MACROD2基因rs2208454單核苷酸多態(tài)性與腦出血的關(guān)系研究

李海華，江東東，肖友生，羅立忠，單小芳，羅曼

·論著·

MACROD2基因rs2208454單核苷酸多態(tài)性與腦出血的關(guān)系研究

李海華，江東東，肖友生，羅立忠，單小芳，羅曼

目的 研究MACROD2基因rs2208454單核苷酸多態(tài)性與腦出血(ICH)的關(guān)系。方法 采用SNaPshot方法檢測(cè)124例ICH患者(ICH組)及149名正常對(duì)照者(對(duì)照組)的rs2208454單核苷酸多態(tài)性。結(jié)果 與對(duì)照組比較，ICH組及腦葉出血亞組收縮壓、舒張壓及高血壓史、糖尿病史比率顯著增高(均P<0.05)，非腦葉出血亞組收縮壓、舒張壓及高血壓史、糖尿病史、飲酒史比率顯著增高(均P<0.05)。與對(duì)照組比較，TT、GT、GG基因型分布在ICH組及其亞組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。非條件Logistic回歸分析顯示，SNP rs2208454與ICH無(wú)相關(guān)性(均P>0.05)。亞組分析中，SNP rs2208454與非腦葉出血及腦葉出血亦無(wú)相關(guān)性(均P>0.05)。結(jié)論 rs2208454單核苷酸多態(tài)性與ICH不相關(guān)。

腦出血；rs2208454；MACROD2；單核苷酸多態(tài)性

腦出血(ICH)是一種高致殘率和致死性的疾病，造成沉重的健康和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。眾多研究[1-2]顯示，ICH是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用所致的復(fù)雜疾病，易感基因在ICH發(fā)病中起到了一定的作用。最近一項(xiàng)全基因組關(guān)聯(lián)研究[3]發(fā)現(xiàn)，MACROD2基因rs2208454單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)變異攜帶者靜默型腦梗死的患病風(fēng)險(xiǎn)降低。由于ICH可能具有與靜默型腦梗死相似的病理生理過(guò)程[4]，推測(cè)ICH也可能與SNP rs2208454相關(guān)。因此，本研究以ICH患者及健康人群作為研究對(duì)象進(jìn)行了病例對(duì)照研究，以確定SNP rs2208454與ICH之間的關(guān)聯(lián)。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 本研究采用病例-對(duì)照研究方法，病例來(lái)自兩個(gè)研究中心(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院及廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院)。(1)ICH組：收集2011年1月～2012年12月就診于神經(jīng)科的ICH患者124例，診斷符合疾病國(guó)際分類標(biāo)準(zhǔn)第10版標(biāo)準(zhǔn)，所有病例均經(jīng)CT和/或MRI確診。男75例，女49例；年齡28～84歲，平均(63.9±13.3)歲。排除繼發(fā)性ICH和蛛網(wǎng)膜下腔出血，以及嚴(yán)重感染、慢性阻塞性肺病、各系統(tǒng)腫瘤、嚴(yán)重慢性疾病患者。由兩位神經(jīng)科醫(yī)師盲法按出血部位對(duì)ICH患者進(jìn)行分型[5]。將ICH患者分為三亞組：非腦葉出血亞組93例、腦葉出血亞組28例以及混合(同時(shí)存在非腦葉及腦葉部位的出血)出血亞組3例。(2)對(duì)照組：系同期健康體檢者149名，男78名，女71名；年齡35～84歲，平均(62.6±10.4)歲。排除患有腦血管病、冠心病、慢性阻塞性肺病、各系統(tǒng)腫瘤、嚴(yán)重感染、內(nèi)分泌及代謝性疾病(除外糖尿病)、自身免疫性疾病、血液病以及嚴(yán)重肝腎功能不全者等系統(tǒng)性疾病患者。兩組的性別、年齡相匹配，均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 基因分型方法 (1)血液基因組DNA提?。撼槿⊙芯繉?duì)象外周靜脈血2 ml，EDTA 抗凝。使用全血基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN公司)提取基因組DNA。PCR擴(kuò)增：引物使用Primer3軟件設(shè)計(jì)(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)，上游引物序列：5′-GCC AGA TTA GAT CTG AGC TAG GGT GT-3′，下游引物序列：5′-TCC AAA ATA AAC CAG CAA CCA AAA-3′，PCR反應(yīng)體系(20 μl)包含：1×GC緩沖液Ⅰ，3.0 mmol/L Mg2+，0.3 mmol/L dNTP，1 U熱啟動(dòng)Taq聚合酶，1 μl樣本DNA和2 μl PCR引物(1 μmol/L)。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min；94℃變性20s ，65℃退火40 s，72℃延伸1.5 min，11個(gè)循環(huán)；94℃變性20 s，59℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，24個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸2 min。PCR產(chǎn)物4 ℃保存。(2)SNP基因分型：取PCR產(chǎn)物15 μl，依次加入蝦堿酶5 U、外切酶2 U，此后37℃溫浴1 h，75℃滅活15 min。繼而進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)延伸。延伸引物序列：TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TGC CCC CCA TTT ACT TTG ATT TTA T。反應(yīng)體系包括：SNaPshot反應(yīng)試劑盒5 μl，純化后PCR產(chǎn)物2 μl，延伸引物1 μl，超純水2 μl。反應(yīng)條件：96℃預(yù)變性1 min；96℃變性10 s，52℃退火5 s，60 ℃延伸30 s，28個(gè)循環(huán)；4℃保存。在10 μl延伸產(chǎn)物中繼續(xù)加入蝦堿酶1 U，37 ℃溫浴1 h，75℃滅活15 min，以純化延伸產(chǎn)物。取0.5 μl純化后的延伸產(chǎn)物，變性后在3130XL測(cè)序儀上樣，采用GeneMapper 4.1分析。

