張世勇+王明華+鐘立強(qiáng)

摘要：采用DNA混池測(cè)序法篩選斑點(diǎn)叉尾肌肉生長(zhǎng)抑制素（MSTN）基因SNP位點(diǎn)，同時(shí)使用SNaPshot法將篩選到的SNP多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行分型，最后與生長(zhǎng)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。共篩選到4個(gè)SNP位點(diǎn)，即g.3501 T>G、g.3844 T>A、g.4297 C>G、g.4355 G>C。其中，g.3501 T>G位于第一內(nèi)含子；g.3844 T>A位于第二外顯子，并造成密碼子GUA變?yōu)镚AA，氨基酸由纈氨酸（Val）變?yōu)楣劝彼幔℅lu）；g.4297 C>G、g.4355 C>G位于第二內(nèi)含子。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，SNP位點(diǎn)g.4355 G>C與斑點(diǎn)叉尾的體質(zhì)量和體長(zhǎng)呈顯著性負(fù)相關(guān)，具有GG基因型個(gè)體的體質(zhì)量和體長(zhǎng)顯著性低于CC型和CG型（P<0.05），該位點(diǎn)可作為斑點(diǎn)叉尾分子育種的候選分子標(biāo)記。

關(guān)鍵詞：斑點(diǎn)叉尾；MSTN；SNP；SNaPshot；生長(zhǎng)性狀；關(guān)聯(lián)分析

中圖分類號(hào)： Q953；S917 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2017）01-0030-03

肌肉生長(zhǎng)抑制素（myostatin，MSTN）是骨形成蛋白家族（bone morphogenetic protein family）和TGF-β超家族成員之一，又被稱為生長(zhǎng)分化因子8（growth and differentiation factor 8，GDF-8）。MSTN基因是肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵基因，它編碼的蛋白是骨骼肌生長(zhǎng)的負(fù)性調(diào)控因子。McPherron等敲除小鼠的MSTN基因，發(fā)現(xiàn)小鼠骨骼肌生長(zhǎng)加快[1]；在斑馬魚(yú)中進(jìn)行的MSTN基因敲除試驗(yàn)具有類似的試驗(yàn)結(jié)果[2]。脊椎動(dòng)物中MSTN基因的結(jié)構(gòu)和功能具有較高的保守性[3]，因此可將MSTN基因作為哺乳動(dòng)物及魚(yú)類等物種的候選生長(zhǎng)相關(guān)基因。

斑點(diǎn)叉尾（Ictalures punctatus）別稱美洲鲇、溝鲇，屬于鲇形目（Siluriformes）科（Ictaluridae），原產(chǎn)于美國(guó)，是一種重要的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)類物種，具有肉質(zhì)細(xì)膩、適溫范圍廣、生長(zhǎng)速度快、抗病能力強(qiáng)等特點(diǎn)，2013年全世界養(yǎng)殖產(chǎn)量為 419 215 t[4]。斑點(diǎn)叉尾自1984年引入國(guó)內(nèi)后，養(yǎng)殖規(guī)模和產(chǎn)量逐年增加，2013年我國(guó)養(yǎng)殖產(chǎn)量占全世界的一半以上，產(chǎn)量達(dá)224 132 t[5]。隨著我國(guó)斑點(diǎn)叉尾養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，已經(jīng)出現(xiàn)明顯的生長(zhǎng)減慢、體色分化、規(guī)格不齊等種質(zhì)衰退現(xiàn)象[6]；因此，培育生長(zhǎng)快、抗逆性強(qiáng)的斑點(diǎn)叉尾新品種（系）已成為當(dāng)前斑點(diǎn)叉尾產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展亟待解決的重要問(wèn)題。本研究將MSTN基因作為斑點(diǎn)叉尾生長(zhǎng)發(fā)育性狀的候選基因進(jìn)行了SNP多態(tài)性檢測(cè)，并將篩選到的SNP位點(diǎn)與生長(zhǎng)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，旨在為斑點(diǎn)叉尾分子標(biāo)記輔助育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

