段薈芹王利

（1. 西南民族大學(xué)青藏高原研究院，成都 610041；2. 西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041）

齊口裂腹魚(yú)白介素-1β基因的克隆及表達(dá)譜

段薈芹1王利2

（1. 西南民族大學(xué)青藏高原研究院，成都 610041；2. 西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041）

探討齊口裂腹魚(yú)白介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）基因的基本特點(diǎn)。用RT-PCR方法以齊口裂腹魚(yú)脾臟cDNA作為模板擴(kuò)增IL-1β基因，用生物信息學(xué)軟件分析其序列，用RT-PCR方法檢測(cè)IL-1β基因在齊口裂腹魚(yú)6種組織的表達(dá)情況?？寺～@得的IL-1β序列長(zhǎng)1 252 bp，共編碼276個(gè)氨基酸。GenBank 序列號(hào)為KU886235。IL-1β蛋白相對(duì)分子量為31.25 kD，等電點(diǎn)5.45，預(yù)測(cè)為親水性蛋白。二級(jí)結(jié)構(gòu)主要結(jié)構(gòu)元件為隨機(jī)卷曲和延伸鏈，有4個(gè)N-糖基化位點(diǎn)和16個(gè)磷酸化位點(diǎn)。NJ法系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，齊口裂腹魚(yú)與鯉魚(yú)、鯽魚(yú)的親緣關(guān)系最近。組織表達(dá)分析顯示，IL-1β基因主要在脾臟和腎臟中表達(dá)。這為深入研究魚(yú)IL-1β的生物學(xué)功能提供理論依據(jù)。

齊口裂腹魚(yú)；白介素-1β；克??；蛋白質(zhì)分析；基因表達(dá)

白細(xì)胞介素 1（interleukin1，IL-1）是一種炎癥反應(yīng)前期釋放的細(xì)胞因子，具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)功能［1］，白介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）作為IL-1的一種亞型，是Stylianou等［2］在研究人類(lèi)及老鼠的免疫系統(tǒng)基礎(chǔ)上被發(fā)現(xiàn)的。IL-1β是一種多效炎癥因子，在誘發(fā)炎癥、造血及調(diào)節(jié)代謝等過(guò)程中發(fā)揮重要作用［3］。它可由多種細(xì)胞產(chǎn)生，如巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及樹(shù)狀細(xì)胞等［4］。目前，關(guān)于IL-1β亞基的研究主要集中在生理學(xué)、病理學(xué)、免疫調(diào)控、基因克隆及差異表達(dá)分析等方面［5-12］。而在魚(yú)類(lèi)中的研究，自Zou等［13］采用同源克隆方法從虹鱒（Oncorhynchus mykiss）克隆得到IL-1β基因序列以來(lái)，該基因在多種魚(yú)類(lèi)中被克隆出。包括軍曹魚(yú)（Rachycentron canadium Linnaeus）、鰱（Hypophthalmichthys molitrix）、鯉魚(yú)（Cyprin carpio）、黑石斑魚(yú)（Sebastes schlegeli）、黃鰭鯛（Acanthopagrus latus）、大鰭鳠（Mystus macropterus Bleeker）、斜帶石斑魚(yú)（Epinephelus coioides）等［9，10，14-18］。IL-1β作為魚(yú)類(lèi)重要的免疫細(xì)胞因子，對(duì)其進(jìn)行研究將能豐富魚(yú)類(lèi)免疫學(xué)內(nèi)容。齊口裂腹魚(yú)（Schizothorax prenanti），屬鯉科（Cyprinidae）、裂腹魚(yú)亞科、裂腹魚(yú)屬，是我國(guó)青藏高原地區(qū)及長(zhǎng)江中下游地區(qū)特有的冷水性魚(yú)種，該魚(yú)有極高的營(yíng)養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前，關(guān)于IL-1β基因在齊口裂腹魚(yú)體內(nèi)的報(bào)道研究甚少。本試驗(yàn)克隆了齊口裂腹魚(yú)IL-1β基因，分析了其序列結(jié)構(gòu)，并應(yīng)用半定量PCR技術(shù)研究了該基因在不同組織中的表達(dá)情況，這為齊口裂腹魚(yú)IL-1β基因的功能研究及免疫應(yīng)答基因的篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 齊口裂腹魚(yú)來(lái)自四川雅安某養(yǎng)殖場(chǎng)，體長(zhǎng)為37-42 cm，體重為395-420 g。

