粒上增加基因的拷貝數(shù)能使基因獲得高水平表達(dá)，但會(huì)給細(xì)胞帶來(lái)更大的生理負(fù)擔(dān)，所以質(zhì)?？截悢?shù)不是越高越好［15，16］。Jawed等［17］在大腸桿菌中建立了丁酸的生物合成途徑，他們發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒的拷貝數(shù)能對(duì)丁酸的產(chǎn)量產(chǎn)生影響，使用中等拷貝數(shù)的質(zhì)粒能取得最好的效果，使丁酸的產(chǎn)量達(dá)到1.5 g/L。

1.4 密碼子優(yōu)化

采用宿主偏愛(ài)的密碼子，減少或避免使用稀有密碼子是提高途徑酶基因異源表達(dá)水平的重要手段［18］。3-類(lèi)固醇脫氫酶（3-ketosteroid-Δ1-dehydrogenase，KSDD）能將雄甾-4-烯-3，17-二酮催化為雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮，由于KSDD是途徑中的限速酶，途徑重構(gòu)時(shí)較低的酶活性使這步反應(yīng)受到限制。Shao等［19］采用密碼子優(yōu)化的方法將KSDD在枯草芽孢桿菌（ Bacillus subtilis）中的酶活性提高了7倍，達(dá)到12.3 U/mg，結(jié)合發(fā)酵條件的優(yōu)化，使雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮的產(chǎn)量達(dá)到8.76 g/L。

2 代謝途徑的系統(tǒng)優(yōu)化

對(duì)生物合成途徑單一元件進(jìn)行修飾盡管一定程度上能提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量，但局部的改善往往導(dǎo)致中間產(chǎn)物的積累，增加細(xì)胞負(fù)擔(dān)，甚至可能會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生生長(zhǎng)抑制毒性，不利于目標(biāo)產(chǎn)物的獲得。對(duì)于代謝途徑的平衡優(yōu)化，主要采用一種基于全局的數(shù)學(xué)算法和生物信息分析，實(shí)現(xiàn)整條途徑代謝流的平衡［20］。

2.1 多元模塊代謝工程

多元模塊代謝工程（Multiple module metabolic engineering，MMME）是將整個(gè)代謝途徑分為不同的模塊，再通過(guò)系統(tǒng)地改造各個(gè)模塊的復(fù)制起始位點(diǎn)、啟動(dòng)子或RBS序列來(lái)協(xié)調(diào)不同模塊的表達(dá)強(qiáng)度，只需少數(shù)模塊的組合，就可以在大范圍內(nèi)優(yōu)化代謝通途徑［21］。Wu 等［22］將松屬素合成途徑分為4個(gè)模塊，通過(guò)改變每個(gè)模塊的質(zhì)?？截悢?shù)，限制了毒性物質(zhì)肉桂酰輔酶A的積累，使松屬素的產(chǎn)量達(dá)到40.02 mg/L。Liu等［23］在枯草芽孢桿菌中構(gòu)建了n-乙酰氨基葡糖（GlcNAc）合成途徑，并把整個(gè)途徑分為3個(gè)模塊：異源的n-乙酰氨基葡糖合成模塊、n-乙酰氨基葡糖醣酵解模塊和肽聚糖合成模塊。使用調(diào)控小RNA來(lái)抑制n-乙酰氨基葡糖醣酵解和肽聚糖的合成，通過(guò)同時(shí)平衡3個(gè)模塊中內(nèi)源和外源基因的表達(dá)，使n-乙酰氨基葡糖的產(chǎn)量達(dá)到36.35 g/L。

