超高效液相色譜串聯(lián)質譜法鑒定豬肉的特異性肽生物標志物

周廣運　王桂姬　任皓威　蘆乾　楊艷　郭立?！?/p>

摘要以親緣關系較近的豬、牛和羊3個物種的肌肉組織為研究對象，采用超高效液相色譜串聯(lián)質譜（UPLCMS），篩選并確認了豬物種肉特異性肽生物標志物。3種純肉樣品經蛋白質提取、胰蛋白酶消化和UPLCTripleTOFMS分離鑒定，得到的總離子流圖譜（TIC）與Uniprot蛋白質數(shù)據(jù)庫對比分析，篩選出3個物種肉的3種高豐度同源蛋白和8種潛在的肽生物標志物； 潛在的肽生物標志物經QTRAPMS質譜的多反應模式（MRM）分析，最終確認了豬物種肉的5種肽生物標志物，其中3種肽生物標志物未見文獻報道。

關鍵詞豬肉； 超高效液相色譜串聯(lián)質譜； 多反應監(jiān)控； 肽生物標志物

1引 言

肉品摻假已成為全世界普遍存在的問題，用低價的肉代替高價的肉是肉品摻假的主要方式，牛肉和羊肉作為價格高的肉類，常用豬肉摻假。這不僅侵犯了消費者的合法權益，而且還沖擊了宗教信仰[1]，造成嚴重的社會問題。目前，基于核酸與蛋白質的檢測方法已廣泛應用于肉制品的摻假鑒定，包括PCR技術[2～4]和免疫學方法（如ELISA等）[5]。與PCR技術相比較，基于蛋白質的肉品摻假鑒定方法具有獨特的優(yōu)勢。首先，蛋白質的一級結構在高度加工條件下相對穩(wěn)定[6]，肉品經加工處理后，仍能觀察到部分蛋白質的氨基酸序列[7]，而DNA在高度加工或者頻繁處理的肉類樣品中，很容易導致降解[8]。其次，蛋白質具有更高的組織特異性，而DNA在同一個體不同組織之間沒有差別[9]。然而，以蛋白質為基礎的ELISA方法也存在著自身的劣勢，每個ELISA反應只能檢測單一的物種，無法實現(xiàn)多個物種的同時檢測。

采用質譜方法鑒定和分析不同物種的蛋白質來檢測肉品摻假，方法簡單、準確、可靠，近年來已成為肉品摻假鑒定的主要方法。Taylor等[10]最先將質譜方法應用于肉制品的摻假鑒定。隨著蛋白質組學的發(fā)展，基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDITOFMS）結合電泳或者高效液相色譜技術可用于研究肉品摻假鑒定[11，12]，但存在費時、費力和操作復雜等缺點。高通量和高分辨率質譜技術，結合蛋白質數(shù)據(jù)庫分析的技術[13～15]，是目前檢測肉品摻假的研究熱點。在中國東北地區(qū)，牛羊肉火鍋和燒烤較為常見，由于豬肉價格相對較低且容易獲得，常用豬肉來摻假牛羊肉。三元雜交豬是中國東北地區(qū)最主要的豬肉品種，關于它的肌肉蛋白質組學研究較少； 另外，由于豬的種屬和生長環(huán)境的不同，可能會導致不同地區(qū)或不同品種的豬肉，在蛋白質表達方面存在差異。本研究首先使用高分辨率、高掃描速度的飛行時間質譜（Triple TOFMS）對3種純肉樣品中的全蛋白和多肽進行了分離鑒定，通過檢索Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫，篩選出豬物種肉的潛在肽生物標志物； 采用三重四極桿質譜，在多反應監(jiān)控（MRM）模式下進一步分析潛在的肽生物標志物，最終確認了豬物種肉的5種特異性肽生物標志物，其中3種肽生物標志物未見文獻報道。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀（美國Waters公司）； TripleTOF 5600飛行時間質譜儀、ExionLC AD超高效液相色譜儀、QTRAP 4500三重四極桿質譜儀（美國Sciex公司）； TGL16臺式高速冷凍離心機（湖南長沙湘儀離心機儀器有限公司）； 恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司） 。

