高 月 ， 黃 藝

(重慶市北碚區(qū)中醫(yī)院檢驗科，重慶 400700)

ALEX1在乳腺癌中的表達及其臨床意義*

高 月△， 黃 藝

(重慶市北碚區(qū)中醫(yī)院檢驗科，重慶 400700)

目的： 檢測乳腺癌組織中ALEX1的表達水平，明確ALEX1與其臨床病理特征是否具有相關(guān)性。方法: 應(yīng)用real-time PCR、免疫組化方法檢測乳腺癌組織中ALEX1含量。結(jié)果: 乳腺癌組織ALEX1蛋白的表達水平低于癌旁組織(P<0.01)；ALEX1的表達與乳腺癌病理分級、臨床分期和分子分型有關(guān)(P<0.05)，而與病人年齡、腫瘤大小和腫瘤類型無關(guān)。此外，real-time PCR結(jié)果表明，乳腺癌組織中ALEX1的mRNA表達明顯低于對應(yīng)的癌旁組織(P<0.01)。結(jié)論: ALEX1在乳腺癌組織中的表達明顯低于相應(yīng)的癌旁組織，乳腺癌的病理分級、臨床分期越高，ALEX1的表達水平越低。

ALEX1； 乳腺癌； 病理分級； 臨床分期

乳腺癌是常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害女性身心健康。統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示：乳腺癌位居女性惡性腫瘤發(fā)病率的首位，占所有女性新發(fā)惡性腫瘤的29%。而且乳腺癌死亡率位居第2，占死于惡性腫瘤女性的14%[1]。ALEX1作為上皮來源腫瘤中缺失的一種蛋白，在大多數(shù)正常組織中高表達，而在上皮來源的腫瘤如肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、前列腺癌和卵巢癌等組織中低表達或不表達[2]，但在乳腺癌中的表達情況如何，目前仍不清楚。本文運用real-time PCR和免疫組化等技術(shù)檢測乳腺癌臨床標(biāo)本中ALEX1的mRNA和蛋白表達水平，分析ALEX1蛋白表達水平與乳腺癌的病理分級、臨床分期等臨床資料之間的關(guān)系。

材 料 和 方 法

1 材料

乳腺癌組織和同一病例的癌旁組織共62對標(biāo)本，均收集于重慶市腫瘤醫(yī)院。所有標(biāo)本的病理資料見表1。

表1 乳腺癌患者的臨床病理資料

Table 1.Clinicopathological parameters of the breast cancer patients

Parametersn %Age(year) Mean55 Range33～80Agedistribution <501930．6 ≥504369．4Tumortype Ductalcarcinoma5995．2 Lobularcarcinoma34．8Tumorsize(mm) Mean27 Range10～60Sizedistribution(mm) <20 58．1 ≥205791．9Pathologicalgrade 11321 23048．4 31930．6Clinicalstage Ⅰ1625．8 Ⅱ2235．5 Ⅲ2438．7Moleculartype LuminalAsubtype3454．9 LuminalBsubtype1016．1 HER?2overexpressionsubtype1524．2 Basal?likesubtype34．8

2 主要試劑

TRIzol購自Invitrogen；檸檬酸抗原修復(fù)液購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；DAB底物顯色試劑盒、IP細胞裂解液及BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天公司；cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實時熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa；SP9002免疫組化染色試劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；鼠抗人ALEX1單克隆抗體及兔抗人β-actin多克隆抗體購自Santa Cruz。所用引物由TaKaRa設(shè)計合成，具體序列見表2。

3 主要方法

3.1 Real-time PCR實驗 取30 mg組織標(biāo)本液氮研磨后，加入1 mL TRIzol溶液按照操作說明提取總RNA并測定RNA濃度。以1 μg RNA為模板，按照RT-PCR逆轉(zhuǎn)試劑盒操作說明，經(jīng)基因組DNA的去除反應(yīng)和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA；以1 μL cDNA為模板，進行real-time PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為10 μL ，包括SYBR?Premix Ex TaqTMII(2×) 5.0 μL、引物0.2 μL、cDNA 1.0 μL、ddH2O 3.8 μL；反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，40個循環(huán)。

表2 引物序列

F: forward; R: reverse.

