姜樹中　花佳佳　張玲燕　肖明兵

【摘要】 目的：闡明FBXW7的表達(dá)及與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后之間的關(guān)系。方法：收集結(jié)直腸癌及癌旁組織新鮮標(biāo)本16例，利用實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定FBXW7的表達(dá)，并與各臨床病理參數(shù)進(jìn)行單因素分析及多因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析，明確其與結(jié)直腸癌患者生存期關(guān)系。結(jié)果：RT-PCR法顯示FBXW7在癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；免疫組化結(jié)果顯示FBXW7主要表達(dá)于細(xì)胞核，且其在癌旁組織中表達(dá)陽性率（79.7%）明顯高于結(jié)直腸癌組織（54.2%）；結(jié)直腸癌患者生存期關(guān)系的單因素分析結(jié)果顯示，腫瘤的分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤深度、Dukes分期及FBXW7的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者生存期長短有相關(guān)性（P<0.05），而結(jié)直腸癌患者的性別、年齡、腫瘤的部位、腫瘤的直徑、腫瘤大體分型與結(jié)直腸癌患者生存期長短均無相關(guān)性（P>0.05）。FBXW7陽性為影響結(jié)直腸癌患者生存期的獨(dú)立因子，風(fēng)險(xiǎn)度為2.42，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.015<0.05）。結(jié)論：FBXW7在癌組織中不表達(dá)或低表達(dá)而在癌旁組織高表達(dá)；FBXW7可能是影響結(jié)直腸癌患者生存期的獨(dú)立因子且其表達(dá)與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后之間有一定關(guān)系。

【關(guān)鍵詞】 FBXW7； 結(jié)直腸癌； 獨(dú)立因子； 研究

Expression of FBXW7 and Its Correlation with Colorectal Cancer/JIANG Shu-zhong，HUA Jia-jia，ZHANG Ling-yan，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（02）：008-012

【Abstract】 Objective：To elucidate the expression of FBXW7 and its effect on the occurrence，development and prognosis in colorectal cacer.Method：A total of 16 cases of fresh colorectal cacer and adjacent tissues were collected and detected FBXW7 expression by real-time PCR，then analyzed by univariate analysis and multivariate Cox proportional hazards regression model analysis with various clinicopathological parameters to clarify its relationship with the survival of patients with colorectal cancer.Result：RT-PCR showed that the expression of FBXW7 was lower than that of adjacent tissue（P<0.05）.Immunohistochemistry results showed that FBXW7 mainly expressed in the nucleus and its expression in the pericarcinous tissue（79.7%） was significantly higher than that of colorectal cancer tissue（54.2%）.According to the results of single factor analysis of the surial in patients with colorectal cancer，the degree of tumor differentiation，having or not lymph node metastasis，with or without distant metastasis，tumor infiltrated depth，Dukes staging and the expression of FBXW7 were correlated with the the survival of colorectal cancer patients（P<0.05），but there were no correlation between sex，age，tumor site，tumor diameter，tumor general classification with the survival of colorectal cancer patients（P>0.05）.FBXW7 was the independent factor of the survival of colorectal cancer patients and the risk degree was 2.42，P=0.015<0.05.Conclusion：FBXW7 expresses in pericarcinous tissue and with low or no expression in colorectal cacer.FBXW7 might be the independent factor of the survival of colorectal cancer patients and its expression correlated with the the occurrence，development and prognosis in colorectal cacer.

【Key words】 FBXW7； Colorectal cancer； Independent factor； Study

First-authors address：The Sixth Peoples Hospital of Nantong，Nantong 226011，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.02.003