3[3（膽酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸內鹽（CHAPS）、二硫蘇糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAA）、尿素、色譜純的甲酸、甲醇和乙腈（美國Sigma公司）； 測序級胰蛋白酶（美國Promega公司）。其它試劑均為分析純； 實驗用水為超純水。

2.2實驗方法

2.2.1樣品的采集本研究中的牛肉、羊肉和豬肉3種純肉樣品，均購買于哈爾濱市某大型超市和正規(guī)的商業(yè)屠宰場，剔除肉樣品中的脂肪組織和結締組織，剩余的瘦肉樣品被分割成小塊

2.2.2蛋白質的提取用研缽將各肉類組織在液氮中充分碾碎，稱取約2 g的不同碎肉樣品于離心管中，各加入1 mL蛋白質提取液（8 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4% （w/V） CHAPS）充分振蕩， 12000 r/min離心20 min，取上清液備用。蛋白濃度采用Bradford法分析測定。

2.2.3蛋白質的消化取200 μg蛋白溶液于離心管中，加入DTT溶液，56 ℃反應1 h，冷卻至室溫，再加入IAA溶液，室溫條件下避光反應30 min，完成還原烷基化過程； 將溶液轉移至超濾管（截留分子量為10 K）中，離心除去過量的DTT、IAA和部分雜質，并用NH4HCO3溶液洗3次； 向超濾管中加入100 μL含有3 μg 測序級胰蛋白酶，37 ℃條件下振蕩反應過夜，離心收集溶液。

2.2.4豬潛在肽生物標志物的找尋采用超高效液相色譜串聯(lián)飛行時間質譜對消化后的多肽樣品進行分析鑒定。采用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm × 2.1 mm，1.7 μm， Waters公司），ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀，流動相A為0.1%甲酸，流動相B為0.1%甲酸乙腈，流速為0.3 mL/min， 梯度洗脫條件為：0～40 min，5%～35% B； 40～55 min，35%～100% B； 55～55.1 min，100%～5% B； 55.1～60 min，5% B。

質譜分析采用TripleTOF 5600飛行時間質譜儀，離子源為ESI源，離子源的電離電壓和溫度分別設定為5500 V和550 ℃。所有多肽樣品均在正離子模式狀態(tài)下掃描，質量掃描范圍m/z 100～1500之間。每個樣品重復掃描兩次。

使用ProteinPilot （Version 5.0，SCIEX）軟件，進行數(shù)據(jù)分析和豬潛在肽生物標志物的找尋。

2.2.5質譜多反應監(jiān)控（MRM）確認豬的肽生物標志物采用Exion LC AD超高效液相色譜串聯(lián)QTRAP 4500質譜建立多反應監(jiān)控檢測方法。液相色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18（50 mm × 2.1 mm，1.7 μm， Waters公司）柱，柱溫為40 ℃，流動相A為0.1%甲酸，流動相相為0.1%甲酸乙腈，流速為0.4 mL/min，梯度洗脫條件為：0～1 min， 5%～10% B； 1～15 min，10%～35% B； 15～16 min，35%～90% B； 16～18 min，90% B； 18～18.1 min，90%～5% B； 18.1～22 min，5% B。質譜系統(tǒng)使用Turbo V的電噴霧離子源（ESI），離子源溫度為550 ℃，噴霧電壓為5500 V。