3.2 免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)實驗 將切下的小塊乳腺組織于4%的多聚甲醛中浸泡24 h固定、脫水、石蠟包埋及切片。進而烘片、脫蠟、水化、封閉,加 I 抗4 ℃過夜，加 II 抗TBST沖洗 5 min、3次，DAB 顯色、鏡檢。根據(jù)組織的染色強度和染色陽性細胞比例進行量化評分。染色強度評分標(biāo)準(zhǔn)：陰性(-)為0分；弱陽性(1+)為1分；中等陽性(2+)為2分；強陽性(3+)為3分。染色陽性細胞比例評分標(biāo)準(zhǔn)：未染色細胞為0分；染色陽性細胞比例< 10%計1分；染色陽性細胞比例為10%～50%計2分；染色陽性細胞比例>50%計3分?？偡种?染色強度分值+染色陽性細胞比例分值。對量化評分結(jié)果進行統(tǒng)計分析。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件分析。以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示計量資料數(shù)據(jù)，利用t檢驗統(tǒng)計分析；以百分比表示計數(shù)資料數(shù)據(jù)，釆用卡方檢驗進行統(tǒng)計分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 免疫組化檢測ALEX1在乳腺癌組織中的表達

免疫組化染色結(jié)果表明，ALEX1在乳腺癌及癌旁組織中主要定位于胞漿表達；乳腺癌旁組織中ALEX1蛋白的表達水平高于乳腺癌組織中ALEX1的表達，并且在乳腺癌Luminal A型(ER+/HER-2-)組織中ALEX1的表達水平高于乳腺癌人類表皮生長因子受體(human epidemal growth factor receptor, HER)-2過表達型(ER-/HER-2+)。免疫組化評分統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)62例標(biāo)本中49例(79%)乳腺癌組織ALEX1蛋白的表達水平低于配對的癌旁組織(P<0.01)，見圖1、2。

Figure 1.The expression of ALEX1 protein in the breast tissues by IHC (×200).

圖1 免疫組化檢測乳腺組織ALEX1蛋白的表達

Figure 2.The expression of ALEX1 protein in the breast tissues. Mean±SD.n=62.**P<0.01vstumor.

圖2 各乳腺標(biāo)本ALEX1蛋白表達水平的比較

2 Real-time PCR檢測ALEX1在乳腺癌組織中的表達

Real-time PCR檢測30對乳腺組織中ALEX1的mRNA表達情況，結(jié)果顯示在30例標(biāo)本中有20 例(66.7%)乳腺癌組織標(biāo)本ALEX1的mRNA表達量低于其癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖3。

Figure 3.The mRNA expression of ALEX1 in the breast tissues. Mean±SD.n=30.**P<0.01vstumor.

圖3 ALEX1 mRNA 在乳腺癌和癌旁組織中的表達

3 ALEX1的表達水平與乳腺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性

對ALEX1免疫組化染色評分分析發(fā)現(xiàn)，乳腺癌中ALEX1的表達與病理分級、臨床分期、分子分型有關(guān)(P<0.05)，而與病人年齡、腫瘤大小、腫瘤類型無關(guān),見表3。

討 論

乳腺癌是一種常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重影響女性身心健康。自1999年美國國立癌癥研究所提出腫瘤分子分型的概念，使得腫瘤的分類由形態(tài)學(xué)向分子分類轉(zhuǎn)變，這一轉(zhuǎn)變引起學(xué)者們對乳腺癌分子分型的廣泛重視。目前，公認(rèn)的乳腺癌分子分型有5種：luminal A型 (ER+或PR+且HER-2-)、luminal B型 (ER+或PR+且HER-2+)、HER-2過表達型 (ER-，PR-且HER-2+) 和basal-like型 (ER-，PR-且HER-2-)、正常乳腺樣型[3]。