結(jié)直腸癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，在全世界范圍內(nèi)的發(fā)病率位居第三位，僅次于肺癌和胃癌，嚴(yán)重威脅著人類的健康。近二十幾年來結(jié)直腸癌的5年總體生存率在50%～60%，目前治療結(jié)腸癌的首選治療方法依舊是手術(shù)切除配合化療或放療等[1]。在一樣的治療干預(yù)下，早期結(jié)腸癌5年生存率90%以上，而晚期低于10%，預(yù)后很差[2]。所以早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療，是提高結(jié)腸癌患者存活率的關(guān)鍵[3]。可是因?yàn)樵缙诮Y(jié)腸癌患者臨床癥狀較輕或者沒有顯著的臨床表現(xiàn)，造成早期發(fā)現(xiàn)和診斷相對(duì)困難，一旦發(fā)現(xiàn)大多處于晚期，預(yù)后很差。FBXW7作為抑癌因子和腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子已被證實(shí)[4]，但其在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用機(jī)制以及對(duì)預(yù)后的判斷等還不完全明確[5]。本研究將建立合適的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?、擴(kuò)大樣本量，采取更多的實(shí)驗(yàn)方法來盡可能明確其在結(jié)直腸癌關(guān)鍵作用，以期為結(jié)直腸癌的早期診斷、判斷預(yù)后及靶向治療提供一個(gè)新的途徑，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 標(biāo)本來源 RT-PCR組織標(biāo)本：收集來自于南通大學(xué)附屬醫(yī)院及南通市第六人民醫(yī)院住院手術(shù)治療的結(jié)直腸癌及配對(duì)的癌旁組織新鮮標(biāo)本16例，新鮮組織離體后去除出血、壞死及電灼組織，用生理鹽水洗去血污，30 min內(nèi)置于-70 ℃冰箱內(nèi)保存，用作RNA提取。免疫組化研究對(duì)象及標(biāo)本：結(jié)直腸癌及癌旁石蠟組織標(biāo)本來源于2004年4月-2015年2月南通大學(xué)附屬醫(yī)院住院手術(shù)患者，入選結(jié)直腸癌及癌旁組織標(biāo)本共59對(duì)。其中男36例，女23例；年齡<69歲29例、≥69歲30例；腫瘤部位在右半結(jié)腸33例，左半結(jié)腸及直腸26例；腫瘤直徑≤5 cm 32例，>5 cm 27例；大體分型為腫塊型27例，潰瘍型32例；病理類型均為腺癌；分化程度為高分化10例，中分化42例，低分化7例。病理分級(jí)采用常用國際Dukes分期法，A期15例，B期26例，C期14例，D期4例；術(shù)后中位生存期為50個(gè)月。結(jié)直腸癌診斷及分期根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟（UICC）制定的標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 TRIZOL RNA抽提試劑購自美國Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Fermentas公司，免疫組化染色試劑盒（PV-9003）和DAB酶底物顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，抗FBXW7抗體及二抗購自美國Santa Cruz公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)流程與方法

1.2.1 RNA抽提、逆轉(zhuǎn)錄和RT-PCR 取出高溫高壓消毒后研缽，切取50～100 mg冰凍組織置于研缽內(nèi)，倒入液氮，研碎，直至看不見組織和細(xì)胞碎片，加入1 mL的TRIZOL后將勻漿標(biāo)本轉(zhuǎn)移到1.5 mL的EP管中，室溫放置5 min；加入0.2 mL的氯仿，加蓋搖晃15 s，在15～30 ℃放置2～3 min，離心12 000 r/min，15 min，離心后分成三層，將上層水相轉(zhuǎn)移到另一干凈的EP管中， 加入0.5 mL異丙醇，靜置10 min，離心12 000 r/min，10 min，去上清，加入1 mL 75%乙醇洗滌RNA沉淀，振蕩器混勻，離心7500 r/min，5 min，去上清，置真空或空氣中5～10 min，干燥RNA沉淀；用無RNase水重懸RNA沉淀，用槍頭反復(fù)吹打幾次，55～60 ℃靜置10 min，測(cè)濃度后-20 ℃保存。

在20 μL體系中，加入1 μg總RNA，1 μL gDNA Eraser，2 μL 5×DNA Eraser Buffer和RNase-Free水至10 μL?；靹蚝笥?2 ℃保溫2 min，4 ℃置于冰上。向反應(yīng)體系中先后加入5 uL RNase-Free水，