使用Skyline工具構建所有潛在肽生物標志物的MRM 離子對，采用Analyst軟件（Version 1.6.2，SCIEX）進行數(shù)據(jù)分析。

3結果與討論

3.1同源蛋白分析

同源蛋白是指氨基酸序列具有明顯的相似性，在不同生物體或同一機體內行使相同或相似功能的一類蛋白質。同源蛋白的發(fā)現(xiàn)是鑒定特異性肽生物標志物的基礎，肽生物標志物的穩(wěn)定性與同源蛋白豐度有關。在本研究中，豬肉、牛肉和羊肉的3種多肽樣品經LCTripleTOFMS質譜鑒定，得到每個物種的總離子流（TIC）圖譜，經ProteinPilot軟件與UniProt 蛋白數(shù)據(jù)庫對比分析，最終得到豬、牛和羊3個物種肉的高豐度同源蛋白質信息見表1。

采用本研究開發(fā)的檢測方法，每種肉可以檢測到500～700種蛋白質，這與von Bargen等[14]的報道結果一致，但與Sarah等[19]的研究結果相比，本研究鑒定到的蛋白質數(shù)量明顯增加。通過詳細比較和篩選3種動物物種肉的所有蛋白質，最終篩選出3種動物物種肉的同源蛋白。同時，為了提高實驗的可靠性，排除了同源蛋白質中的低豐度蛋白（按照蛋白質豐度排序，序列號60以后的蛋白質）。由于不是所有的同源蛋白質中都含有特異性的肽生物標志物，為了減少數(shù)據(jù)的復雜性，提前排除了不含有潛在肽生物標志物的同源蛋白。最終，確定了3個動物物種中的3種高豐度同源蛋白質（按照蛋白質豐度排序，序列號60之前的蛋白質），詳細信息見表1。在高豐度同源蛋白信息中，肌紅蛋白（Myoglobin） 和3磷酸甘油醛脫氫酶（Glyceraldehyde3phosphate dehydrogenase）已被報道用于肉品摻假的鑒別[16～18]。但未有線粒體三功能酶α亞基（Trifunctional enzyme subunit alpha， mitochondrial）用于肉類摻假的報道，為本研究新發(fā)現(xiàn)的高豐度同源蛋白，此酶在線粒體中主要參與脂肪酸的β氧化和脂質代謝，在豬肉組織中有較高的豐度，這可能與該蛋白在三元雜交豬中的高表達有關。

3.2豬物種肉潛在肽生物標志物的找尋

豬物種肉潛在肽生物標志物是指該多肽序列僅特異性的存在于豬物種肉中，而在本研究中的其它物種（牛和羊）中不存在，并且這些特異性的肽段所對應的蛋白質是3個動物物種中的高豐度同源蛋白。同時，為了進一步確認肽段的特異性，將篩選到的豬物種肉特異性肽段在NCBI網站進行Blast分析，即這些特異性肽段的氨基酸序列不能與牛和羊物種的氨基酸序列完全匹配[7，19]。詳細的豬潛在肽生物標志物信息見表2。

由表2可見，利用本方法最終篩選出豬物種肉的8個潛在肽生物標志物，其中包括文獻已經報道過的多肽序列GHHEAELTPLAQSHATK[16，20]和WGDAGATYVVESTGVFTTMEK[18]。而線粒體三功能酶α亞基（Trifunctional enzyme subunit alpha， mitochondrial）蛋白，作為新發(fā)現(xiàn)的同源蛋白，包含6種潛在肽生物標志物，未見報道。在篩選豬物種肉潛在肽生物標志物時，及時排除了高豐度同源蛋白質中可信度（ProteinPilot軟件自動給出）小于95%的肽段，增加了潛在肽生物標志物的可靠性。另外，不同的胰蛋白酶酶切效率不同，常會出現(xiàn)誤切和漏切等現(xiàn)象[21]，在篩選肽生物標志物時，應及時排除出現(xiàn)天冬酰胺脫酰胺、谷氨酸N末端環(huán)化、甲基化和磷酸化等不穩(wěn)定存在的肽段。

