菠蘿葉提取物黏附漂浮微丸的制備及評價(jià)

何亞麗+黎迎+楊丹丹+朱春燕

[摘要]采用擠出滾圓法，以殼聚糖為骨架黏附材料，十八醇為漂浮材料，制備菠蘿葉提取物（Bolo leaf phenols，BLP）黏附漂浮微丸，評價(jià)其體外黏附性、漂浮性及體內(nèi)滯留情況，并考察藥物的體外釋放特性。通過體外組織留存量法和直接觀察法分別評價(jià)微丸的體外黏附性和漂浮性；采用體內(nèi)組織留存量法和小動(dòng)物活體成像法考察微丸在大鼠體內(nèi)的滯留情況；對微丸中指標(biāo)成分對香豆酸和咖啡酸的體外釋放情況進(jìn)行評價(jià)。結(jié)果顯示，制備的黏附漂浮微丸體外黏附性達(dá)（732±34）%，在人工胃液中可立即起漂，持續(xù)漂浮時(shí)間在12 h以上；黏附漂浮微丸在大鼠胃內(nèi)6 h時(shí)滯留率達(dá)40%以上，而普通參比微丸胃滯留率低于15%，兩者相比，滯留效果具有顯著性差異（P<001）；藥物體外釋放時(shí)間可達(dá)6 h以上，體外釋藥機(jī)制符合Higuchi方程。體內(nèi)、外研究表明，制備的BLP黏附漂浮微丸具有良好的胃滯留效果和緩釋特性。

[關(guān)鍵詞]BLP黏附漂浮微丸； 組織留存量； 小動(dòng)物活體成像； 體外釋放； 緩釋

菠蘿葉提取物（Bolo leaf phenols，BLP），含有30%～80%的總酚性成分，其中對香豆酸（pCA）和咖啡酸（CA）為主要指標(biāo)成分[15]。BLP具有明確的抗氧化和調(diào)血脂作用[67]，其主要成分對香豆酸體內(nèi)半衰期t1/2β為0587 h[8]，且對小鼠無明顯生殖毒性[9]?；贐LP的藥理活性，具有開發(fā)為臨床藥物的良好前景。

課題組前期對BLP的理化性質(zhì)和吸收部位的研究表明，BLP在胃和小腸腸段的生理pH下穩(wěn)定，在胃腸道吸收窗較長，且在酸性條件下脂溶性好，吸收較好[1011]。本研究應(yīng)用胃滯留給藥系統(tǒng)，采用擠出滾圓法制備殼聚糖黏附漂浮微丸，通過對微丸體外黏附性、漂浮性和體內(nèi)滯留情況的考察，評價(jià)微丸的胃內(nèi)滯留效果；通過微丸體外釋藥情況，考察微丸的體外釋藥機(jī)制。本研究旨在延長藥物在胃部的滯留時(shí)間，促進(jìn)藥物的吸收，改善生物利用度。

1材料

11藥物與試劑

BLP（清華大學(xué)杜立軍教授實(shí)驗(yàn)室提供，批號110801）；BLP黏附漂浮微丸（自制，批號20160312）；對香豆酸對照品（pCA，美國Sigma公司，批號1001108036）；咖啡酸對照品（CA，美國Sigma公司，批號2063612）；殼聚糖（CTS，美國Sigma公司，CAS9012764）；微晶纖維PH101（MCC，日本旭日化成公司）；羥丙基甲基纖維素（HPMC K4M，美國卡樂康）；十八醇（北京化學(xué)試劑公司）；甲醇、乙腈（美國Fisher公司，色譜級）；DIR熒光染料（美國Invitrogen公司）；其余試劑、試藥均為分析純。

12儀器

島津高效液相色譜儀（LC10AT泵，SPD10AVP紫外檢測器）；CTO10ASV柱溫箱；小動(dòng)物活體成像儀（美國IVIS Spectrum）；擠出滾圓機(jī)（英國Caleva公司）；盤式干燥烘箱（英國Caleva公司）；電熱恒溫水浴鍋（HHSY11Ni2B，北京長風(fēng)儀器儀表公司）；攪拌機(jī)（北京中興柏翠電器有限公司）；Sartorius BSA 224SCW型天平。

13動(dòng)物

SD大鼠，雄性，體重（220±20） g，北京市維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號SDXK （京） 20150001。

2方法與結(jié)果

21微丸的制備

按處方稱取主藥和輔料，過80目篩，加黏合劑不斷捏合，制成軟材。經(jīng)擠出機(jī)篩板（孔徑 07 mm） 以35 r·min-1的轉(zhuǎn)速擠成直徑相同、光滑致密的條狀物； 將條狀物置于滾圓機(jī)（孔徑 07 mm） 內(nèi)，以1 300 r·min-1的速度滾圓10 min，直至滾制成丸；取出微丸，50 ℃干燥4 h，過40目篩，制得所需微丸。