2.2 多元自動(dòng)化基因組工程

多元自動(dòng)化基因組工程（Multiplex automated genome engineering，MAGE）是一種高通量修飾基因組的工具，能用目標(biāo)序列同時(shí)替換基因組中多個(gè)位點(diǎn)。人工設(shè)計(jì)的寡核苷酸雙末端均帶有與基因組插入位點(diǎn)同源的序列，中間區(qū)域含有需要替換的DNA片段，在宿主DNA復(fù)制過(guò)程中，在λ噬菌體Red重組酶介導(dǎo)下進(jìn)行高效同源重組［26］。由于MAGE通過(guò)啟動(dòng)子替換或者核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列替換這兩種方式調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，所以寡核苷酸鏈中間區(qū)域含有啟動(dòng)子序列或核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列。MAGE能同時(shí)調(diào)節(jié)途徑中多個(gè)基因（＞20）的表達(dá)［27］。Sharan等［26］利用不同T7啟動(dòng)子來(lái)替換吲哚合成途徑中的12個(gè)基因的啟動(dòng)子，最優(yōu)菌株中靛藍(lán)的產(chǎn)量比原始菌株提高4倍。Wang等［28］利用不同的RBS序列替換番茄紅素合成途徑中20個(gè)基因中的原始RBS序列，找到了最優(yōu)的組合，使番茄紅素的產(chǎn)量提高了5倍。

2.3 多元循環(huán)質(zhì)粒工程

與多元自動(dòng)化基因組工程類(lèi)似，多元循環(huán)質(zhì)粒工程（Multiplex Iterative Plasmid Engineering，MIPE）也是利用寡核苷酸介導(dǎo)的λ噬菌體Red重組酶的同源重組，將攜帶多個(gè)基因的質(zhì)粒和針對(duì)不同基因設(shè)計(jì)的多個(gè)寡核苷酸共同轉(zhuǎn)化進(jìn)入宿主細(xì)胞，用寡核苷酸目的片段替換質(zhì)粒上的相應(yīng)區(qū)域，使質(zhì)粒產(chǎn)生點(diǎn)突變。該法與限制酶切介導(dǎo)的共選擇（Restriction digestion mediated co-selection，RD CoS）策略相結(jié)合，每個(gè)循環(huán)用一個(gè)限制酶切位點(diǎn)作為共選擇標(biāo)記就能用于質(zhì)粒多個(gè)循環(huán)的篩選［29］。Li等［29］運(yùn)用MIPE對(duì)核黃素的生物合成途徑中5個(gè)基因進(jìn)行了組合優(yōu)化，首先從大腸桿菌基因組中克隆出這5個(gè)基因，并連接到質(zhì)粒的同一個(gè)操縱子中。然后將含有不同的核糖體結(jié)合位點(diǎn)的寡核苷酸混合物、攜帶基因的質(zhì)粒與用于篩選的寡核苷酸共轉(zhuǎn)化大腸桿菌，質(zhì)粒上核糖體結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域經(jīng)同源重組發(fā)生突變，經(jīng)過(guò)3輪循環(huán)后，產(chǎn)生了1×107種組合，最后將核黃素的產(chǎn)量提高了2.67倍。

2.4 組合轉(zhuǎn)錄工程優(yōu)化法

在真核微生物中（如釀酒酵母），運(yùn)用啟動(dòng)子工程能對(duì)途徑中基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的優(yōu)化，通常使用隨機(jī)突變的方法來(lái)得到一系列不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子［30］。采用組合轉(zhuǎn)錄工程優(yōu)化法（Customized optimization of metabolic pathways by Combinatorial transcriptional engineering，COMPACTER）將組裝技術(shù)成功應(yīng)用于代謝途徑的組合優(yōu)化，能同時(shí)調(diào)節(jié)多個(gè)酶的表達(dá)水平。該技術(shù)通過(guò)將不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子與不同代謝途徑的基因進(jìn)行組合，再用高通量的篩選方法來(lái)構(gòu)建和篩選出最高效的代謝途徑，由此實(shí)現(xiàn)對(duì)代謝途徑中多個(gè)基因表達(dá)強(qiáng)度的組合優(yōu)化［31］。COMPACTER技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用到酵母木糖利用途徑的3個(gè)酶和纖維二糖利用途徑中2個(gè)酶的優(yōu)化，使工程菌株中纖維二糖的消耗加速了2.1倍，并且使乙醇的產(chǎn)量增加2.3倍［32］。

