苗藥黑骨藤配伍金鐵鎖的總皂苷含量測定

陳秋霞 李 江 楊 軼

貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550002

藥物研究

苗藥黑骨藤配伍金鐵鎖的總皂苷含量測定

陳秋霞 李 江*楊 軼

貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550002

目的：建立黑骨藤配伍金鐵鎖的總皂苷含量測定方法。方法：以齊墩果酸為對照，用5%的香草醛-冰醋酸及高氯酸進行顯色，在550nm波長下運用紫外-分光光度法對總皂苷含量進行測定。結(jié)果：齊墩果酸在0.002～0.012mg/mL濃度范圍與吸光度呈良好的線性關(guān)系，回歸方程A=62.4C-0.0101，r=0.9991，回收率為96.19%，RSD為1.43%。結(jié)論：建立了黑骨藤配伍金鐵鎖回流提取法中總皂苷含量測定方法，該方法快速、簡便，精密度和穩(wěn)定性良好，可用于黑骨藤配伍金鐵鎖復(fù)方制劑的質(zhì)量控制。

黑骨藤；金鐵鎖； 配伍；總皂苷； 紫外-可見分光光度法

黑骨藤與金鐵鎖均為貴州十大苗藥，兩藥均可用于風(fēng)濕疼痛[1]。黑骨藤為蘿摩科杠柳屬植物黑龍骨PeriplocaforrestiiSchltr的干燥根或全株，有通經(jīng)、活血、解毒，祛風(fēng)的功效，用于風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎痛、跌打損傷等[2]；金鐵鎖為石竹科金鐵鎖屬植物金鐵PsammosilenetunicoidesW．C．Wu et C．Y．Wu的干燥根，具有祛風(fēng)除濕，散瘀止痛，解毒消腫，用于風(fēng)濕痹痛，胃脘冷痛，跌打損傷，外傷出血等[3]。本實驗研究的復(fù)方是國家名老中醫(yī)邱德文教授用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的臨床經(jīng)驗方，兩藥配伍療效確切。本方是由黑骨藤與金鐵鎖組成，處方用量比例黑骨藤∶金鐵鎖為6∶1，金鐵鎖為國家2級保護稀有植物。本課題組在前期對于兩藥配伍的不同極性提取物的鎮(zhèn)痛、抗炎作用進行研究，發(fā)現(xiàn)在相同劑量下，70%乙醇提取物的鎮(zhèn)痛抗炎作用顯著優(yōu)于水提取物的鎮(zhèn)痛抗炎作用[4]，且進一步實驗研究發(fā)現(xiàn)兩藥配伍后的總皂苷具有抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用(待發(fā)表)，故對兩藥配伍的70%乙醇提取物中總皂苷的含量進行研究，以期為建立兩者組成的復(fù)方的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供相關(guān)理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 紫外分光光度計GBC Cintra 20(澳大利亞照生公司)；RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；BT 125D 型分析天平(Sartorius，德國賽多利斯)；恒溫水浴鍋(江蘇國勝實驗儀器廠)。

1.2 材料 黑骨藤采于貴州烏當(dāng)區(qū)，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院劉芃教授鑒定為蘿摩科杠柳屬植物西南杠柳PeriplocaforrestiiSchltr的根；金鐵鎖采于貴州威寧縣，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院劉芃教授鑒定為石竹科金鐵鎖屬植物金鐵鎖PsammosilenetunicoidesW.C.Wu et c.Y.Wu的根；齊墩果酸(批號：110709-200304，中國藥品生物制品檢定所提供)；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備 精密稱定配伍藥材(黑骨藤∶金鐵鎖=6∶1)粉末(過60目篩)2.0g，加50倍量的70%乙醇，80℃水浴中冷凝回流提取3次，每次2h，濾過，合并濾液。將濾液減壓濃縮至干，用25mL水分散(混懸液)，依次用石油醚、正丁醇分別萃取3次，每次25mL，棄去石油醚萃取液，合并正丁醇萃取液，減壓回收溶劑，用甲醇定容至10mL容量瓶中，作為供試品溶液。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取齊墩果酸(不溶于水，在甲醇中溶解性好)對照品適量，加甲醇溶解配制成質(zhì)量濃度為0.2mg/mL的對照品溶液。

2.3 含量測定方法及測定波長的選擇[5]精密吸取0.2mL對照品溶液和供試品溶液于10mL具塞試管中，水浴揮干甲醇，分別加入5% 香草醛-冰醋酸溶液(鮮配鮮用)0.2mL和高氯酸溶液0.8mL，于60℃水浴中顯色15min，取出后立即用冰水冷卻5min，再加冰醋酸至10mL，搖勻，靜置10min，以甲醇同法制備空白參比。在200～700nm 范圍進行掃描，兩者均在550nm處有最大吸收。見圖1、2。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 分別精密吸取對照品溶液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL于10mL具塞試管中，按“2.3 ”項下自“水浴揮干甲醇”起依法操作，在550nm處測定吸光度。以吸光度(A)為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)進行線性回歸。見圖3。

結(jié)果表明，齊墩果酸在0.002～0.012mg/mL濃度范圍與吸光度成呈良好的線性關(guān)系，回歸方程：A=62.4C-0.0101，r=0.9991。