2 μL 5 × PrimeScript Buffer 2，1 μL RT Primer Mix，1 μL PrimeScript RT Enzyme Mix 1，37 ℃孵育15 min，85 ℃孵育5 s，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；在冰上加入12.5 μL SYBR PremixEX TapTM Ⅱ（2×），1 μL PCR Forward Primer，1 μL PCR Reverse Primer，2 μL cDNA模板，8.5 μL ddH2O進(jìn)行Real time PCR反應(yīng)，設(shè)置程序：95 ℃ 30 s， 95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s；58 ℃ 30 s，95 ℃15 s。以2-?CT法（CT代表循環(huán)閾值）計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)組織中FBXW7表達(dá) 所需腫瘤組織經(jīng)由4%福爾馬林固定，自動(dòng)脫水機(jī)脫水，透明，浸蠟處理，包埋成蠟塊，切成厚度為4～5 μm的薄片，載玻片要防止脫片。PBS沖洗，抗原修復(fù)用檸檬酸鹽緩沖液，微波中火10min，流水自然冷卻，每張切片加50 μL 3%H2O2，室溫下孵育10 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS沖洗；除去PBS液，每張切片加50 μL 1∶60稀釋的FBXW7鼠抗人單克隆抗體，在室溫條件下孵育

1 h，PBS沖洗；除去PBS，每張切片加50 μL聚合物增強(qiáng)劑，室溫下孵育20 min，PBS沖洗；除去PBS每張切片加50 μL抗鼠聚合物（poly-HRP anti- rat IgG），室溫下孵育30 min，PBS沖洗；除去PBS液，每張切片加50 μL新鮮配制的DAB，室溫條件下顯色5 min，蒸餾水沖洗。蘇木素復(fù)染，0.1% HCl分化，自來水沖洗，藍(lán)化，切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。以出現(xiàn)淡黃色至棕褐色顆粒且染色強(qiáng)度高于背景特異性著色者為陽性細(xì)胞。光鏡下半定量結(jié)果判斷，綜合考慮染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)。染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)標(biāo)準(zhǔn)：棕褐色3分；棕黃色2分；淡黃色1分；無著色0分。同樣物鏡下計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)：一個(gè)視野內(nèi)著色細(xì)胞>75% 4分；51%～75% 3分；11%～50% 2分；≤10% 1分；陰性0分。兩項(xiàng)得分相乘：0～3分為陰性表達(dá)“-”；滿3分為“+”；4分為“++”；5分以上為“+++”?！?～+++”為陽性表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)時(shí)定量PCR分析結(jié)直腸癌及其癌旁組織中FBXW7 mRNA表達(dá)結(jié)果（RQ值）呈偏態(tài)分布，故以中位數(shù)（檢測(cè)范圍）表示，軼和檢驗(yàn)分析癌與癌旁組織中mRNA表達(dá)水平的差異；免疫組化結(jié)果中FBXW7蛋白在結(jié)直腸癌組織與癌旁組織間表達(dá)的比較及FBXW7蛋白表達(dá)與各臨床病理參數(shù)間關(guān)系的分析均采用軼和檢驗(yàn)；單個(gè)臨床病理參數(shù)與結(jié)直腸癌患者生存期的分析采用Logrank單因素生存分析；FBXW7表達(dá)與結(jié)直腸癌患者生存期關(guān)系分析采用Kaplan-Meier生存分析；差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的各臨床病理參數(shù)間的多因素分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FBXW7在結(jié)直腸癌中低表達(dá)而在癌旁組織中高表達(dá) 以實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定FBXW7在結(jié)直腸癌患者癌及癌旁組織中表達(dá)結(jié)果。結(jié)果顯示：FBXW7在癌組織中表達(dá)的RQ值為0.693 （0.013～1.914），而在癌旁組織中的結(jié)果為1.458 （0.038～2.293），經(jīng)軼和檢驗(yàn)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=2.374，P=0.0176），說明FBXW7在結(jié)直腸癌中低表達(dá)而在癌旁組織中高表達(dá)，其RQ值箱體圖，見圖1。免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示FBXW7蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核，隨表達(dá)強(qiáng)度不同著色可依次表現(xiàn)為淡黃、棕黃至棕褐色不等。59例結(jié)直腸癌組織中FBXW7表達(dá)陽性率為54.2%（32/59），明顯低于癌旁組織79.7%（47/59），且強(qiáng)陽性（++、+++）主要集中在癌旁組織，而結(jié)直腸癌組織多為陰性（-、+）表達(dá)（Z=5.740，P<0.01），表1和圖2。