供試斑點(diǎn)叉尾樣本均來(lái)自江蘇省淡水水產(chǎn)研究所祿口試驗(yàn)基地。于2013年6月進(jìn)行家系培育，為減小環(huán)境對(duì)斑點(diǎn)叉尾生長(zhǎng)的影響，苗種培育按照同一標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，即均一的換水速率、投喂量、養(yǎng)殖密度、充氧量、水溫。待稚魚(yú)日齡為30 d時(shí)，每個(gè)家系隨機(jī)選取300尾于室外水泥池進(jìn)行培育。家系日齡達(dá)到120 d時(shí)，每個(gè)家系隨機(jī)選取50尾魚(yú)注射RFID電子標(biāo)記，并記錄每尾魚(yú)的電子編號(hào)、家系編號(hào)、體質(zhì)量、體長(zhǎng)等信息。標(biāo)記后將魚(yú)移至土池培育，家系平均日齡為520 d時(shí)，掃描并記錄存活個(gè)體編號(hào)，測(cè)量個(gè)體的體質(zhì)量、體長(zhǎng)等信息。同時(shí)采集每尾魚(yú)的尾鰭組織，放入95%乙醇中，于 -20 ℃ 下保存。

1.2 基因組DNA提取

斑點(diǎn)叉尾尾鰭DNA的提取使用UNIQ-10型柱式動(dòng)物基因組DNA抽提試劑盒（上海生工生物工程有限公司），按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取效果，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA樣品濃度。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)公布的斑點(diǎn)叉尾MSTN基因序列（AF396747.1），采用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)2對(duì)引物（表1）。第1對(duì)引物（P1）主要用于擴(kuò)增第一外顯子及5′非編碼區(qū)、第一內(nèi)含子部分序列，第2對(duì)引物（P2）主要用于擴(kuò)增第二外顯子、第二內(nèi)含子、第三外顯子及第一內(nèi)含子、3′非編碼區(qū)部分序列。

1.4 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

隨機(jī)抽取40尾斑點(diǎn)叉尾的DNA樣品，將每個(gè)樣品的質(zhì)量濃度調(diào)整至100 ng/μL ，各取1 μL 混合構(gòu)建DNA池。以DNA池和20尾個(gè)體基因組DNA為模板，利用所設(shè)計(jì)的2對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用即用型UtraTaq酶PCR試劑盒（上海捷瑞生物工程有限公司）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。40 μL PCR反應(yīng)體系為：2×UltraTaq Master Mix試劑20 μL、基因組DNA 2 μL、上游及下游引物（質(zhì)量濃度為10 pmol/μL）各2 μL、ddH2O 14 μL 。采用BIOMETRA T1型PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，利用凝膠成像儀觀察電泳結(jié)果。PCR產(chǎn)物純化后送至生工生物工程（上海）股份有限公司，直接采用ABI 3730XL型測(cè)序儀測(cè)序。所得結(jié)果使用Chromas軟件觀察測(cè)序峰圖，并結(jié)合使用ClustalX軟件進(jìn)行DNA序列比對(duì)，判斷SNP位點(diǎn)的堿基類型。

1.5 SNaPshot法SNP分型

采用SNaPshot法對(duì)4個(gè)家系共176尾魚(yú)進(jìn)行SNP位點(diǎn)分型。根據(jù)SNP位點(diǎn)側(cè)翼序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，使擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為200～500 bp。延伸引物3′端第1個(gè)堿基緊鄰待測(cè)SNP位點(diǎn)，Tm值為50 ℃以上，并且在引物的5′末端加上不同長(zhǎng)度的Poly C或Poly T。