2.5 可調(diào)控基因間序列優(yōu)化

通過(guò)可調(diào)控基因間序列（Tunable intregenic regions，TIGR）能在一個(gè)操縱子內(nèi)對(duì)多個(gè)基因表達(dá)強(qiáng)度同時(shí)進(jìn)行調(diào)節(jié)，且在原核生物和真核生物中都適用［33］。TIGRs由多種控制元件組成，它們是：mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)、核糖核酸酶斷裂位點(diǎn)和RBS隔離序列等［34］。Pfleger等［35］在大腸桿菌中對(duì)甲羥戊酸途徑中3個(gè)基因（atoB、HMGS、tHMGR）構(gòu)建TIGR文庫(kù)，優(yōu)化多種控制元件，使甲羥戊酸的產(chǎn)量提高了7倍。采用TIGR法人工設(shè)計(jì)操縱子，能影響mRNA的穩(wěn)定性或翻譯起始效率，并消除不同基因的干擾，不需要多個(gè)啟動(dòng)子就能在轉(zhuǎn)錄后水平同時(shí)對(duì)多個(gè)基因的表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行調(diào)節(jié)。

3 底盤(pán)系統(tǒng)優(yōu)化

一些常見(jiàn)的模式微生物，如大腸桿菌、釀酒酵母、枯草芽胞桿菌等是近年來(lái)被廣泛使用的異源合成底盤(pán)細(xì)胞［1］。它們均具備作為一個(gè)優(yōu)良底盤(pán)細(xì)胞所需的特征，如生長(zhǎng)快速、易于基因工程操作、適合大規(guī)模培養(yǎng)、工業(yè)化控制簡(jiǎn)便等。底盤(pán)細(xì)胞的初生或次生代謝產(chǎn)物能為異源生物合成途徑的構(gòu)建提供前體，優(yōu)化異源宿主能增加主流代謝途徑中的底物供應(yīng)，促進(jìn)途徑通量的重新分配，增加天然產(chǎn)物的產(chǎn)量。

3.1 目標(biāo)代謝途徑的上調(diào)

除了增加外源基因的表達(dá)量外，使宿主內(nèi)源基因的表達(dá)上調(diào)也能促進(jìn)產(chǎn)物的生物合成。Fatma等［36］通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件分析，在大腸桿菌中選出可能參與長(zhǎng)鏈脂肪醛轉(zhuǎn)化為脂肪醇的35個(gè)內(nèi)源性酶。研究發(fā)現(xiàn)敲除YbbO基因會(huì)使脂肪醇的含量下降90%，證實(shí)該基因在脂肪醇合成中具有重要作用。通過(guò)優(yōu)化YbbO基因的表達(dá)，使長(zhǎng)鏈脂肪醇的產(chǎn)量達(dá)到169 mg/L，此外，通過(guò)調(diào)節(jié)脂肪酸和磷脂的生物合成使脂肪醇的產(chǎn)量進(jìn)一步增加60%。通過(guò)調(diào)節(jié)途徑中的轉(zhuǎn)錄因子也能使目標(biāo)代謝途徑上調(diào)，Santos等［37］使用全轉(zhuǎn)錄工程法（Global transcription machinery engineering，gTME），對(duì)rpoA和rpoD轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行突變，使酪氨酸的產(chǎn)量達(dá)到13.8 g/L。