ALEX蛋白家族成員包括ALEX1[2]、ALEX2[4]和ALEX3[5]。生物信息學(xué)研究發(fā)現(xiàn)ALEX1，2，3均位于Xq21.33-q22.2，由一個外顯子編碼453個氨基酸而且N端具有跨膜結(jié)構(gòu)域，還有幾個Arm重復(fù)結(jié)構(gòu)和DUF634(domain of unknown function 634)[2,4-5]。研究發(fā)現(xiàn)Arm蛋白家族參與細胞黏附、早期胚胎形成和腫瘤發(fā)生、發(fā)展等生物學(xué)進程[6]。但有關(guān)ALEX基因的研究報道較少。2009年Mou等[5]發(fā)現(xiàn)ALEX3通過Arm重復(fù)結(jié)構(gòu)與轉(zhuǎn)錄因子SOX10直接作用，改變ALEX3亞細胞定位和轉(zhuǎn)錄活性。除此之外，ALEX3的Arm重復(fù)結(jié)構(gòu)可以編碼線粒體靶定蛋白，Wnt/PKC信號通路能夠通過ALEX3蛋白的降解調(diào)控線粒體的分布[7]?；虮磉_分析顯示ALEX1和ALEX2的mRNA在人類心臟、腦、卵巢、睪丸、前列腺、結(jié)腸等正常組織中高表達，而在肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、前列腺癌和卵巢癌等組織中低表達或不表達；ALEX1的mRNA在骨肉瘤細胞系、膠質(zhì)瘤細胞系中高表達，而在肺癌細胞系、乳腺癌細胞系中低表達[2]。我們的課題組前期工作成果顯示過表達ALEX1能夠抑制MCF-7乳腺癌細胞的增殖并誘導(dǎo)細胞凋亡。其誘導(dǎo)細胞凋亡機制很可能是ALEX1上調(diào)Bax、下調(diào)Bcl-2，進而激活caspase-3，誘導(dǎo)了細胞凋亡[8-9]。這些研究表明ALEX1在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可能作為一種抑癌基因發(fā)揮作用。由于乳腺癌是一種高度異質(zhì)性疾病，具有不同的分子亞型，給治療增加了難度。在中國，乳腺癌的發(fā)病率正呈逐年上升趨勢，并趨于低齡化[10]。因此，明確ALEX1在乳腺組織中表達情況及其與病理分級、臨床分期和分子分型等的關(guān)系，為乳腺癌的的診斷和分子生物治療提供理論依據(jù)。

表3 ALEX1蛋白表達與臨床病理資料的相關(guān)性分析

①: luminal A subtype; ②: luminal B subtype; ③: HER-2 overexpression subtype; ④: Basal-like subtype.

為明確ALEX1在乳腺癌中的表達情況及潛在的臨床價值，我們首先通過免疫組化技術(shù)染色觀察ALEX1在乳腺癌及癌旁組織中的表達情況。結(jié)果顯示ALEX1主要定位于胞漿表達，在乳腺癌中的表達明顯低于癌旁組織。此外，我們利用real-time PCR檢測ALEX1在乳腺癌及癌旁組織中的表達情況。結(jié)果同樣提示乳腺癌組織中ALEX1在mRNA水平表達均低于癌旁組織。這些結(jié)果充分說明ALEX1在乳腺癌中作為抑癌基因發(fā)揮作用。Iseki 等[11]于2012年報道ALEX1基因能夠抑制人直腸癌細胞的克隆形成，其機制可能與ALEX1基因啟動子區(qū)甲基化有關(guān)。說明ALEX1作為抑癌基因在直腸癌中發(fā)揮作用。除此之外，利用缺少P53和過表達MYC的永生化胚胎肝細胞進行小鼠體內(nèi)干擾實驗顯示敲除ALEX1加速肝癌發(fā)展[12]。

