霍山石斛糖蛋白的分離純化和毒活性研究

鄧輝+陳乃東+戴軍+陳乃富

[摘要]霍山石斛是名貴中藥材，其多糖的抗腫瘤活性是中藥資源領(lǐng)域的研究熱點，該研究旨在探究霍山石斛多糖抗腫瘤活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。實驗以霍山石斛為原料，通過低鹽溶液浸提和硫酸銨分級沉淀得到不同的霍山石斛蛋白組分，經(jīng)SDSPAGE電泳染色確定糖蛋白組分，再經(jīng)DEAE離子柱和Sephadex凝膠柱進(jìn)一步分離純化糖蛋白組分，同時采用MTT比色法檢測不同產(chǎn)物對人肝癌細(xì)胞HepG2的毒活性；結(jié)果獲得3種相對分子質(zhì)量為225，198，156 kDa 的糖蛋白組分RG1，RG2，RG3，測得三者復(fù)合物對HepG2的IC50為53423 mg· L-1，而組分RG1，RG2的IC50分別為43296，41391 mg· L-1，組分RG3對HepG2無毒活性?？傊瑢嶒灲Y(jié)果提示霍山石斛多糖抗腫瘤活性的物質(zhì)基礎(chǔ)之一是相對分子質(zhì)量為225，198 kDa的2種糖蛋白組分，且具有協(xié)同效用。

[關(guān)鍵詞]抗腫瘤活性； 霍山石斛； 糖蛋白； 細(xì)胞毒活性

蘭科植物霍山石斛Dendrobium huoshanense Tang et Cheng，局限分布于安徽省霍山縣及鄰近地區(qū)，其炮制后的干品名為霍斗或金霍斗[1]，霍山石斛的功效作用一直為明、清本草詳細(xì)記載，具有益精強陰、保肝養(yǎng)胃、生津止渴、補虛贏、輕身延年等功效[2]，從 20 世紀(jì) 50 年代末開始，國內(nèi)科研人員開始霍山石斛資源保護(hù)、可持續(xù)開發(fā)利用等方面研究，取得了一系列成果，特別是其顯著的抗癌功效吸引著國內(nèi)學(xué)者對其開展了大量科學(xué)研究[36]。

多糖以2種方式發(fā)揮抗腫瘤的活性：一種方式是通過增強機體免疫力進(jìn)而激活免疫系統(tǒng)引起腫瘤細(xì)胞凋亡[714]；另一種方式是直接以其細(xì)胞毒活性而殺傷腫瘤細(xì)胞[1520]。但目前多糖的抗腫瘤活性的研究只限于分離提純后的多糖組分的藥理藥效實驗，尚無確切的證據(jù)證明和解釋多糖對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性的具體物質(zhì)基礎(chǔ)及結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[2123]。

霍山石斛多糖具有抗腫瘤活性，那么其基礎(chǔ)活性物質(zhì)到底是什么？本團(tuán)隊在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，采用水提醇沉提取霍山石斛粗多糖，再用Sevage法[24]脫蛋白后得到的脫蛋白多糖對人肝癌細(xì)胞HepG2的毒活性明顯低于沒有經(jīng)過脫蛋白處理的霍山石斛粗多糖，國內(nèi)一些學(xué)者也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象[2526] 。同時，國內(nèi)外有研究顯示植物糖蛋白有較強的抗腫瘤、增強免疫力的作用[2731] 。因此，根據(jù)對粗制霍山石斛多糖和脫蛋白多糖抗腫瘤比對效果，假設(shè)霍山石斛多糖中存在一些能被有機溶劑破壞或除去的糖復(fù)合物，如糖蛋白，這類物質(zhì)是構(gòu)成霍山石斛多糖抗腫瘤的基礎(chǔ)物質(zhì)之一。為驗證假設(shè)，利用低鹽溶液浸提加硫酸銨分級沉淀分離提取出不同的霍山石斛蛋白組分，再經(jīng)DEAE Bsarose Fast Flow 離子柱和SephadexG200凝膠柱分離得到糖蛋白，以粗制多糖、脫蛋白多糖和糖蛋白為研究對象，檢驗霍山石斛糖蛋白是否具備對人肝癌細(xì)胞HepG2的毒活性。