22體外黏附性考察

取新鮮離體大鼠胃，用01 mol·L-1鹽酸將胃內(nèi)壁沖洗干凈，固定在玻璃片上，精密稱取微丸約500 mg，均勻置于胃組織上。在相對濕度為925%的恒濕密閉容器中放置20 min充分水化后，將玻片傾斜45°放置，調(diào)節(jié)蠕動(dòng)泵流速為20 mL·min-1，用01 mol·L-1鹽酸100 mL沖洗。沖洗液收集于已知質(zhì)量的燒杯中，70 ℃烘干，稱重[1114]。微丸體外黏附百分率=M-（G-g-m）/M×100%。式中M為加入微丸的量；g為空燒杯重；G為燒杯與烘干后殘?jiān)傊兀籱為同體積沖洗液所含固體物質(zhì)的量（空白對照）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，制備的黏附漂浮微丸體外黏附性達(dá)（732±34）%，體外生物黏附性良好。

23體外漂浮性考察

稱取微丸約300 mg，置于100 mL，（370±05） ℃的01 mol·L-1 HCl溶液中，直接觀察微丸的起漂和持續(xù)漂浮時(shí)間[1517]。結(jié)果表明，制備的黏附漂浮微丸，在人工胃液中可立即起漂，持漂時(shí)間在12 h以上，具有良好的體外漂浮性。

24體內(nèi)滯留性考察

241體內(nèi)組織留存量法取健康SD大鼠，禁食不禁水24 h，隨機(jī)分2組，一組胃插管灌服黏附漂浮微丸，另一組灌服普通參比微丸，給藥量400 mg·kg-1。于給藥后1，2，4，6，8，10，12 h時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，取出大鼠胃部，沿胃大彎方向從賁門到幽門處剪開直接觀察胃內(nèi)有無微丸滯留，并拍攝觀察到的微丸胃內(nèi)滯留現(xiàn)狀，見圖1。通過觀察得出，制備的黏附漂浮微丸在6 h時(shí)仍有大量滯留于胃內(nèi)，而普通參比微丸在4 h時(shí)已大量從胃內(nèi)排空；表明制備的黏附漂浮微丸具有胃滯留的效果。

用01 mol·L-1鹽酸100 mL沖洗并收集胃內(nèi)滯留微丸，用烘箱70 ℃烘干，稱重記錄各時(shí)間點(diǎn)胃

254藥物釋放模型的擬合分別用零級，一級，Higuchi和RitgerPeppas方程對BLP黏附漂浮微丸中指標(biāo)成分對香豆酸和咖啡酸的體外釋藥曲線進(jìn)行擬合，見表1，2。結(jié)果顯示，BLP黏附漂浮微丸中對香豆酸和咖啡酸的釋放曲線經(jīng)Higuchi方程擬合相關(guān)性最好，表明藥物的釋藥機(jī)制以Fick′s骨架型擴(kuò)散為主，即藥物首先溶解通過殼聚糖骨架材料擴(kuò)散到骨架外表面，再擴(kuò)散到釋放介質(zhì)中，起到緩釋的效果。

3討論

課題組前期對BLP理化性質(zhì)和吸收部位的考察表明，其在胃腸道吸收窗較長，酸性條件下穩(wěn)定且吸收良好，但由于人體在正常情況下胃排空的時(shí)間僅為 15～2 h[21]，因此藥物的胃滯留時(shí)間非常短，所以本研究設(shè)計(jì)應(yīng)用胃滯留給藥系統(tǒng)，使藥物較長時(shí)間滯留于胃液中，延長藥物釋放時(shí)間，改善藥物吸收，從而提高藥物生物利用度。有文獻(xiàn)報(bào)道指出，在胃酸條件下有較好溶出或胃腸上端吸收良好的藥物，尤為適用于胃黏附漂浮協(xié)同型胃滯留給藥系統(tǒng)[22]，因此本研究設(shè)計(jì)將藥物制成胃黏附漂浮型微丸。從劑型角度，微丸這種多單元?jiǎng)┬?，其在胃?nèi)分布均勻一致，不僅避免了胃排空中的“全無”或“全有”造成的個(gè)體差異性，而且與片劑、膠囊劑等單元?jiǎng)┬拖啾缺苊鈫卧到y(tǒng)控制不好時(shí)引起藥物的突釋或釋放不完全[23]。