2.2 結(jié)直腸癌組織中FBXW7的表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系 應(yīng)用單因素分析結(jié)直腸癌組織中FBXW7與臨床各病理參數(shù)之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，腫瘤的分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤深度、Dukes分期及FBXW7陽性與否與結(jié)直腸癌患者生存期間長短有相關(guān)性（P<0.05）。而結(jié)直腸癌患者的性別、年齡、腫瘤的部位、腫瘤的直徑、腫瘤大體分型分別與結(jié)直腸癌患者生存期間長短均無相關(guān)性（P>0.05）。見表2。

2.3 FBXW7及各臨床病理參數(shù)與結(jié)直腸癌患者生存期Logrank單因素分析及多因素分析 將單因素分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的各參數(shù)采用多因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行分析。結(jié)果顯示：所有因素中FBXW7陽性為影響結(jié)直腸癌患者生存期的獨(dú)立因子，風(fēng)險(xiǎn)度為2.42，P=0.015<0.05，見表3和圖3。

3 討論

泛素蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin proteasome system，UPS）在調(diào)控細(xì)胞周期蛋白、細(xì)胞的生長和增殖方面起重要作用[6]。泛素化的異常與細(xì)胞增殖失調(diào)和細(xì)胞異常分化有關(guān)，被認(rèn)為是多種人類惡性腫瘤發(fā)生的基礎(chǔ)[7]。而泛素化作用主要有三種酶組成：泛素激活酶、泛素載體蛋白酶和泛素連接酶，泛素化底物則被26S蛋白酶體選擇性識(shí)別和降解。SCF類E3復(fù)合體作為泛素連接酶（E3）中的一類，由環(huán)指蛋白（Rbx1，也稱Roc1和Hrt1）、支架蛋白、銜接蛋白（Skp1）和一個(gè)F-box蛋白組成，而F-box蛋白類決定了底物特異性[8]。

FBXW7是F-box蛋白家族的一員，作為LIN-12介導(dǎo)（Notch介導(dǎo)）信號(hào)通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子首次被發(fā)現(xiàn)在遺傳分析漂亮新小桿線蟲中[9]。FBXW7在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中也與Notch家族蛋白類相互作用，促進(jìn)其泛素依賴的更新[10]。而且FBXW7靶向降解數(shù)個(gè)控制哺乳動(dòng)物細(xì)胞周期進(jìn)程的蛋白，包括CyclinE、c-Myc和c-Jun等雖不直接參與細(xì)胞周期調(diào)控的蛋白但也通過FBXW7靶向降解[11]。CyclinE、c-Myc、c-Jun等均是原癌基因的產(chǎn)物，F(xiàn)BXW7能促進(jìn)降解這些癌蛋白，表明FBXW7作為SCF類泛素連接酶E3復(fù)合體中特異性識(shí)別底物的一個(gè)關(guān)鍵因子，即是一種廣泛的腫瘤抑制因子[12]。

已有相關(guān)研究表明FBXW7在膽管癌、白血病、宮頸癌等多種人類腫瘤中發(fā)生突變[13]。其中在急性T細(xì)胞型淋巴細(xì)胞白血病、肝癌、食管鱗狀細(xì)胞癌、肺癌、結(jié)直腸癌、胃癌[14]的研究中均已發(fā)現(xiàn)FBXW7的表達(dá)缺失。FBXW7作為抑癌因子和腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子已被證實(shí)，但其在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用機(jī)制以及對(duì)預(yù)后的判斷等仍未完全明確[15]。

