多花黃精有效成分與主要環(huán)境因子的相關(guān)性

葉 錢(qián)，蔣燕鋒，馮家駿，馮愷俊，謝彩香，劉京晶

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江 臨安311300；2.浙江省麗水市林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 麗水323000；3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京100193）

多花黃精有效成分與主要環(huán)境因子的相關(guān)性

葉 錢(qián)1，蔣燕鋒2，馮家駿1，馮愷俊1，謝彩香3，劉京晶1

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江 臨安311300；2.浙江省麗水市林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 麗水323000；3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京100193）

多花黃精Polygonatum cyrtonema的根莖是藥食同源的中藥材，用途廣泛，目前多利用野生資源。收集了不同種源的多花黃精，采用蒽酮-濃硫酸比色法和香草醛-冰醋酸-高氯酸比色法分別測(cè)定根莖中總多糖和總皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并分析這2種有效成分與環(huán)境因子間的相關(guān)性。結(jié)果表明：多花黃精總多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97.0～363.2 mg·g－1，總皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24.0～62.6 mg·g－1，來(lái)源于17個(gè)不同種源地的多花黃精化學(xué)質(zhì)量存在較大的差異：浙江金華磐安種源的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，浙江麗水蓮都區(qū)皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高；環(huán)境因子中活動(dòng)積溫與多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈極顯著負(fù)相關(guān)（r=0.618，P=0.008），生長(zhǎng)期適當(dāng)?shù)牡蜏赜欣诙嗵堑姆e累。表3參11

植物學(xué)；多花黃精；多糖；皂苷；環(huán)境因子

百合科Liliaceae植物多花黃精Polygonatum cyrtonema是中藥材黃精的基源物種之一，根莖入藥，又名姜形黃精。始載于《雷公炮炙論》，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾、潤(rùn)肺、益腎等傳統(tǒng)功效［1］。多花黃精根莖中的主要化學(xué)成分包括多糖和甾體皂苷。多糖具有免疫調(diào)節(jié)、降血糖、抗衰老、抗化學(xué)性肝損傷、保護(hù)癡呆小鼠海馬區(qū)線粒體結(jié)構(gòu)等活性，甾體皂苷具有降血脂、抗病毒、改善記憶障礙等作用［2－3］。黃精為常用中藥材，是藥食同源物種，可作為臨床配方、中成藥生產(chǎn)、保健食品配伍及藥膳原料使用。由于市場(chǎng)需求量的增加、資源蘊(yùn)藏量的減少等原因，黃精價(jià)格逐漸上漲，但其引種馴化、豐產(chǎn)栽培技術(shù)尚不成熟，目前藥材仍主要來(lái)源于野生［4］。多花黃精廣泛分布于浙江、江蘇、安徽、江西、福建、四川、貴州等地，浙江省為多花黃精的主產(chǎn)區(qū)之一，種質(zhì)資源豐富［2］。本研究通過(guò)種質(zhì)資源收集、質(zhì)量評(píng)價(jià)、主要有效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)與生態(tài)環(huán)境因子的逐步回歸分析和相關(guān)性分析，為多花黃精的種源篩選、品種選育，規(guī)范中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理（good agricultural practice of medicinal plants and animals，GAP）提供研究基礎(chǔ)，為黃精資源的可持續(xù)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 試驗(yàn)材料

不同種源的多花黃精根莖供試品來(lái)自浙江、安徽、湖北等地，采樣點(diǎn)信息見(jiàn)表1。利用《中藥材產(chǎn)地適宜性分析地理信息系統(tǒng)》（TCMGIS），基于數(shù)字高程模型（digital elevation model，DEM）的多元線性回歸插值方法，根據(jù)采樣點(diǎn)經(jīng)緯度提取氣候、土壤等主要環(huán)境因子［5］。種源地采集后選擇有芽的根莖，用刀切成有2~3個(gè)節(jié)的小段進(jìn)行種植，于浙江省麗水市蓮塘區(qū)麗水市林業(yè)科學(xué)研究院中藥材種質(zhì)資源圃栽培1 a，2013年11月收集地下部分（根莖），60℃烘干，粉碎，過(guò)60目篩，干燥器保存。