采用Touchdown PCR程序進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，20 μL 反應(yīng)體系為：0.8 μL MgCl2（50 mmol/L）、2 μL 10×PCR buffer（Mg2+ free）、0.5 μL dNTP（10 mmol/L）、0.5 μL混合引物、1 μL 模板DNA、0.5 μL Platinum Taq（5 U），其余用ddH2O補(bǔ)足。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性15 s，60 ℃ 退火15 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；共11個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火溫度降低0.5 ℃；94 ℃變性15 s，54 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共24個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。反應(yīng)完成后進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化，10 μL 反應(yīng)體系為：FastAP（Thermosensitive Alkaline Phosphatase，F(xiàn)ermentas）0.8 μL、ExoⅠ 0.2 μL、ExoⅠ buffer 0.7 μL、PCR產(chǎn)物3 μL、H2O 5.3 μL 。反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min，80 ℃ 15 min，純化后進(jìn)行延伸反應(yīng)，并預(yù)先混勻延伸引物。

SNP分型采用ABI SNaPshot Multiplex PCR試劑盒（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司），6 μL 反應(yīng)體系為：Snapshot Mix 1 μL、延伸引物0.1 μL、多重PCR產(chǎn)物2 μL、ddH2O 2.9 μL 。反應(yīng)條件為：96 ℃預(yù)變性1 min；96 ℃變性10 s，52 ℃退火5 s，60 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后加入1 U FastAP，并以37 ℃ 60 min、85 ℃ 15 min條件進(jìn)行純化。以GeneScan-120Liz Size Standard（ABI）為內(nèi)標(biāo)，取1 μL 產(chǎn)物與9 μL 含有Liz的Hi-Di（GS-120Liz ∶Hi-Di=1 ∶200）混合，95 ℃變性3 min，立即冰浴3 min后上測(cè)序儀。采用ABI PRISM 3730 XI型自動(dòng)遺傳分析系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)及分析，并利用Genemapper v4.1軟件進(jìn)行分型。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

利用R（3.0.1）軟件對(duì)試驗(yàn)斑點(diǎn)叉尾SNP位點(diǎn)的各基因型體質(zhì)量、體長(zhǎng)進(jìn)行方差齊性分析（homogeneity of variance test）和單因素ANOVA（one-way ANOVA）分析。采用均值多重比較（multiple comparisons of means）方法分析SNP位點(diǎn)各基因型與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)程度。統(tǒng)計(jì)分析模型為：

Yij=μ+Gi+eij。

式中：Yij為某個(gè)性狀第i個(gè)標(biāo)記第j個(gè)個(gè)體觀測(cè)值，μ為試驗(yàn)觀測(cè)所有個(gè)體的平均值（即總體平均值），Gi為第i個(gè)標(biāo)記的效應(yīng)值，eij為對(duì)應(yīng)于觀察值的隨機(jī)殘差效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 MSTN基因SNP位點(diǎn)篩選

利用所設(shè)計(jì)的2對(duì)引物對(duì)40尾斑點(diǎn)叉尾構(gòu)建的DNA池及20尾個(gè)體進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序分析。共篩選出4個(gè)SNP位點(diǎn)，即g.3501 T>G、g.3844 T>A、g.4297 C>G、g.4355 G>C，且所有位點(diǎn)均由第2對(duì)引物擴(kuò)增得到。其中，g.3501 T>G位于第一內(nèi)含子；g.3844 T>A位于第二外顯子，密碼子GUA變?yōu)镚AA，氨基酸由纈氨酸（Val）變?yōu)楣劝彼幔℅lu）；g.4297 C>G、g.4355 C>G位于第二內(nèi)含子（圖1）。