1.1.2 主要試劑和儀器 2×Taq PCR Master Mix、pMD19-T載體、DL2000 DNA marker（購(gòu)于北京天根生化科技有限公司），E.coli DH5α菌種（本實(shí)驗(yàn)室保存），Trizol（Invitrogen），PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒（TaKaRa），DNA凝膠回收試劑盒（Axygen），凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀（均購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司），PCR儀（購(gòu)于Eppendorf Germany）。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA合成 齊口裂腹魚(yú)正常飼喂，處死后無(wú)菌操作收集魚(yú)體脾臟、心臟、腎臟、肝臟、肌肉、腸道6種組織于液氮快速冷凍。各剪取100 mg魚(yú)組織加1 mL Trizol提取總RNA，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳及分光光度計(jì)檢測(cè)RNA提取質(zhì)量和完整性。用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)?7℃ 15 min，85℃ 5 s，最后4℃保存。合成的6種組織cDNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)本課題組前期測(cè)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的IL-1β基因的EST序列，用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異性引物，用齊口裂腹魚(yú)18S rRNA作為內(nèi)參引物，引物序列詳見(jiàn)表1。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

表1 基因的引物序列

1.2.3 PCR擴(kuò)增 以齊口裂腹魚(yú)脾臟cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系（50 μL）：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，正、反向引物各1 μL，超純水18 μL，模板5 μL。PCR條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸 50 s，32個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。

1.2.4 目的基因的克隆 擴(kuò)增后的產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將擴(kuò)增所得產(chǎn)物用通用型凝膠回收純化試劑盒純化，并與pMD19-T連接，轉(zhuǎn)化至DH5α（E.coli）感受態(tài)細(xì)胞，并涂布于含Amp+的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12 h。挑單菌落于含Amp+LB液體培養(yǎng)基中，經(jīng)菌液PCR后，將陽(yáng)性克隆菌液測(cè)序。

1.2.5 組織表達(dá) 以齊口裂腹魚(yú)脾臟、心臟、腎臟、肝臟、肌肉、腸道6種組織cDNA為模板，進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系及條件詳見(jiàn)1.2.3。內(nèi)參基因18S rRNA在各組織中的擴(kuò)增體系為50 μL，擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸 50 s，32個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。所得產(chǎn)物均經(jīng)10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.6 分析與處理 應(yīng)用DNAMAN軟件翻譯IL-1β基因序列，IL-1β蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、信號(hào)肽和結(jié)構(gòu)域分析分別應(yīng)用ExPASy程序中的Protparam、SOPMA、SignalIP 4.1和SMART進(jìn)行分析；磷酸化位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)運(yùn)用NetPhos 2.0和NetNGlyc 1.0進(jìn)行分析；氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建應(yīng)用Clustalx1.83、Mega5.0軟件。

2 結(jié)果

2.1 IL-1β基因擴(kuò)增

取齊口裂腹魚(yú)脾臟、心臟、腎臟、肝臟、肌肉、腸道6種組織的總RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，可觀察到5 S、28 S和18 S三條帶，分光光度計(jì)檢測(cè)OD260/OD280值均在1.8-2.0之間（圖1），可達(dá)到試驗(yàn)要求。用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（圖2），測(cè)的齊口裂腹魚(yú)IL-1β基因PCR產(chǎn)物片段大小與預(yù)期結(jié)果基本相符，約為1 300 bp。

圖1 齊口裂腹魚(yú)6種組織RNA提取檢測(cè)結(jié)果

圖2 齊口裂腹魚(yú)脾臟IL-1β基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 IL-1β基因序列及蛋白理化性質(zhì)分析

將測(cè)序得到的1 252 bp的序列提交至GenBank，序列號(hào)為：KU886235。該序列包含一個(gè)831 bp的開(kāi)放閱讀框，共編碼276個(gè)氨基酸。Protparam軟件預(yù)測(cè)IL-1β蛋白分子量為31.25 kD，等電點(diǎn)5.45。出現(xiàn)頻率較高的氨基酸殘基包括：Leu（9.8%）、Ser（9.1%）、Asp（7.2%）、Thr（6.9%）。帶正電氨基酸殘基數(shù)為29，帶負(fù)電的殘基數(shù)為35，此蛋白帶負(fù)電。平均親水性為-0.267，可知該蛋白為親水性蛋白。

2.3 IL-1β蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)、信號(hào)肽和結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