1.2 儀器與試藥

UV 2500紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海第三分析儀器廠）；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；AB104-N電子分析天平（梅特勒托利多儀器上海有限公司）；SWB5200型超聲波清洗儀（上海必能信超聲有限公司）。D-葡萄糖、菝契皂苷對(duì)照品 （中國(guó)藥品生物制品檢定所）；甲醇、無(wú)水乙醇、濃硫酸、冰醋酸、香草醛、高氯酸均為分析純。

表1 多花黃精種源采樣點(diǎn)氣候因子Table 1 Climatic factors of Polygonatum cyrtonema sites

2 測(cè)定方法

2.1 總多糖的測(cè)定

2.1.1 樣品溶液制備 取多花黃精根莖粉末0.25 g，精密稱定，加入體積分?jǐn)?shù)為80%乙醇150.0 mL，80℃水浴回流提取1.0 h，過(guò)濾，取濾渣加入蒸餾水150.0 mL，100℃水浴回流提取1.0 h，過(guò)濾，取濾液定容至250 mL。另精密稱取干燥至恒量的D-無(wú)水葡糖糖對(duì)照品8.3 mg于25.0 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，配制成0.332 g·L－1的對(duì)照品溶液，置冰箱中備用。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取對(duì)照品溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL分別至試管中，加蒸餾水補(bǔ)足至2.0 mL，于冰浴中加入體積分?jǐn)?shù)為0.2%蒽酮硫酸溶液8 mL，搖勻，靜置至室溫，100℃水浴10 min后冰浴10 min冷卻。以蒸餾水為空白對(duì)照，同法操作，在520 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。以質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)得總多糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1.194 9x－0.012 0，r=0.999（n=6），線性范圍為0.033 2～0.199 2 mg。取同一供試品溶液，按2.1.2操作進(jìn)行顯色穩(wěn)定性試驗(yàn)，隔0.5 h測(cè)定其吸光度值，結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.25%（n=5），表明供試品溶液在顯色后2 h內(nèi)穩(wěn)定。按2.1.1平行制備6份供試品溶液進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，測(cè)定其吸光度值，結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.54%，表明試驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.1.3 樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定 樣品按2.1.1制成供試品溶液，平行3份，精密吸取1.0 mL至試管中，按2.1.2測(cè)定吸光度值，計(jì)算其質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2.2 總皂苷測(cè)定

2.2.1 樣品溶液制備 取多花黃精根莖粉末0.5 g，精密稱定，加入甲醇25.0 mL，80℃水浴回流提取1.0 h，過(guò)濾即得。精密稱取干燥至恒量的菝契皂苷對(duì)照品2.0 mg，置于10.0 mL容量瓶?jī)?nèi)，加入甲醇定容，配制成0.2 g·L－1的對(duì)照品溶液，置冰箱中備用。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取對(duì)照品溶液0.05，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 mL分別至試管中，加甲醇補(bǔ)足至1.0 mL，100℃水浴蒸干，分別加入體積分?jǐn)?shù)為5%香草醛-冰醋酸溶液0.5 mL，高氯酸溶液0.8 mL，60℃水浴20 min，取出后于冰浴中加入冰乙酸5.0 mL，搖勻，室溫放置15 min。以甲醇溶液為空白對(duì)照，同法操作，在452 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。以質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果總皂苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=9.718 2x－0.021 7，r=0.999（n=5），線性范圍為0.01～0.20 mg。取同一供試品溶液，按2.2.2操作進(jìn)行顯色穩(wěn)定性試驗(yàn)，隔0.5 h測(cè)定其吸光度值，結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.62%（n=5），表明供試品溶液在顯色后2 h內(nèi)穩(wěn)定。精密吸取對(duì)照品溶液5份，各0.6 mL，按2.2.2連續(xù)測(cè)定進(jìn)行精密度試驗(yàn)，結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.20%，表明儀器精密度良好。按2.2.1平行制備6份供試品溶液，分別測(cè)定其吸光度值進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.38%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.3 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的同一供試品6份各0.25 g，分別加入適量菝葜皂苷元對(duì)照品溶液，按2.2.1制成供試品溶液，按2.2.2測(cè)定吸光度值，計(jì)算回收率為99.3%～104.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.63%。