1材料

實驗材料為根系生長3年以上，當(dāng)年春季抽條越冬后的霍山石斛鮮莖（去葉），按統(tǒng)計學(xué)方法五點取樣[32]，2016年3月采自安徽省霍山縣衡山鎮(zhèn)柳林河栽培基地（六安臻和生物科技有限公司），由鄧輝副教授鑒定。人肝癌細(xì)胞HepG2（上海奧陸生物科技有限公司），阿霉素 （意大利Actavis Italy SpA， 批號H20130186）；DEAE Bsarose Fast Flow利穗科技（蘇州）公司產(chǎn)品；Sephadex G200 Sigma 公司產(chǎn)品；NaHCO3、硫酸、苯酚、葡萄糖、無水乙醇、正丁醇、氯仿、丙酮、考馬斯亮藍(lán)G250/R250、硝酸銀、堿性品紅、偏重亞硫酸鈉、高碘酸、活性炭、甲醇、冰乙酸等均為國產(chǎn)分析純。

色譜柱（26 cm×55 cm， 16 cm×80 cm），利穗科技（蘇州）有限公司；UV2100 型紫外可見分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，天津市紐森科技有限公司；Mini垂直電泳儀，北京六一儀器廠；Allegra15R 臺式高速冷凍離心機，美國BECKMAN公司； CO150型CO2培養(yǎng)箱，美國Thermo公司；Multiskan Spectrum全波長酶標(biāo)儀，美國Thermo公司。

2方法和結(jié)果

21霍山石斛多糖的分離提取將同一種石斛切成薄片后混合，60 ℃烘干至恒重，85 ℃無水乙醇索氏提取至回流液無色，揮干溶劑，藥渣按照料液比1∶5加入蒸餾水于80 ℃水浴冷凝回流提取4次，每次3 h[12]。合并濾液并減壓濃縮獲得粗多糖溶液。上述粗多糖溶液，按1∶4加入無水乙醇，4 ℃冰箱靜置24 h，4 000 r min-1離心5 min，循環(huán)操作3～4次[13]，合并沉淀，60 ℃干燥至恒重，即為粗制多糖[33]。

采用Sevage法[1415]脫蛋白，具體步驟：加入適量蒸餾水，按照樣品溶液萃取劑4∶1加入Sevage試劑（氯仿正丁醇 4∶1），混勻，振蕩30 min。以4 000 r·min-1離心5 min，棄除下層氯仿及中層變性蛋白。取上部水層重復(fù)去蛋白操作，至無明顯中層為止。收集去蛋白后的上部水層備用。將上述多糖水溶液，通過超濾裝置超濾，濾膜截留相對分子質(zhì)量為1 000，脫去小分子物質(zhì)，得到純化后的多糖濃縮溶液。按1∶4加入無水乙醇，4 ℃冰箱靜置12 h，4 000 r·min-1離心10 min，循環(huán)操作3次[13]，合并沉淀，60 ℃干燥至恒重，即為脫蛋白多糖。

22霍山石斛多糖的細(xì)胞毒活性檢測取處于對數(shù)生長期的人肝癌細(xì)胞HepG2，用025%胰蛋白酶消化，細(xì)胞計數(shù)并用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度為1×104～3×104個/mL，接種于96 孔板，每孔100 μL，放置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，每孔分別加入25，50，100，200，400，600，800，1 000 mg·L-1的樣液100 μL，設(shè)6 個平行孔。給樣后于37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)72 h，棄上清液，每孔加入200 μL 新鮮配制的05 g·L-1 MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，每孔加二甲基亞砜（DMSO）150 μL 溶解，微型振蕩器振蕩混勻，酶標(biāo)儀測定A，參考波長490 nm，檢測波長570 nm，以RPMI 1640 培養(yǎng)液作陰性（空白）對照，以阿霉素作陽性對照。按以下公式計算生長抑制率，生長抑制率=[1-（A實驗組-A空白組） /（A對照組-A空白組） ]×100%，按文獻(xiàn)計算測試樣品的半數(shù)抑制濃度（IC50） [34]。MTT比色法檢測結(jié)果顯示，霍山石斛脫蛋白多糖對人肝癌細(xì)胞HepG2的IC50為95915 mg·L-1，霍山石斛粗制多糖對人肝癌細(xì)胞HepG2的IC50為78638 mg·L-1，陽性對照阿霉素的IC50為092 mg·L-1。