SOPMA在線(xiàn)軟件分析（圖3）顯示，IL-1β蛋白由隨機(jī)卷曲（random coil，32.25%）、延伸鏈（extended strand，31.52%）、α-螺旋（Alpha helix，26.09%）和β-轉(zhuǎn)角（Beta turn，10.14%）組成，表明該蛋白的主要結(jié)構(gòu)元件為隨機(jī)卷曲和延伸鏈。SignalIP 4.1分析顯示，該蛋白無(wú)信號(hào)肽序列。SMART分析顯示，IL-1β蛋白存在IL-1超家族結(jié)構(gòu)域，為第112-269位氨基酸。

圖3 齊口裂腹魚(yú)IL-1β蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.4 IL-1β蛋白磷酸化位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

NetNGlyc 1.0 N-糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)表明，IL-1β蛋白有4個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，分別為（103NATP106）、（132NLTN135）、（216NDSL219）及（265NFTL268）。NetPhos 2.0磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)顯示，IL-1β蛋白有16個(gè)磷酸化位點(diǎn)，即有11個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)、3個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)和2個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。

2.5 IL-1β 同源性及系統(tǒng)進(jìn)化分析

應(yīng)用NCBI中的Blastp程序進(jìn)行蛋白比對(duì)分析顯示，齊口裂腹魚(yú)IL-1β編碼的氨基酸序列與鯉魚(yú)（Cyprinus carpio）、鯽魚(yú)（Carassius auratus）、南亞野鯪（Labeo rohita）、印度鯪（Cirrhinus mrigala）、團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala）等物種的相似性分別是81%、79%、77%、76%和57%?；贗L-1β氨基酸序列，采用Mega5.0軟件構(gòu)建氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖4），由進(jìn)化樹(shù)可知，齊口裂腹魚(yú)最先與鯉魚(yú)和鯽魚(yú)聚為一類(lèi)，再與其他魚(yú)類(lèi)聚為一類(lèi)，最后與哺乳動(dòng)物聚為一類(lèi)。

圖4 齊口裂腹魚(yú)IL-1β氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.6 IL-1β 基因組織表達(dá)分析

以齊口裂腹魚(yú)18S rRNA為內(nèi)參基因，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)IL-1β基因在心臟、肝臟、脾臟、腎臟、腸道、肌肉6種組織中的表達(dá)量大小為：脾臟＞腎臟＞肌肉＞心臟＞肝臟＞腸道（圖5），可知，IL-1β基因主要在脾臟和腎臟中表達(dá)，且具有組織特異性。

圖5 齊口裂腹魚(yú)IL-1β基因在不同組織中的表達(dá)情況

3 討論

IL-1β是白介素-1家族中重要的成員之一，為一種重要的炎癥和免疫原性細(xì)胞因子，能增強(qiáng)體液免疫和細(xì)胞免疫介導(dǎo)的組織損傷過(guò)程［19］，并能促進(jìn)B、T細(xì)胞的活化、增殖與分化，增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷活力，刺激巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生IL-6和TNF-α等細(xì)胞因子。IL-6與IL-1β通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，也能影響T細(xì)胞、B細(xì)胞的免疫功能［20，21］。迄今為止，IL-1β基因已在軍曹魚(yú)、鰱、鯉魚(yú)、黑石斑魚(yú)、黃鰭鯛、大鰭鳠、斜帶石斑魚(yú)等魚(yú)體內(nèi)被克隆出［9，10，14-18］，尚未見(jiàn)在齊口裂腹魚(yú)中的研究報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)成功克隆出齊口裂腹魚(yú)IL-1β基因cDNA全長(zhǎng)序列1 252 bp，編碼276個(gè)氨基酸。研究顯示，鯉魚(yú)IL-1β蛋白也由276個(gè)氨基酸組成。這雖然與齊口裂腹魚(yú)氨基酸數(shù)目相同，但氨基酸組分卻存在差異。大鰭鳠IL-1β蛋白是由296個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，黑石斑魚(yú)IL-1β蛋白是由252個(gè)氨基酸組成的多肽，鰱IL-1β蛋白由275個(gè)氨基酸組成。這說(shuō)明不同品種魚(yú)IL-1β蛋白序列存在一定差異或不同生境下其變異程度不同相關(guān)。經(jīng)Blastp程序同源性分析發(fā)現(xiàn)齊口裂腹魚(yú)與其他已知魚(yú)類(lèi)的IL-1β序列具有較高的同源性。且與已報(bào)道的鯉魚(yú)IL-1β氨基酸序列同源性達(dá)81%［11，16］。在進(jìn)化演變過(guò)程中，氨基酸序列比DNA序列更為保守，基于齊口裂腹魚(yú)IL-1β氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，齊口裂腹魚(yú)IL-1β蛋白序列與鯉魚(yú)、鯽魚(yú)的聚類(lèi)較近，與南亞野鯪、印度鯪等其他魚(yú)類(lèi)的聚類(lèi)次之，而與人和小家鼠的聚類(lèi)較遠(yuǎn)，顯示該蛋白從魚(yú)類(lèi)到哺乳動(dòng)物的進(jìn)化規(guī)律符合從低等到高等的原則，且這對(duì)研究IL-1家族各因子出現(xiàn)的時(shí)間順序有所幫助［11，16］。蛋白結(jié)構(gòu)域分析，該蛋白含有IL-1超家族結(jié)構(gòu)域，符合IL-1超家族結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，與相關(guān)報(bào)道IL-1β蛋白結(jié)構(gòu)域特點(diǎn)相一致［9，11，16］。SignalIP 4.1信號(hào)肽預(yù)測(cè)顯示，齊口裂腹魚(yú)IL-1β編碼的蛋白質(zhì)未發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽序列及IL-1轉(zhuǎn)換酶（Interleukin-1 conveting enzyme，ICE）切割位點(diǎn)。研究報(bào)道哺乳動(dòng)物是通過(guò)此位點(diǎn)被ICE切割后釋放功能成熟肽，可推測(cè)齊口裂腹魚(yú)編碼的蛋白質(zhì)可能是被某些酶消化后才成為具有生物學(xué)功能的成熟肽［22-24］。