3.2 競(jìng)爭(zhēng)性代謝途徑的抑制

下調(diào)或阻斷競(jìng)爭(zhēng)性代謝支路能夠限制或減少流入競(jìng)爭(zhēng)代謝途徑中的底物供應(yīng)，從而維持重要前體或中間產(chǎn)物在底盤(pán)細(xì)胞中的含量?？梢酝ㄟ^(guò)基因敲除或使用弱啟動(dòng)子來(lái)抑制或下調(diào)競(jìng)爭(zhēng)代謝途徑以獲得更多的前體，促進(jìn)途徑通量的重新分配［40］。Paradisee等［41］通過(guò)敲除競(jìng)爭(zhēng)性甾體合成途徑中的ERG9基因，減少進(jìn)入甾體生物合成途徑中的 FPP代謝流，從而使進(jìn)入青蒿酸生物合成途徑的 FPP流量增加，進(jìn)而增加了目的產(chǎn)物AD和青蒿酸的產(chǎn)量。Westfall等［42］采用多種策略來(lái)提高丙二酰輔酶A在大腸桿菌中的含量，例如過(guò)表達(dá)乙酰輔酶A合酶基因和敲除競(jìng)爭(zhēng)途徑，通過(guò)消除丙二酰輔酶A降解途徑，最終使丙二酰輔酶A在胞內(nèi)的產(chǎn)量提高了15倍。有時(shí)同一個(gè)前體可能同時(shí)作為不同次生代謝途徑中的底物用于不同產(chǎn)物的合成，如纈氨霉素和菌絲霉素合成途徑競(jìng)爭(zhēng)一個(gè)共同的前體物質(zhì)2-酮異戊酸，通過(guò)使菌絲霉素合成的基因簇和相關(guān)基因失活，纈氨霉素的產(chǎn)量比野生型菌株提高了4倍［45］。

3.3 底盤(pán)基因組的簡(jiǎn)化

理想的底盤(pán)細(xì)胞應(yīng)該具有最小化基因組，即維持細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖所必須的最少基因（必需基因）。基因組的適當(dāng)精簡(jiǎn)將為重要天然產(chǎn)物的異源生物合成提供理想的底盤(pán)細(xì)胞?；蚪M的簡(jiǎn)化可使細(xì)胞代謝途徑得以優(yōu)化，不僅能改善細(xì)胞對(duì)底物、能量的利用效率，更好地耐受引入的各種酶和代謝產(chǎn)物的代謝負(fù)擔(dān)；還能更好地保持外源基因網(wǎng)絡(luò)，大大提高細(xì)胞生理性能的預(yù)測(cè)性和可控性［46］。采用CRISPR-Cas9技術(shù)、多元自動(dòng)化基因組工程、基于位點(diǎn)特異性重組酶的同源重組等基因組編輯技術(shù)，能在基因組范圍內(nèi)對(duì)任意的多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行同步修飾，實(shí)現(xiàn)底盤(pán)細(xì)胞的改造［47］。2010年，Komatsu等［48］利用阿維鏈霉菌（S. avermitilis）宿主分別異源重構(gòu)了鏈霉素和頭霉素C基因簇，阿維鏈霉菌的基因組大小為9.02 Mb，采用雙交換重組與位點(diǎn)特異性重組技術(shù)將阿維鏈霉菌染色體左端亞端粒區(qū)域與次生代謝產(chǎn)物合成相關(guān)的基因與轉(zhuǎn)座子酶基因刪除（共約1.4 Mb），得到了一系列突變菌株。鏈霉素是一種氨基糖苷類(lèi)抗生素，可由灰色鏈霉菌（S. griseus）產(chǎn)生，但是阿維鏈霉菌不能合成，故將灰色鏈霉菌中鏈霉素生物合成的基因簇（約41.2 kb）導(dǎo)入阿維鏈霉菌野生型和突變菌株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因組簡(jiǎn)化后的突變菌株中鏈霉素含量明顯高于野生型阿維鏈霉菌菌株；頭霉素C是一類(lèi)β內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，將棒狀鏈霉菌（S. clavuligerus）中的頭霉素C合成相關(guān)的基因簇（約35 kb）導(dǎo)入阿維鏈霉菌菌株，結(jié)果也和前述一致，進(jìn)一步證明了宿主基因組簡(jiǎn)化的重要性。由于基因組簡(jiǎn)化后的鏈霉菌菌株刪除掉了多種主要的內(nèi)源性次生代謝產(chǎn)物相關(guān)的基因，積累了更多的前體可用于鏈霉素或頭霉素C的合成，故產(chǎn)量得到提高。2013年，該課題組又將20多個(gè)基因簇引入阿維鏈霉菌，大部分實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)物的成功表達(dá)，證明了阿維鏈霉菌擁有作為次生代謝產(chǎn)物通用宿主的潛能［49］。