總之，本研究表明FBXW7癌組織中不表達(dá)或低表達(dá)，癌旁組織高表達(dá)，表明FBXW7的表達(dá)與結(jié)直腸癌發(fā)生及發(fā)展之間有一定關(guān)系；FBXW7陽性為影響結(jié)直腸癌患者生存期的獨(dú)立因子，與結(jié)直腸癌的預(yù)后有直接關(guān)系。下一步可通過研究FBXW7過表達(dá)和干擾后對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期和遷徙的影響以期明確其在結(jié)直腸癌關(guān)鍵作用，為結(jié)直腸癌的早期診斷、判斷預(yù)后及靶向治療提供一個(gè)新的途徑。

參考文獻(xiàn)

[1] Yang H，Lu X，Liu Z，et al.FBXW7 suppresses epithelial-mesenchymal transition，stemness and metastatic potential of cholangiocarcinoma cells[J].Oncotarget，2015，6（8）：6310-6325.

[2]趙麗中，王宏磊.大腸癌早期診斷研究進(jìn)展[J].中國腫瘤，2014，23（2）：103-108.

[3]鄒艷芳，田永，徐峰.Bmi-1和Mel-18基因在大腸癌組織中的表達(dá)及意義[J].世界華人消化雜志，2013，21（5）：397-402.

[4] Natarajan V，Bandapalli O R，Rajkumar T，et al.NOTCH1 and FBXW7 mutations favor better outcome in pediatric South Indian T-cell acute lymphoblastic leukemia[J].J Pediatr Hematol Oncol，2015，37（1）：23-30.

[5] Zhou C，Shen L，Mao L，et al.miR-92a is upregulated in cervical cancer and promotes cell proliferation and invasion by targeting FBXW7[J].Biochem Biophys Res Commun，2015，458（1）：63-69.

[6] Tu K，Yang W，Li C，et al.FBXW7 is an independent prognostic marker and induces apoptosis and growth arrest by regulating YAP abundance in hepatocellular carcinoma[J].Mol Cancer，2014，13（1）：1-13.

[7]張淑平，吳夢(mèng)，柯星，等.卵巢癌患者CD4+細(xì)胞中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞相關(guān)分子標(biāo)志物的表達(dá)特點(diǎn)及臨床意義[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2015，31（3）：370-373.

[8] Yokobori T，Mimori K，Iwatsuki M，et al.Copy number loss of FBXW7 is related to gene expression and poor prognosis in esophageal squamous cell carcinoma[J].Int J Oncol，2012，41（1）：253-259.

[9] Yokobori T，Yokoyama Y，Mogi A，et al.FBXW7 mediates chemotherapeutic sensitivity and prognosis in NSCLCs[J].Mol Cancer Res，2014，12（1）：32-37.

[10]朱元民，劉玉蘭.感染炎癥與腫瘤的發(fā)生[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2013，22（2）：105-108.

[11]王從玉，鄧躍華，劉弋，等.nm23VE6F-C及VEGFR-3在大腸癌中的表達(dá)及意義[J].中國腫瘤臨床，2008，35（9）：1117-1121.

[12] Li L，Sarver A L，Khatri R，et al.Sequential expression of miR-182 and miR-503 cooperatively targets FBXW7， contributing to the malignant transformation of colon adenoma to adenocarcinoma[J].J Pathol，2014，234（4）：488-501.

[13] Calcagno D Q，F(xiàn)reitas V M，Leal M F，et al.MYC， FBXW7 and TP53 copy number variation and expression in gastric cancer[J].BMC Gastroenterol，2013，13（36）：141.

[14] Li Z，Xiao J，Hu K，et al.FBXW7 Acts as an Independent Prognostic Marker and Inhibits Tumor Growth in Human Osteosarcoma[J].Int J Mol Sci，2015，16（2）：2294-2306.

[15] Fu H，Li C，Yang W，et al.FOXP3 and TLR4 protein expression are correlated in non-small cell lung cancer：Implications for tumor progression and escape[J].Acta Histochemica，2013，225（2）：151-157.

（收稿日期：2016-10-24） （本文編輯：程旭然）