2.2.4 樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定 樣品按2.2.1制成供試品溶液，平行3份，精密吸取0.1 mL至試管中，按

2.2.2測(cè)定吸光度值，計(jì)算其質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2.3 數(shù)據(jù)分析

在Excel 2003統(tǒng)計(jì)軟件中進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和表格制作。在SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件中進(jìn)行單因素方差分析，比較不同種源多花黃精根莖主要有效成分的差異，并進(jìn)行有效成分與主要環(huán)境因子的相關(guān)性分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同種源多花黃精根莖主要有效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異

不同種源多花黃精根莖多糖及皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在顯著差異（P＜0.05）（表2），多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為97.0～363.2 mg·g－1，皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的范圍為24.0～62.6 mg·g－1。來(lái)自浙江金華磐安縣種源的多花黃精根莖多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，安徽池州青陽(yáng)縣、浙江麗水景寧縣和浙江溫州文成縣次之，浙江麗水蓮都區(qū)的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低但皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，安徽池州市青陽(yáng)縣和浙江金華磐安縣盤(pán)峰鄉(xiāng)的皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低。

相關(guān)性分析表明，多花黃精根莖多糖和皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系（P=0.018），表明多花黃精根莖中這2類有效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高的種源難以兼得，引種馴化及優(yōu)良品種選育時(shí)需注意多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)，而臨床及生產(chǎn)應(yīng)用時(shí)應(yīng)根據(jù)適應(yīng)癥及質(zhì)量控制指標(biāo)進(jìn)行原料藥材的篩選。

表2 不同種源多花黃精根莖多糖和皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 2 Contents of polysaccharides and saponins of Polygonatum cyrtonema from different provenances（±s，n=3）

表2 不同種源多花黃精根莖多糖和皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 2 Contents of polysaccharides and saponins of Polygonatum cyrtonema from different provenances（±s，n=3）

說(shuō)明：同一列所注不同小寫(xiě)英文字母表示新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)5%顯著水平。

3.2 影響多花黃精根莖主要有效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的主要環(huán)境因子

將12個(gè)生態(tài)因子分別規(guī)定為x1（經(jīng)度），x2（緯度），x3（活動(dòng)積溫），x4（年平均氣溫），x5（平均相對(duì)濕度），x6（年日照時(shí)數(shù)），x7（年降水量），x8（土壤），x9（7月最高溫），x10（7月平均氣溫），x11（1月最低溫），x12（1月平均氣溫）。設(shè)y1為多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，y2為皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

以種源地的生態(tài)因子為自變量，17個(gè)樣品的多糖和皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為因變量，采用逐步回歸分析方法，剔除沒(méi)有顯著效應(yīng)的自變量，建立比較簡(jiǎn)化和相對(duì)準(zhǔn)確的多元線性回歸方程：y1=66.948－0.000 9 x3（r=0.618，P=0.008），表明多花黃精根莖中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)與活動(dòng)積溫呈極顯著（P＜0.01）負(fù)相關(guān)關(guān)系。

由多花黃精根莖中多糖、皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)與環(huán)境因子的相關(guān)系數(shù)統(tǒng)計(jì)分析（表3）可知，多花黃精根莖中多糖積累明顯與溫度有關(guān)，包括活動(dòng)積溫（P=0.008），年平均氣溫（P=0.038），7月最高溫（P=0.064），7月平均氣溫（P=0.075），1月最低溫（P=0.024），1月平均氣溫（P=0.037）；而皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)與12個(gè)生態(tài)環(huán)境因子均無(wú)顯著相關(guān)性，其積累變異規(guī)律有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論與討論

本研究建立了以菝葜皂苷元為標(biāo)準(zhǔn)品的多花黃精根莖總皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定方法；通過(guò)對(duì)回流提取、超聲提取2種提取法，及甲醇、二氯甲烷和乙酸乙酯3種提取溶劑的綜合比較，確定了供試品溶液制備的甲醇回流方法；經(jīng)過(guò)方法學(xué)考察后，應(yīng)用于多花黃精種質(zhì)資源的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