4 發(fā)酵條件優(yōu)化

除了對(duì)代謝途徑自身進(jìn)行優(yōu)化外，發(fā)酵條件對(duì)異源宿主中目標(biāo)產(chǎn)物及其前體的產(chǎn)量也有很大影響。即使天然產(chǎn)物工程菌的性能優(yōu)良，如果缺乏合理的發(fā)酵工藝也不能將其潛力發(fā)揮到極致［50］。通過(guò)前體飼喂、培養(yǎng)基優(yōu)化、溫度控制和誘導(dǎo)物添加等方式均能有效增加菌株中目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量。

4.1 前體飼喂

前體飼喂是提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量的最有效的方法之一［51，52］。前體或中間產(chǎn)物的有效供應(yīng)是天然產(chǎn)物的合成和生產(chǎn)的先決條件，前體的增加對(duì)于次生代謝產(chǎn)物的積累有促進(jìn)作用，通過(guò)中間產(chǎn)物的添加，降低中間產(chǎn)物合成的能量消耗，從而促進(jìn)代謝流向目標(biāo)產(chǎn)物［53］。Dhakal等［54］在諾卡氏菌中重構(gòu)了阿根諾卡菌素途徑，通過(guò)飼喂前體物質(zhì)脯氨酸與葡萄糖并調(diào)節(jié)飼喂時(shí)間，阿根諾卡菌素的產(chǎn)量達(dá)到84.9 mg/L，與沒(méi)有飼喂前體的菌株相比，增加了24倍。

4.2 培養(yǎng)基優(yōu)化

目前發(fā)酵產(chǎn)品的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)多采用液體培養(yǎng)基進(jìn)行深層發(fā)酵。使用的培養(yǎng)基必須滿足微生物生長(zhǎng)、繁殖的需要，有利于微生物大量合成有機(jī)物［55］。培養(yǎng)基成分對(duì)工程菌發(fā)酵具有重大影響，不同的生物合成途徑采用不同的碳源進(jìn)行發(fā)酵，常用的碳源有：葡萄糖、木糖、甘油和酵母提取物等［56］。Westfall等［42］研究發(fā)現(xiàn)，將乙醇和葡萄糖作為培養(yǎng)基的混合碳源時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)生的紫穗槐-4，11-二烯產(chǎn)量顯著增加，而將碳源變成半乳糖時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物中的青蒿酸產(chǎn)量上升明顯。

4.3 溫度控制

每種微生物都有最適生長(zhǎng)溫度，對(duì)于某種特定的微生物而言，只能在一定的溫度范圍內(nèi)生長(zhǎng)，微生物的不同生理活動(dòng)也需要在不同的溫度條件下進(jìn)行，所以發(fā)酵速度、生長(zhǎng)速率和代謝產(chǎn)物積累的最適溫度往往不同［57］。例如，乳酸鏈球菌在40℃時(shí)發(fā)酵速度最快，在34℃時(shí)繁殖速度最快，25-30℃時(shí)細(xì)胞產(chǎn)量最高［58］。所以，研究不同微生物在生長(zhǎng)或積累代謝產(chǎn)物階段時(shí)的最適溫度，對(duì)于用變溫發(fā)酵來(lái)提高發(fā)酵生產(chǎn)效率具有重要意義。