3.3多反應監(jiān)控模式下對豬潛在肽生物標志物的確認

通過數(shù)據(jù)庫檢索的方式篩選到的豬物種肉潛在肽生物標志物，須經過質譜多反應監(jiān)控（MRM）的進一步驗證，以確認肽生物標志物的特異性。Skyline工具會自動生成目標肽段的母離子和可能的子離子，在眾多的母離子和子離子對中，選擇轉換最為激烈的6對母離子和子離子，作為MRM的特異性驗證離子[14～16]。根據(jù)同一肽的MRM離子對具有相同的保留時間，判斷潛在肽生物標志物的特異性。圖1顯示了多肽序列WGDAGATYVVESTGVFTTMEK在3個物種前15 min的提取離子流色譜圖（XIC），圖1中的峰是由一個或者多個具有相同的母離子轉換得到的子離子形成的峰簇（見圖2、圖3）。由圖1可見，在豬物種肉的提取離子流色譜圖中，7.62和9.87 min出現(xiàn)兩個峰，結合牛和羊物種的提取離子流色譜圖，可以確認7.62 min的低強度峰為豬物種肉的非特異性峰，而9.87 min的峰為豬物種肉的特異性峰。為了進一步證明9.87 min的峰為豬物種肉的特異性峰，分析了7.62 min和9.87 min的峰。

本研究最終篩選并確認了豬物種肉的5種肽生物標志物。其中肽生物標志物TVLGAPEVLLGILPGAGGTQR、ADMVIEAVFEELSLK和FAGGNLDVLK未見報道。本研究中未針對特定蛋白質進行分析，而是采用了高分辨率、高掃描速度的質譜對3個物種肉中的全蛋白進行了分析鑒定，極大豐富了分析結果中的蛋白質和多肽的信息。同時，也增加了質譜測定結果中的同源蛋白質和肽生物標志物的數(shù)量。另外，由于三元雜交豬的種屬和生長環(huán)境的不同，可能導致了某些蛋白質在肌肉中的含量有所差異，也影響到了肽生物標志物的數(shù)量。新發(fā)現(xiàn)的肽生物標志物可能與三元雜交豬的品種特異性有關，這需要后續(xù)的研究進行驗證。表3給出了豬物種肉肽生物標志物的母離子、子離子和肽生物標志物在MRM實驗中具體的保留時間。

4結 論

本研究采用TripleTOFMS系統(tǒng)篩選出3個物種肉的3種高豐度同源蛋白和8種潛在的肽生物標志物； 利用QTRAPMS系統(tǒng)建立的MRM方法，最終確認了豬物種肉的5種肽生物標志物，其中2種肽生物標志物與之前的報道相符，而肽生物標志物TVLGAPEVLLGILPGAGGTQR、ADMVIEAVFEELSLK和FAGGNLDVLK未見文獻報道。液相色譜質譜聯(lián)用（LCMS）技術作為肉品摻假鑒定新方法，具有廣闊的發(fā)展空間。本方法可為后續(xù)混合肉中豬肉成分的定量分析以及豬物種肉檢測的商業(yè)ELISA試劑盒的開發(fā)提供了實驗基礎。

AbstractThe samples of muscular tissue from pork， beef and lamb which were closely related in the genetic relationship were analyzed by ultra performance liquid chromatographytandem mass spectrometric （UPLCMS） technique. The specific peptide biomarkers of pig meat species were found and confirmed. Proteins from three pure meat samples were extracted and digested using trypsin， the digested proteins were identified by UPLCtriple timeofflight （TOF）MS， and the total ion chromatogram （TIC） was searched and analyzed against the UniProt database. Three high abundant homologous proteins of three species and 8 potential peptide biomarkers of pork were found. A multiple reaction monitoring （MRM） QTRAPMS method was established to confirm the specificity of potential peptide biomarkers. As a result， five peptide biomarkers of pig species meat were confirmed， three of which were not reported.

KeywordsPork； Ultra performance liquid chromatographytandem mass spectrometry； Multiple reaction monitoring； Peptide biomarkers