進一步分析ALEX1表達水平與臨床病理特征關(guān)系時發(fā)現(xiàn)乳腺癌中ALEX1的表達與病理分級、臨床分期和分子分型有關(guān)，而與病人年齡、腫瘤大小、腫瘤類型無關(guān)。免疫組化染色評分結(jié)果也顯示臨床分期和病理分級越高，ALEX1染色評分下降幅度越大，提示ALEX1可能是乳腺癌惡性程度的一個重要標(biāo)志。針對我們收集的62例乳腺臨床標(biāo)本進行資料統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)乳腺癌的發(fā)病年齡在33～80歲之間，平均年齡55歲，<50歲的患者占30%，說明我國乳腺癌的發(fā)病正呈低齡化趨勢發(fā)展。我們還發(fā)現(xiàn)在乳腺癌的分子分型中其中l(wèi)uminal A型和HER-2過表達型發(fā)病率偏高，分別為55%和24%，與文獻[13-14]報道luminal A型發(fā)病率占乳腺癌的50%～70%和HER-2過表達型占乳腺癌的15%～20%基本一致。Luminal A型以ER+或/和PR+及HER-2-為特征，是乳腺癌最為常見的類型，較其它亞型預(yù)后最好[14]。正常情況下，乳腺存在孕激素受體(estrogen receptor,ER)和雌激素受體，當(dāng)乳腺上皮發(fā)生癌變時，雌、孕激素受體(progesterone receptor,PR)缺失。如果在乳腺癌組織中這2種受體仍存在，說明該腫瘤能夠受內(nèi)分泌調(diào)節(jié)，內(nèi)分泌治療有效，預(yù)后效果較好。對于luminal A型治療目前仍推薦單用內(nèi)分泌治療。而HER-2過表達型以ER-和PR-/HER-2+為特征，容易出現(xiàn)腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，總生存率最差[15],對內(nèi)分泌治療不敏感，而化療與生物靶向藥物聯(lián)合應(yīng)用治療較為普遍。文獻報道，ER和PR均陽性的乳腺癌患者，術(shù)后采取內(nèi)分泌治療有效率達到80%；而ER和PR均陰性的患者，術(shù)后內(nèi)分泌治療有效率不到10%，說明內(nèi)分泌治療的療效與ER和PR狀況有關(guān)[15]。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)ALEX1免疫組化染色評分在luminal A型乳腺癌組織中高于HER-2過表達型，說明luminal A型中ALEX1的蛋白表達水平高于HER-2過表達型，提示ALEX1的表達很可能與ER和PR表達呈正相關(guān)而與HER-2的表達呈負相關(guān)。在其它分子類型中ALEX1的表達卻沒發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計學(xué)顯著性。這一結(jié)果表明在乳腺癌中ALEX1的表達與激素受體的表達密切相關(guān)。目前, 乳腺癌的治療已進入針對分子亞型的個體化治療階段，對ALEX1基因功能和生物機制的透徹研究勢必為乳腺癌的內(nèi)分泌治療及分子靶向治療提供理論依據(jù)及指導(dǎo)作用。

由于本研究中收集的乳腺癌臨床標(biāo)本數(shù)量有限，而且缺少乳腺癌患者預(yù)后資料，故對ALEX1與臨床相關(guān)的研究還需要進一步完善。對此部分中涉及的臨床標(biāo)本收集及檢測工作仍在進行中。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

Expression of ALEX1 in breast cancer and its clinical significance

GAO Yue, HUANG Yi

(DepartmentofClinicalLaboratory,TheChineseTraditionalMedicineHospitalofBeibeiDistrict,Chongqing400700,China.E-mail:moon19740000@163.com)

AIM: To detect the expression of ALEX1 in the breast cancer tissues in order to verify whether ALEX1 has correlation with clinical pathological features in breast cancer. METHODS: Real-time PCR and immmunohistochemistry were applied to detect the expression of ALEX1 at mRNA and protein levels in the breast tissues. The statistical analysis were performed for determining the correlation with the level of ALEX1 and the clinical pathological features in breast cancer. RESULTS: The protein levels of ALEX1 in the breast cancer tissues were lower than that in the non-breast cancer tissues (P<0.01). The expression of ALEX1 had correlations with pathological grade, clinical stage, molecular type (P<0.05) but had no correlation with the patients’ age, tumor size and tumor types in breast cancer. Furthermore, the result of real-time PCR showed that mRNA expression of ALEX1 was also significantly reduced in the breast cancer tissues (P<0.01). CONCLUSION: The expression of ALEX1 in the breast cancer tissues is lower than that in non-breast cancer tissues. The pathological grade and clinical stage in breast cancer are negatively correlated with the expression of ALEX1.

ALEX1; Breast cancer; Pathological grade; Clinical stage

1000- 4718(2017)02- 0353- 05

2016- 07- 22

2016- 10- 09

遼寧省科技廳項目(No. 2015020353)

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.02.026

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