2 結(jié) 果

2.1 ICH組和對(duì)照組臨床資料的比較 見(jiàn)表1。與對(duì)照組比較，ICH組及腦葉出血亞組收縮壓、舒張壓及高血壓史、糖尿病史比率顯著增高(均P<0.05)，非腦葉出血亞組收縮壓、舒張壓及高血壓史、糖尿病史、飲酒史比率顯著增高(均P<0.05)，混合出血亞組高血壓史比率顯著增高(P<0.05)。

表1 腦出血病例組與對(duì)照組臨床資料的比較(x±s,例,%)項(xiàng)目對(duì)照組(n=149)ICH組(n=149)總體(n=149)非腦葉出血亞組(n=93)腦葉出血亞組(n=28)混合出血亞組(n=3)年齡(歲)62.6±10.463.9±13.363.4±13.465.9±12.961.0±16.5男性78(52.3)90(60.5)58(62.4)15(53.6)2(66.7)飲酒史15(10.1)24(16.1)18(19.4)*1(3.6)1(33.3)吸煙史32(21.5)43(29.0)28(30.1)6(21.4)2(66.7)高血壓史28(18.8)119(79.8)*75(80.6)*21(75.0)*3(100.0)*糖尿病史9(6.0)37(25.0)*20(21.5)*10(35.7)*1(33.3)ICH家族史1(0.7)7(4.8)5(5.4)1(3.6)0(0)收縮壓(mmHg)129.8±18.7150.6±25.5*152.4±24.7*145.9±27.7*136.0±31.2舒張壓(mmHg)79.8±11.689.0±16.4*89.3±16.3*88.3±16.4*84.7±22.4膽固醇(mmol/L)5.1±1.35.2±1.25.1±1.15.4±1.5-三酰甘油(mmol/L)1.4±1.01.5±1.01.5±0.91.7±1.1-糖化血紅蛋白(%)6.2±1.36.4±1.46.3±1.26.6±2.0- 注:與對(duì)照組比較*P<0.05;1mmHg=0.133kPa

2.2 HWE檢驗(yàn)結(jié)果 對(duì)照組及ICH組均符合HWE平衡法則(χ2=0.006，P=0.934；χ2=0.121，P=0.728)，具有群體代表性。

2.3 組間基因型分布的比較 見(jiàn)表2。與對(duì)照組比較，TT、GT、GG基因型分布在ICH組及其亞組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

2.4 不同遺傳模型下SNP rs2208454與ICH患病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系 見(jiàn)表3。為調(diào)整ICH環(huán)境因素的影響，以ICH作為因變量，以年齡、收縮壓、舒張壓、高血壓史及糖尿病史等作為混雜因素予以校正，進(jìn)行非條件Logistic回歸分析。遺傳模型包括顯性(TT+GT vs. GG)、隱性(TT vs. GT+GG)和加性(TT vs.GG)模型。分析顯示，SNP rs2208454與ICH無(wú)相關(guān)性(顯性模型：OR=1.03，95%CI: 0.64～1.67，P=0.90，校正OR=0.80，95%CI：0.42～1.49，P=0.48; 隱性模型：OR=1.22，95%CI：0.47～3.17，P=0.69，校正OR=0.79，95%CI：0.22～2.86，P=0.72; 加性模型：OR=1.22，95%CI：0.46～3.24，P=0.69，校正OR=0.77，95%CI：0.21～2.80，P=0.69)。亞組分析中，SNP rs2208454與非腦葉出血及腦葉出血亦無(wú)相關(guān)性(均P>0.05)。