多花黃精根莖中總甾體皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)與總多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。在初生代謝比較旺盛的條件下，多糖大量積累，皂苷、生物堿等次生代謝合成受到抑制的現(xiàn)象在黃芪Astragali radix，石斛Dendrobii caulis等多種中藥材中均有出現(xiàn)［6-8］?；顒?dòng)積溫是影響多花黃精根莖中多糖積累的最主要環(huán)境因子，與多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，表明生長(zhǎng)期適當(dāng)?shù)牡蜏赜欣诙嗵穷惓煞值姆e累，與低溫刺激植物多糖合成與積累的報(bào)道相一致［6］。

中藥材生長(zhǎng)過(guò)程中受到適當(dāng)?shù)哪婢趁{迫有利于次生代謝產(chǎn)物的積累，氣候地理環(huán)境變異與中藥材化學(xué)生態(tài)型的形成與分化相關(guān)［9］；不同種源藥材在同一實(shí)驗(yàn)地栽培后測(cè)試分析結(jié)果表明：因種源特殊環(huán)境因子產(chǎn)生的化學(xué)生態(tài)型變異，具有一定的遺傳潛力，有效成分與種源環(huán)境和遺傳多樣性的關(guān)聯(lián)可為中藥優(yōu)良品種的選育提供參考［10-11］。本研究未發(fā)現(xiàn)影響皂苷積累的關(guān)鍵環(huán)境因子，需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步深入研究；多花黃精中高多糖和高皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)難以兼顧，在引種栽培、制定育種和遺傳改良方案時(shí)，要根據(jù)具體改良目標(biāo)權(quán)衡考慮。

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Correlation between environmental factors and active constituents of Polygonatum cyrtonema

YE Qian1,JIANG Yanfeng2,FENG Jiajun1,FENG Kaijun1,XIE Caixiang3,LIU Jingjing1
（1.The Nurturing Station for State Key Laboratory of Subtropical Silviculture,Zhejiang A&F University,Lin’an 311300,Zhejiang,China;2.Lishui Academy of Forestry,Lishui 323000,Zhejiang,China;3.Institute of Medicinal Plant Development,Chinese Academy of Medical Science,Peking Union Medical College,Beijing 100193,China）

Polygonatum cyrtonema,a widely used traditional Chinese herbal medicine that mainly comes from the wild,could also be used as a food specific environmental factors influence the formation and the accumulation of active constituents,therefore an appropriate environment is a prerequisite for production of high-quality genuine this medicinal materials.This study aimed to explore the impact of environment factors on polysaccharide and saponin accumulation to enhance the quality of P.cyrtonema.Rhizomes of P.cyrtonema were collected from 17 different provenances of Zhejiang,Anhui and Hubei Provinces,China.Total polysaccharides were determined by the anthrone-sulfuric acid colorimetric method and total saponins by the vanillin-glacial acetic acid-perchloric acid colorimetric method.In addition,a correlation analysis between the main active constituents and environmental factors was also conducted.Results showed that the content range of total polysaccharides was 97.0－363.2 mg·g－1,and total saponins was 24.0－62.6 mg·g－1.Among the provenances tested,total content of these two effective constituents differed.Of all 17 samples,those from Pan’an in Jinhua,Zhejiang exhibited the highest polysaccharide content,and the sample from Liandu in Lishui,Zhejiang had the maximum saponin content.Moreover,active accumulated temperature significantly affected polysaccharide accumulation（r=0.618,P=0.008）.The results indicated an appropriate low temperature could improve the polysaccharide content in cultivated P.cyrtonema.［Ch,3 tab.11 ref.］

botany;Polygonatum cyrtonema;polysaccharide;saponin;environmental factors

S718.3；R282

A

2095-0756（2017）01-0192-05

2015-06-12；

2016-04-06

浙江省公益技術(shù)研究農(nóng)業(yè)項(xiàng)目（2012C22096）；浙江省教育廳資助項(xiàng)目（kg2013219）

葉錢(qián)，從事中藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)及品種選育研究。E-mail：237715099@qq.com。通信作者：劉京晶，講師，博士，從事中藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)及品種選育研究。E-mail：jing_jing_6@163.com