23霍山石斛蛋白的分離提取將干燥粉碎均勻的霍山石斛粉末進(jìn)行低鹽溶液浸提（Nacl 03 mol·L-1、料液比1∶15，室溫，12 h），離心（4 ℃，8 000 r·min-1，20 min），取上清液，用飽和度為30%，70%，100%硫酸銨溶液依次分級沉淀（4 ℃，12 h），離心（4 ℃，8 000 r·min-1，20 min），流水透析48 h（02 g·L-1疊氮化鈉），聚乙二醇濃縮，分裝為蛋白溶液PRⅠ，PRⅡ，PRⅢ，進(jìn)行SDSPAGE電泳檢測。

24霍山石斛蛋白的SDSPAGE電泳及蛋白染色和糖染色SDSPAGE電泳[3536]，制備5%濃縮膠、12%分離膠，恒壓電泳，考馬斯亮藍(lán)染色和PAS染色，采用凝膠成像系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理軟件，根據(jù)蛋白Marker，計算出糖蛋白的相對分子質(zhì)量。SDSPAGE 電泳結(jié)果見圖1，可知霍山石斛蛋白溶液PRⅠ，PRⅡ，PRⅢ泳道中均含有未知蛋白條帶，但只有蛋白溶液PRⅡ泳道中含有3條較明顯的糖蛋白條帶，采用凝膠成像權(quán)自配的成像數(shù)據(jù)處理軟件，以蛋白Marker相對遷移率為標(biāo)準(zhǔn)，計算出這3種糖蛋白的相對分子質(zhì)量分別為225，198，156 kDa。選擇蛋白溶液PRⅡ組分進(jìn)行進(jìn)一步分離純化。

26霍山石斛糖蛋白復(fù)合物的細(xì)胞毒活性檢測MTT 比色法檢測霍山石斛糖蛋白復(fù)合物對人肝癌細(xì)胞HepG2的IC50，操作步驟同22。結(jié)果顯示，霍山石斛糖蛋白復(fù)合物對人肝癌細(xì)胞HepG2的IC50為53423 mg·L-1，陽性對照阿霉素的IC50為091 mg·L-1。

27霍山石斛糖蛋白的凝膠排阻色譜純化取糖蛋白復(fù)合物濃縮液，用Sephadex G200 凝膠柱（16 cm×80 cm）進(jìn)行進(jìn)一步分離純化，水洗脫，收集洗脫液，在考馬斯亮藍(lán)G250染色測定蛋白的量；用苯酚硫酸法檢測糖的量。合并同一個檢出峰中既有蛋白又有糖的檢出管，結(jié)果從多糖蛋白復(fù)合物中得到霍山石斛糖蛋白RG1，RG2，RG3組分，其糖和蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1122%，1348%，1837%和8878%，8652%，8163%，然后分別裝入透析袋透析，直至AgNO3檢測透析液無渾濁后，聚乙二醇濃縮4 ℃保存。

物質(zhì)基礎(chǔ)之一。為此，分別制備了霍山石斛粗制多糖、脫蛋白多糖和多糖蛋白復(fù)合物，并采用MTT方法檢測對其進(jìn)行了人肝癌細(xì)胞HepG2的毒活性實驗。結(jié)果表明，對人肝癌細(xì)胞HepG2的毒活性，霍山石斛多糖蛋白復(fù)合物>粗制多糖>脫蛋白多糖；實驗進(jìn)一步分離純化了霍山石斛多糖蛋白復(fù)合物，得到了3種小分子量糖蛋白組分RG1，RG2和RG3，前兩者具有細(xì)胞毒活性，且具有協(xié)同作用，實驗結(jié)果印證了推測，當(dāng)然實驗并不排除多糖和蛋白本身也具有抗腫瘤活性。同時，上述純化的糖蛋白組分是否為單一成分，是否同時具備增強免疫的功效，其主要構(gòu)成單元和抗腫瘤的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是什么，仍需開展更多的研究工作。

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[收稿日期]20160909

[基金項目]河北省自然科學(xué)基金項目（H2014209214，H2015209094）

[通信作者]*莊鵬宇，博士，研究方向為天然藥物化學(xué)，Tel：（0315） 3726311， Email：zhuangpengyu@163