2.5 穩(wěn)定性試驗 精密吸取0.2mL供試品溶液，按“2.3” 項下自“水浴揮干甲醇”起依法操作，在90min內(nèi)每隔10min時，在 550nm處測定一次吸光度。供試品溶液吸光度RSD為1.12%，表明供試品溶液顯色后，在90min內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6 精密度試驗 精密吸取0.2mL對照品溶液，共6份，按“2.3” 項下自“水浴揮干甲醇”起依法操作，在90min內(nèi)，550nm處測定吸光度。結(jié)果表明，對照品吸光度RSD為1.11%，表明該方法的精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗 取同一批次配伍藥材各6份，按“2.1”項下方法操作制備供試品溶液，按“2.3” 項下自“水浴揮干甲醇”起依法操作，在550nm處測定吸光度，結(jié)果總皂苷含量RSD為1.27%。

2.8 加樣回收試驗 精密稱取“2.7”項下已知含量的同一批次配伍藥材1.0g，共6份，分別加入等量齊墩果酸對照品適量，按“2.1”項下和“2.3” 項下方法操作，在550nm處測定吸光度，并計算回收率。見表1。

表1 加樣回收率實驗結(jié)果 (n=6)

2.9 供試品提取條件的正交試驗 根據(jù)可能影響總皂苷醇提取的因素，以乙醇用量(A)、提取溫度(B)、提取時間(C)、提取次數(shù)(D)作為考察因素，每個因素取3個水平，提取液減壓濃縮至干，用25mL水分散(混懸液)，依次用石油醚、正丁醇分別萃取3次，每次25mL，棄去石油醚萃取液，合并正丁醇萃取液，減壓回收溶劑，用甲醇定容至10mL容量瓶中，作為正交試驗樣品，以總皂苷含量為主要考察指標(biāo)。采用L9(34)正交設(shè)計，對配伍藥材提取工藝進行優(yōu)化。因素水平表、試驗安排表、方差分析表見2～4。

表2 總皂苷提取正交試驗因素水平表

表3 總皂苷提取正交試驗安排

表4 方差分析表

方差分析表明，各因素對處方中總皂苷的含量提取均無顯著性影響。極差分析，表明四個因素對處方中總皂苷含量的提取影響因素大小順序為A>B>D>C，優(yōu)選工藝為A2B3C3D3,，即藥材用50倍量70%乙醇，80℃回流提取3次，每次2h。

2.10 樣品含量的測定 精密稱定藥材粉末2.0g，按正交試驗結(jié)果制備供試品溶液，按“2.3 ”項下自“水浴揮干甲醇”起依法操作，在550nm處測定吸光度，以齊墩果酸計，計算樣品中總皂苷的含量。見表5。

表5 黑骨藤配伍金鐵鎖總皂苷含量測定

3 討論

實驗采用正交設(shè)計試驗對供試品回流提取條件進行考察，采用紫外-可見分光光度計法，以齊墩果酸為對照品，香草醛-高氯酸法顯色，對配伍中藥材中的總皂苷的含量測定進行了方法學(xué)考察。本法操作簡單、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好，可為黑骨藤配伍金鐵鎖復(fù)方的質(zhì)量控制研究提供了有效手段。為減少誤差， 稱樣、 加入顯色劑等操作均應(yīng)由專人操作，所用的香草醛-冰醋酸溶液應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用，否則空白值的顏色會加深，影響測定的結(jié)果。

文獻報道采用熊果酸、齊墩果酸分別用于黑骨藤、金鐵鎖的含量測定[6-7]。熊果酸與齊墩果酸果酸均屬于五環(huán)三萜類成分，分別為烏蘇烷型、齊墩果烷型，兩種類型在分子結(jié)構(gòu)上甲基位置不同，但其母核均為五環(huán)型[8]。在測定波長的選擇過程中，分別對熊果酸、齊墩果酸進行波長掃描(200～700nm)，結(jié)果均在550nm處由最大吸收，結(jié)合實驗成本，選用齊墩果酸作為對照品。

[1]邱德文,杜江.貴州十大苗藥[M].北京：中國古籍出版社,2008.

[2]貴州省藥品監(jiān)督管理局.貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) [M].貴州：貴州科技出社,2003:381.

[3]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2015:220-221.

[4]王文春,李江,童宏龍.苗藥黑骨藤配伍金鐵鎖不同提取物鎮(zhèn)痛抗炎作用研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2014,25(12):2821-2823.

[5]劉亮,杜江,潘爐臺，等.苗藥觀音草中總皂苷的含量測定[J].中國民族民間醫(yī)藥,2011(4):2-3.

[6]申海艷,龔小見,李文敏，等.苗藥黑骨藤中總皂苷含量的測定[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2012,18(11):94-97.

[7]王龔,周欣.金鐵鎖總皂苷含量測定[J].貴州師范大學(xué)學(xué)報,2012,5(6):4-6.

[8]匡海學(xué).中藥化學(xué)[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社,2003:221-222.

國家自然科學(xué)基金(No.81160426)。

陳秋霞(1992-)，女,漢族，研究方向為中藥及民族藥藥物新制劑及新劑型的研究。E-mail：1194880454@qq.com

李江(1973-)，男,漢族,博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向為中醫(yī)方劑配伍和民族藥物系統(tǒng)研究與開發(fā)。

R29

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1007-8517(2017)03-0030-03

2016-11-22 編輯：穆麗華)