IL-1β基因在魚(yú)類(lèi)免疫反應(yīng)中的作用往往是通過(guò)表達(dá)方面的研究體現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)組織表達(dá)顯示，IL-1β基因在齊口裂腹魚(yú)脾臟、腎臟中表達(dá)量最高，在肌肉、心臟和肝臟中次之；在腸道中最弱。這提示IL-1β基因在6種組織中的表達(dá)具有一定的特異性，且這種特異性可能決定該基因在免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮作用的程度。大鰭鳠IL-1β在脾臟和頭腎中表達(dá)量高，鰱只在脾臟中少量表達(dá)，在其他組織并無(wú)表達(dá)［10，15］，這說(shuō)明與其他組織相比，IL-1β基因可能在脾臟中的免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮的作用更大。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)以齊口裂腹魚(yú)為研究對(duì)象，成功克隆了IL-1β基因，并對(duì)其序列結(jié)構(gòu)及在不同組織中的表達(dá)情況進(jìn)行了分析。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Cloning and Expression Profile of Interleukin-1β Gene in Schizothorax prenanti

DUAN Hui-qin1WANG Li2
（1. Institute of Qinghai-Tibet Plateau，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041；2. College of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041）

This work aims to characterize interleukin-1β（IL-1β）gene of Schizothorax prenanti. First，RT-PCR was used to amplify IL-1β gene with cDNA of S. prenanti spleen as template. Then，the IL-1β gene sequence was analyzed with various bioinformatics tools，and the expressions in 6 tissues of S. prenanti were detected used RT-PCR. As results，the length of IL-1β gene was 1 252 bp，and it encoded 276 amino acids. Its GenBank accession number was KU886235，the molecular weight of IL-1β was 31.25 kD，and pI was 5.45. It was induced as a hydrophilic protein，and its secondary structure mainly consisted of random coil and extended strand. There were 4 N-glycosylation sites and 16 phosphorylation sites in this protein. Phylogenetic relationships revealed that S. prenanti presented a closest genetic relationship with Cyprinus carpio and Carassius auratus. The analysis of tissue expression indicated that IL-1β gene was mainly expressed in the spleen and kidney. It provides theoretical evidence for further studying the biological function of IL-1β gene.

Schizothorax prenanti；interleukin-1β；cloning；protein analysis；gene expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.014

2016-06-16

四川省科技支撐項(xiàng)目（2016NZ0044），西南民族大學(xué)研究生學(xué)位點(diǎn)建設(shè)項(xiàng)目（2016XWD-SO71007）

段薈芹，女，碩士生，研究方向：動(dòng)物遺傳學(xué)；E-mail：917077886@qq.com

王利，女，副教授，研究方向：動(dòng)物免疫學(xué)；E-mail：qinxin916@aliyun.com