研究表明[2425]，殼聚糖具有促進(jìn)藥物吸收的作用?；跉ぞ厶橇己玫纳镳じ叫院宛つの沾龠M(jìn)性及在酸性條件下易溶解的性質(zhì)，并結(jié)合課題組前期對藥物BLP性質(zhì)的研究，在處方考察中主要應(yīng)用殼聚糖為骨架材料制備微丸。對制備的微丸從體外

黏附性、漂浮性、體內(nèi)滯留效果、體外釋放等方面進(jìn)行了評價(jià)，得出制備的微丸達(dá)到了預(yù)期的胃滯留的效果。本研究應(yīng)用生理解剖學(xué)方法考察胃內(nèi)微丸留存量；并采用先進(jìn)的小動(dòng)物活體成像技術(shù)，通過觀察活體動(dòng)物體內(nèi)熒光分布，快速、有效評價(jià)微丸胃內(nèi)滯留效果，建立了微丸體內(nèi)胃滯留效果的評價(jià)方法。

應(yīng)用生理解剖學(xué)方法，對大鼠胃內(nèi)給藥微丸的滯留量進(jìn)行定量分析得出，黏附漂浮微丸在6 h時(shí)仍有40%以上的滯留，而普通參比微丸6 h時(shí)滯留量不足15%，兩者相比，胃滯留效果具有顯著性差異（P<001）。應(yīng)用小動(dòng)物活體成像技術(shù)對活體大鼠胃內(nèi)微丸滯留效果進(jìn)行評價(jià)發(fā)現(xiàn)，制備的黏附漂浮微丸在胃內(nèi)6 h時(shí)仍有熒光分布，而普通參比微丸胃部已無熒光分布，對比差異明顯，與體內(nèi)胃組織微丸留存量考察結(jié)果具有一致性，證明制備的BLP黏附漂浮微丸具有胃滯留的效果，在胃內(nèi)滯留時(shí)間可達(dá)6 h以上。

BLP黏附漂浮微丸中對香豆酸和咖啡酸的釋放曲線經(jīng)Higuchi方程擬合相關(guān)性最好，表明BLP黏附漂浮微丸中藥物的釋藥機(jī)制以Fick′s骨架型擴(kuò)散為主，即藥物首先溶解通過殼聚糖骨架材料擴(kuò)散到骨架外表面，再擴(kuò)散到釋放介質(zhì)中，起到緩釋的效果，體外釋放時(shí)間可達(dá)6 h以上。通過小動(dòng)物活體成像評價(jià)的微丸體內(nèi)滯留時(shí)間達(dá)6 h以上，結(jié)果表明微丸的滯留效果與體外釋放時(shí)間具有一致性。因此將藥物制成黏附漂浮微丸，延長藥物在胃腸道的滯留時(shí)間?？梢愿纳扑幬锏奈?。

胃滯留制劑作為一代新型的緩、控釋制劑，近年國內(nèi)外學(xué)者對新型胃滯留給藥系統(tǒng)的研究正不斷地深人和加強(qiáng)，但目前對胃滯留給藥系統(tǒng)的體內(nèi)動(dòng)力學(xué)過程、體內(nèi)滯留評價(jià)等方面研究尚不夠深人，缺乏適宜的體內(nèi)外評價(jià)手段和方法。本研究結(jié)合胃黏附制劑和胃漂浮制劑的特點(diǎn)成功制備了具有胃腸道滯留效果的BLP黏附漂浮微丸，是對該藥物在中藥制劑領(lǐng)域的嘗試。本研究探索性的應(yīng)用生理解剖學(xué)結(jié)合當(dāng)前先進(jìn)的小動(dòng)物活體成像技術(shù)，建立了較完善的微丸體內(nèi)胃滯留評價(jià)方法，并對制備的BLP黏附漂浮微丸體內(nèi)胃滯留效果做出了評價(jià)。結(jié)果表明，本研究所制備的BLP黏附漂浮微丸在胃內(nèi)可滯留6 h以上，具有良好的胃滯留效果。在體外的釋放研究中，微丸的釋藥特性表明具有制備的微丸具有緩釋效果。由以上研究，預(yù)測本實(shí)驗(yàn)制備的BLP黏附漂浮微丸可以長時(shí)間滯留于胃腸道而維持藥物的持續(xù)釋放，從而促進(jìn)BLP的吸收，提高BLP的生物利用度。由于對藥物在體內(nèi)的具體吸收情況尚不能明確，因此本研究將進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)，探究自制的BLP黏附漂浮微丸的體內(nèi)吸收情況，并以原料藥為參比，對比藥物體內(nèi)生物利用度差異，考察制備的BLP黏附漂浮微丸是否達(dá)到了研究的預(yù)期效果。

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