4.4 誘導(dǎo)物添加

誘導(dǎo)物的種類(lèi)、濃度和誘導(dǎo)起始時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)時(shí)間均能影響產(chǎn)物的產(chǎn)量［59］。因此，兼顧工程菌生理狀態(tài)和增殖能力選擇適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)物用量和誘導(dǎo)時(shí)間，能夠有效增加工程菌中外源途徑蛋白的表達(dá)，提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量。Sassi等［60］利用解脂耶氏酵母作為細(xì)胞工廠生產(chǎn)重組蛋白，油酸能作用于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子pLIP2控制基因的表達(dá)，把油酸與葡萄糖的混合物（3∶2）添加到培養(yǎng)基中，重組蛋白的產(chǎn)量增加了10倍。

5 總結(jié)與展望

表1總結(jié)了近年來(lái)在天然產(chǎn)物合成生物學(xué)體系優(yōu)化研究領(lǐng)域的主要進(jìn)展。在體系優(yōu)化過(guò)程中，一個(gè)途徑中取得最大產(chǎn)量的方法可能在另一個(gè)途徑中并不適用，找到正確的優(yōu)化方法是增加產(chǎn)量的關(guān)鍵。可以選擇一種適合高效的優(yōu)化技術(shù)或是將不同技術(shù)相結(jié)合，以此來(lái)取得產(chǎn)量最大化，為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。例如，Alper等［61］將基因敲除技術(shù)與gTME方法相結(jié)合來(lái)優(yōu)化番茄紅素的產(chǎn)量。

質(zhì)?？截悢?shù)優(yōu)化、啟動(dòng)子替換、核糖體結(jié)合位點(diǎn)優(yōu)化、密碼子優(yōu)化是常用于提高基因表達(dá)水平的方法，已在多個(gè)天然產(chǎn)物的途徑優(yōu)化中得到應(yīng)用（表1），盡管單一元件的修飾一定程度上能提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量，但天然產(chǎn)物代謝途徑通常相對(duì)復(fù)雜，包含多個(gè)關(guān)鍵酶基因與調(diào)控基因，對(duì)單個(gè)元件的修飾可能只會(huì)增加部分酶的表達(dá)量，對(duì)整個(gè)代謝途徑的影響不明顯，甚至中間產(chǎn)物的過(guò)度積累有時(shí)可能會(huì)使細(xì)胞產(chǎn)生毒性反應(yīng)，影響細(xì)胞正常的生長(zhǎng)和繁殖；而采用組合優(yōu)化的方法對(duì)途徑中多個(gè)元件進(jìn)行同時(shí)調(diào)節(jié)能有效避免這種情況的發(fā)生。如果目標(biāo)產(chǎn)物的合成途徑涉及的基因數(shù)目不多，可以嘗試優(yōu)化可調(diào)控基因間序列，將途徑中幾個(gè)基因置于一個(gè)操縱子內(nèi)，進(jìn)行協(xié)同控制；當(dāng)途徑復(fù)雜，涉及多個(gè)代謝支路，可以使用多元模塊代謝工程、多元自動(dòng)化基因組工程、多元循環(huán)質(zhì)粒工程等方法同時(shí)修飾多個(gè)元件，使整體的代謝達(dá)到平衡，以獲得異源合成體系的最優(yōu)化［62］。

表1 天然產(chǎn)物合成生物學(xué)體系的優(yōu)化研究進(jìn)展

途徑的異源重構(gòu)常用的工程化宿主有：大腸桿菌、釀酒酵母、鏈霉菌等，宿主中存在的內(nèi)源性初生代謝途徑能為目標(biāo)次生代謝產(chǎn)物的合成提供前體物質(zhì)［10，63］。通過(guò)對(duì)宿主初生代謝途徑進(jìn)行調(diào)節(jié)，并與引入的外源代謝途徑之間達(dá)到平衡，以獲得更多的前體物質(zhì)。刪除異源宿主中與目標(biāo)化合物合成不相關(guān)的非必需基因，例如轉(zhuǎn)座子和插入序列基因和次生代謝產(chǎn)物基因簇相關(guān)的基因，可以提高細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性，減少代謝負(fù)擔(dān)［63］。