2.2 SNP位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)分析

對(duì)斑點(diǎn)叉尾4個(gè)家系176尾魚(yú)的體質(zhì)量和體長(zhǎng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。體質(zhì)量、體長(zhǎng)分別為（280.63±13.21） g、（31.26±0.56） cm。采用R軟件將篩選得到的4個(gè)SNP位點(diǎn)與測(cè)量的斑點(diǎn)叉尾體質(zhì)量、體長(zhǎng)進(jìn)行單因素ANOVA分析，并結(jié)合均值多重比較分析得出，4個(gè)SNPs中的1個(gè)（g.4355 G>C）與斑點(diǎn)叉尾體質(zhì)量、體長(zhǎng)呈顯著性負(fù)相關(guān)（表2）。在SNP位點(diǎn)g.4355 G>C，具有GG基因型個(gè)體的體質(zhì)量、體長(zhǎng)顯著性低于CC型和CG型（P<005）。

3 結(jié)論與討論

MSTN基因具有多種重要功能，它在哺乳動(dòng)物中的主要功能為調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育過(guò)程中肌纖維的數(shù)量，以及抑制肌纖維的生長(zhǎng)[1]。MSTN基因多態(tài)性及其與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析研究最早于哺乳動(dòng)物中進(jìn)行，綿羊、豬、中國(guó)肉牛等[7-11]均已發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)與生長(zhǎng)性狀之間存在相關(guān)性。近年來(lái)，在鯉魚(yú)、羅非魚(yú)、黃顙魚(yú)、圓斑星鰈、鱸魚(yú)、鳙魚(yú)等[3，12-18]重要的水產(chǎn)動(dòng)物中也開(kāi)展了相關(guān)研究。唐永凱等在吉富羅非魚(yú)中篩選到1個(gè)與增質(zhì)量顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)[13]。朱媛媛等、陳校輝等先后對(duì)黃顙魚(yú)MSTN基因進(jìn)行研究，均發(fā)現(xiàn)了造成不同個(gè)體間生長(zhǎng)性狀顯著性差異的SNP位點(diǎn)[14-15]。

本研究在斑點(diǎn)叉尾MSTN基因中共篩選到4個(gè)SNP位點(diǎn)，其中1個(gè)SNP位點(diǎn)位于第二外顯子，其余3個(gè)均位于內(nèi)含子區(qū)域。將篩選到的SNP位點(diǎn)與生長(zhǎng)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明SNP g.4355 C>G與生長(zhǎng)性狀顯著相關(guān)。具有GG型個(gè)體的體質(zhì)量、體長(zhǎng)顯著低于CC型和CG型， GG型個(gè)體的平均體質(zhì)量、平均體長(zhǎng)分別比4個(gè)家系所有個(gè)體體質(zhì)量、體長(zhǎng)的平均值小30%、10%。4個(gè)家系中的個(gè)體以CC型和CG型為主，具有GG型的個(gè)體較少。綜合推測(cè)該位點(diǎn)GG型屬于隱性突變，由于該位點(diǎn)堿基突變?cè)斐蒑STN基因的表達(dá)量升高，進(jìn)而抑制了斑點(diǎn)叉尾的生長(zhǎng)。這種現(xiàn)象也存在于豬[9]、牛[11]、紅鰭東方鲀[3]的研究中。

本研究獲得的與生長(zhǎng)性狀顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)位于內(nèi)含子區(qū)域。盡管內(nèi)含子不具有編碼蛋白質(zhì)的能力，但其發(fā)生單核苷酸突變能夠顯著影響基因的表達(dá)效率。已有研究表明，內(nèi)含子的功能主要為轉(zhuǎn)錄調(diào)控，即在轉(zhuǎn)錄階段對(duì)相應(yīng)的基因進(jìn)行調(diào)控進(jìn)而影響生長(zhǎng)性狀[19]。越來(lái)越多的試驗(yàn)結(jié)果證明，內(nèi)含子在調(diào)控mRNA剪切、轉(zhuǎn)錄、基因表達(dá)方面起著重要作用[20-21]，例如內(nèi)含子長(zhǎng)鏈非編碼RNA（intronic lncRNA）發(fā)生單核苷酸突變將使其調(diào)控的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平發(fā)生改變。然而，本研究中該SNP位點(diǎn)參與調(diào)控MSTN基因功能的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。