表2 ICH組與對(duì)照組SNPrs2208454基因型分布的比較(例,%)組別SNPrs2208454基因型TTGTGGχ2值P值ICH組9(7.26)46(37.10)69(55.64)0.160.92 非腦葉出 血亞組8(8.60)33(35.48)52(55.92)0.600.74 腦葉出 血亞組1(3.57)12(42.86)15(53.57)0.460.80對(duì)照組9(6.04)56(37.58)84(56.38)

表3 不同遺傳模型下SNPrs2208454與ICH患病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系遺傳模型校正前OR值95%CIP值校正后OR值95%CIP值ICH組 顯性模型1.030.64～1.670.900.800.42～1.490.48 隱性模型1.220.47～3.170.690.790.22～2.860.72 加性模型1.220.46～3.240.690.770.21～2.800.69非腦葉出血亞組 顯性模型1.020.61～1.720.940.760.38～1.530.45 隱性模型1.460.54～3.940.451.000.26～3.811.00 加性模型1.440.52～3.960.480.930.24～3.540.91腦葉出血亞組 顯性模型1.120.50～2.520.781.000.38～2.631.00 隱性模型0.580.07～4.740.610.530.05～5.770.60 加性模型0.620.07～5.280.660.630.05～7.330.71

3 討 論

ICH是一種復(fù)雜疾病，它的發(fā)病受環(huán)境因素和遺傳因素的共同影響。大量研究[6]表明，環(huán)境因素中高血壓是ICH最主要的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究顯示，ICH組收縮壓及舒張壓均明顯高于對(duì)照組。亞組研究中雖然非腦葉出血亞組和腦葉出血亞組收縮壓及舒張壓均較對(duì)照組增高，但非腦葉出血亞組升高更為明顯，這符合既往的研究[7-8]結(jié)果。糖尿病是否是ICH一個(gè)危險(xiǎn)因素尚存在爭(zhēng)議。有研究[6]認(rèn)為，糖尿病與ICH無(wú)顯著相關(guān)。也有研究[9]認(rèn)為，糖尿病是ICH的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究結(jié)果顯示，糖尿病與ICH相關(guān)。此外，非腦葉出血亞組的飲酒史與對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示飲酒可能是ICH的危險(xiǎn)因素之一，這與既往的研究[10]結(jié)果一致。

鑒于不同的腦出血亞型，其病理特征、發(fā)病原因均不同，因此本研究小組認(rèn)為ICH的易感基因多態(tài)性研究有必要根據(jù)不同亞型進(jìn)一步進(jìn)行亞組研究。本研究根據(jù)出血部位不同將腦出血分為非腦葉出血、腦葉出血及混合出血亞組。腦葉出血指出血部位為腦葉及皮質(zhì)下白質(zhì)的出血，其病理生理機(jī)制主要是腦淀粉樣血管病[11]。已有大量研究[12]證實(shí)，載脂蛋白E基因變異與CAA發(fā)病相關(guān)，是較公認(rèn)的可增加腦葉出血發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的易感基因。非腦葉出血包括基底節(jié)區(qū)、腦室旁白質(zhì)、丘腦、內(nèi)囊及小腦、腦干出血。非腦葉出血的病因主要為高血壓性血管病變[13]。既往研究顯示[4,13-15]，可能與非腦葉出血相關(guān)的基因有ACE、PMF1/SLC25A44、COL4A2及MTHFR等，此外還有出凝血、脂代謝、炎癥等相關(guān)的基因與腦出血發(fā)病相關(guān)的報(bào)道[13]，但目前尚未發(fā)現(xiàn)較明確的非腦葉出血的易感基因。