目前，途徑優(yōu)化還存在一些瓶頸：首先，途徑中不同的基因與方法（例如使用不同拷貝數(shù)、啟動(dòng)子和RBS長(zhǎng)度）的組合多樣，即使是一個(gè)小型途徑，要找到最優(yōu)的組合也費(fèi)時(shí)費(fèi)力。但幸運(yùn)的是，大型文庫(kù)的高通量篩選、動(dòng)態(tài)平衡系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)輔助的建模方法進(jìn)展迅速，極大地促進(jìn)了途徑優(yōu)化進(jìn)程。其次，將小規(guī)模體系按比例擴(kuò)大用于目標(biāo)產(chǎn)物高細(xì)胞密度的大規(guī)模發(fā)酵時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致系統(tǒng)通量的不平衡，小規(guī)模體系所用的發(fā)酵條件（如溫度、氧氣飽和度、細(xì)胞密度等）需要進(jìn)行大幅度的改變，以適應(yīng)產(chǎn)物工業(yè)生產(chǎn)的需要。令人振奮的是，最近出現(xiàn)了多種可用于天然產(chǎn)物生物合成研究的新技術(shù)和新方法，如生物傳感器用于途徑的實(shí)時(shí)監(jiān)控，使微生物系統(tǒng)達(dá)到動(dòng)態(tài)的平衡［64］；CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因組工程技術(shù)用于調(diào)節(jié)基因的強(qiáng)度［65］；使用合成支架或融合蛋白實(shí)現(xiàn)多個(gè)酶空間結(jié)構(gòu)的合理優(yōu)化［66］、對(duì)代謝產(chǎn)物和途徑酶進(jìn)行細(xì)胞器水平的區(qū)室化，以實(shí)現(xiàn)底物和酶的充分利用等［67］。可以預(yù)見(jiàn)隨著合成生物學(xué)理論和技術(shù)的快速發(fā)展，在不久的將來(lái)會(huì)開(kāi)發(fā)出更高效的工程工具，用來(lái)優(yōu)化天然產(chǎn)物合成生物學(xué)體系，從而實(shí)現(xiàn)復(fù)雜天然產(chǎn)物的工程化生產(chǎn)。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Optimization Strategies for Synthetic Biological Systems of Natural Products

KUANG Xue-jun1ZOU Li-qiu1SUN Chao1CHEN Shi-lin2
（1. Institute of Medicinal Plant Development，China Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100193；2. Institute of Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700）

Natural products have become an important source of new drugs. However，there are some deficiencies while producing complex natural products by classical organic synthesis，one measure to efficiently make up those deficiencies is to apply synthetic biology in the biosynthesis of natural product，i.e.，designing and reconstructing efficient biosynthetic pathways of target compounds，re-engineering it in host cells，and producing target compounds by fermentation. However，achieving the yield of target product to the industrial level through technology of synthetic biology is still very challenging though there have been advances in synthetic biology. Here，we review various pathway optimization strategies for the synthetic biological systems of natural products. Via optimization technologies of fine-tuning individual component，exogenous metabolic pathways，the chassis systems，and fermentation conditions，the synthetic biological system may be optimized，and the yield of target product may be maximized，thus providing continuous，stable and economical raw material supplies for the manufacture of complex natural products while source is rare，and promoting the research and development of new drugs similar to natural products

natural products；synthetic biology；optimization；chassis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.01.005

2016-10-22

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81273485，81573704）

匡雪君，女，碩士研究生，研究方向：天然藥物的代謝工程與合成生物學(xué)；E-mail：kuangxuejun@126.com

孫超，男，博士，教授，研究方向：基于組學(xué)分析的藥用植物有效成分生物合成途徑解析及天然藥物的代謝工程與合成生物學(xué)；E-mail：csun@implad.ac.cn；陳士林，男，博士，E-mail：slchen@icmm.ac.cn