新近一項(xiàng)基于社區(qū)人群的MRI確定的靜默型腦梗死全基因組關(guān)聯(lián)研究[3]發(fā)現(xiàn)，位于20p12的MACROD2基因rs2208454是與靜默型腦梗死最相關(guān)的SNP位點(diǎn)(OR=0.76，95%CI：0.68～0.84，P=4.64×10-7)，該位點(diǎn)變異攜帶者靜默型腦梗死的患病風(fēng)險(xiǎn)降低。靜默型腦梗死患者無(wú)任何(或僅有極輕微的)臨床癥狀、體征而達(dá)不到“缺血性腦卒中”的診斷，但可經(jīng)MRI檢查發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)是位于皮質(zhì)下的腔隙性梗死。此外，一些研究[16-17]顯示，MACROD2基因多態(tài)性還與缺血性腦卒中及高血壓有關(guān)。由于ICH和腔隙性腦梗死同屬于腦小血管病，可能具有相似的發(fā)病機(jī)制，因此易感基因也可能存在重疊。SNP rs2208454位于MACROD2基因第3內(nèi)含子，位于富含亮氨酸的纖連蛋白跨膜蛋白3(FLRT3)基因的下游區(qū)域。由MACROD2編碼的蛋白質(zhì)的功能目前尚不清楚。MACROD2基因包含一段綁定腺苷二磷酸(ADP)-核糖的區(qū)域，提示MACROD2有可能參與到ADP-核糖基化過(guò)程中。ADP-核糖基化是以NAD作為修飾基團(tuán)的供體，將ADP核糖連接到受體蛋白上去的一種翻譯后修飾過(guò)程。ADP核糖基化作用幾乎存在所有類型的細(xì)胞中，已被認(rèn)為是生物體修飾和改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的最重要途徑之一。生物體內(nèi)很多重要事件都與ADP-核糖基化作用密切相關(guān)，涉及DNA修復(fù)、轉(zhuǎn)錄激活、基因的表達(dá)與調(diào)控等。另外，F(xiàn)LRT3基因位于rs2208454的上游，是除MACROD2外距離rs2208454最近的基因。FLRT3基因編碼富含亮氨酸的纖連蛋白跨膜蛋白3，它在包括腦在內(nèi)的各種組織中均有表達(dá)。該蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞間的嗜同性黏附和上調(diào)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的信號(hào)，提示FLRT3基因編碼蛋白可能參與神經(jīng)、血管發(fā)生。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[18]中已有證據(jù)表明，F(xiàn)LRT3能夠在軸索損傷后促進(jìn)軸突生長(zhǎng)。目前，尚無(wú)MACROD2基因SNP rs2208454與ICH相關(guān)性研究報(bào)道。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在本研究人群中存在MACROD2基因rs2208454多態(tài)性，存在TT、GT和GG三種基因型。與對(duì)照組比較，TT、GT、GG基因型分布在ICH組及其亞組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。SNP rs2208454與ICH及各亞組均無(wú)相關(guān)性。但由于SNP rs2208454位于MACROD2基因的內(nèi)含子區(qū)域，并不參與蛋白質(zhì)的編碼，因此還無(wú)法得知ICH發(fā)病與MACROD2基因功能是否相關(guān)。

綜上所述，本研究采用病例對(duì)照研究MACROD2基因SNP rs2208454與ICH患者的遺傳易感性的關(guān)聯(lián)，結(jié)果顯示rs2208454與ICH發(fā)病無(wú)關(guān)。這可能和抽樣不均有關(guān)，仍需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。

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Relationship between single nucleotide polymorphism rs2208454 in MACROD2 gene and intracerebral hemorrhage

LIHai-hua,JIANGDong-dong,XIAOYou-sheng,etal.

DepartmentofNeurology,FusuiPeople’sHospital,Chongzuo532100,China

Objective To explore the relationship between single nucleotide polymorphism (SNP) rs2208454 in MACROD2 gene and intracerebral hemorrhage (ICH). Methods The SNP rs2208454 of 124 ICH patients (ICH group) and 149 normal controls (control group) was detected by SNaPshot technique. Results Compared with control group, systolic pressure, diastolic blood pressure and the rate of hypertension and diabetes of ICH group and lobar ICH subgroup were significantly increased (allP<0.05), systolic pressure, diastolic blood pressure and the rate of hypertension, diabetes and drinking of nonlobar ICH subgroup were significantly increased (allP<0.05). Compared with control group, the distribution genotypes (TT, GT, GG) of ICH group and its subgroups had no statistically significant difference (allP>0.05). Non-conditional Logistic regression analysis showed SNP rs2208454 had no correlation with ICH (allP>0.05). In subgroup analysis, SNP rs2208454 had no correlation with nonlobar and lobar ICH (allP>0.05). Conclusion SNP rs2208454 has no correlation with ICH.

intracerebral hemorrhage；rs2208454；MACROD2；single nucleotide polymorphism

廣西自然科學(xué)基金(2013GXNSFBA019131,2015GXNS FAA139171)

532100 崇左，扶綏縣人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(李海華，羅立忠，單小芳)；廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(江東東，肖友生，羅曼)

羅曼

R743.34

A

1004-1648(2017)01-0005-04

2016-03-17

2016-08-10)