樊琛++閆雪梅++王會++曾慶華++李燕

摘要：采用全波長分析方法，從12種染料中選出番紅花紅T檢測羥自由基，番紅花紅T溶液在Fenton試劑體系中，在550～560 nm吸光度變化明顯，從而用分光光度法檢測Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基（·OH）。通過對反應(yīng)體系FeSO4溶液、H2O2溶液、溫度以及時間4個影響條件的單因素試驗以及正交試驗，得出最佳反應(yīng)條件為FeSO4溶液1.0 mL、H2O2溶液0.6 mL、溫度25 ℃、時間35 min，在此最佳反應(yīng)條件下，隨著抗壞血酸溶液濃度的增大，羥自由基的清除率增大，得出所選最佳反應(yīng)條件適合進(jìn)行檢測羥自由基試驗。驗證試驗證明，乙醇溶液對Fenton體系有明顯清除羥自由基的作用，抗氧化性能良好，溶度較小時抗氧化性能仍然很好；番紅花紅T檢測羥自由基的體系在酸性環(huán)境pH 2～6.4范圍內(nèi)穩(wěn)定。

關(guān)鍵詞：番紅花紅T；Fenton反應(yīng)；羥自由基

中圖分類號：S567.23+9；R927.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）01-0132-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.01.034

Study on Detection of Hydroxyl Free Radical by Safranine T Method

FAN Chen， YAN Xue-mei， WANG Hui， ZENG Qing-hua， LI Yan， SUN Xiao-fan， ZHENG Huan-qin

（Agricultural College of Liaocheng University， Liaocheng 252059，Shandong，China）

Abstract：Through the full wave analysis method，the Safranine T from 12 kinds of dye were selected for the detection of hydroxyl free radical，in the Fenton reagent system，the absorbance of safranine T solution changed apparently between 550～560 nm，then using spectrophotometry to detect hydroxyl free radical（·OH） produced by Fenton reaction.By single factor experiment and orthogonal test，4 influence factors in reaction system as FeSO4 solution，H2O2 solution，temperature and time were obtained， the optimum reaction conditions were FeSO4 solution 1.0 mL，H2O2 solution 0.6 mL，temperature 25 ℃，time 35 min，i.e. the best combination was A1B2C2D2. Under the optimum reaction conditions，with the increase of concentration of ascorbic acid， the scavenging rate of hydroxyl free radical increased，it concluded that the optimum reaction conditions were suitable for test detection of hydroxyl free radical. The verification experiment showed that，ethanol solution had obvious scavenging effect on Fenton system，with excellent oxidation resistance even in low solubility. The detection system of hydroxyl free radical by safranine T was stable at pH 2～6.4 in the acidic environment.

羥自由基可造成生物組織脂質(zhì)過氧化、核酸斷裂、蛋白質(zhì)和多糖分解。羥自由基的反應(yīng)活性大，壽命短，存在濃度低，所以在有關(guān)羥自由基的研究中，其分析檢驗方法對于羥自由基的作用研究有重要的意義，特別是在測定及篩選抗羥自由基物質(zhì)方面具有重要價值[1，2]。近年來國內(nèi)外文獻(xiàn)報道了檢測羥自由基的一些重要方法，有電子自旋共振法、高效液相色譜法、化學(xué)發(fā)光法、熒光法、分光光度法等。電子自旋共振法和高效液相色譜法操作復(fù)雜，儀器昂貴；化學(xué)發(fā)光法雖然操作簡便，測定快速，但儀器普及不廣[3-9]。

本試驗采用番紅花紅T作為顯色劑，用分光光度法測定Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的·OH，具有操作簡便，費用低，易于廣泛使用的優(yōu)點。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

番紅花紅T，甲基橙，次甲基蘭，溴酚藍(lán)，甲基紅，鉻黑T，溴甲酚紫，溴百里香酚藍(lán)，靛紅，結(jié)晶紫，甲基藍(lán)，考馬斯亮藍(lán)，硫酸亞鐵，30%的過氧化氫溶液，無水乙醇，氫氧化鈉，蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1700型全波長自動分光光度儀（日本島津公司）；UV-1800型紫外分光光度儀（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；SB-2000型水浴鍋（上海愛朗儀器有限公司）；T-214型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 染料篩選 準(zhǔn)確稱取固體染料，加入溶劑20.0 mL溶解，搖勻，待用。取4支比色管，分別標(biāo)號①、②、③和空白，放入30 ℃水浴中，恒溫30 min后，取出。①號管中加入FeSO4溶液（濃度0.18 mmoL/L[10]，以下均使用該濃度溶液）2.0 mL，染料溶液2.0 mL，H2O2溶液（濃度0.3%，以下均使用該濃度溶液）2.0 mL，蒸餾水補足體積至8.0 mL，其中H2O2溶液最后加入；②號管中加入FeSO4溶液2.0 mL，染料溶液2.0 mL，蒸餾水補足體積至8.0 mL；③號管中加入染料溶液2.0 mL，調(diào)節(jié)pH溶液（與該硫酸亞鐵溶液的pH一致）2.0 mL，H2O2溶液2.0 mL，蒸餾水補足體積至8.0 mL，其中H2O2溶液最后加入；空白管中加入染料溶液2.0 mL，蒸餾水補足體積至8.0 mL。

觀察4支比色管的顏色變化，使用全波長分光光度儀逐一測定各比色管的全波長圖譜，比較各波段的圖譜[11-13]，篩選適合的染料。

1.3.2 單因素試驗[14]

1）FeSO4溶液用量。分別加入FeSO4溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0 mL[15，16]，番紅花紅T溶液1.0 mL，H2O2溶液2.0 mL，蒸餾水補足體積至8.0 mL；空白對照為番紅花紅T溶液1.0 mL，蒸餾水補足體積至8.0 mL。放入30 ℃水浴中30 min后取出，于554 nm處測定吸光度。以吸光度變化△A判定羥自由基的含量，計算公式如下：

△A=A0-A1

式中，A0為空白對照吸光度；A1為試驗組吸光度。

2）H2O2溶液用量。分別加入H2O2溶液的量0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0 mL[15]，番紅花紅T溶液1.0 mL，F(xiàn)eSO4溶液1.0 mL，蒸餾水補足體積至8.0 mL；空白對照為番紅花紅T溶液的量1.0 mL，蒸餾水補足體積至8.0 mL。放入30 ℃水浴中30 min后取出，于554 nm處測定吸光度。以吸光度變化△A判定羥自由基的含量，計算公式如下：

△A=A0-A1

式中，A0為空白對照吸光度；A1為試驗組吸光度。

3）溫度。分別加入FeSO4溶液1.0 mL，番紅花紅T溶液1.0 mL，H2O2溶液2.0 mL，蒸餾水補足體積至8.0 mL；空白對照組為番紅花紅T溶液的量1.0 mL，蒸餾水補足體積至8.0 mL。水浴溫度分別為2、10、15、20、25、30、35、40 ℃，恒溫30 min后，取出，于554 nm處測定吸光度。以吸光度變化△A判定羥自由基的含量，計算公式如下：

△A=A0-A1

式中，A0為空白對照組吸光度；A1為試驗組吸光度。

4）時間。分別加入FeSO4溶液1.0 mL，番紅花紅T溶液1.0 mL，H2O2溶液2.0 mL，蒸餾水補足體積至8.0 mL；空白對照組為番紅花紅T溶液的量1.0 mL，蒸餾水補足體積至8.0 mL。放入25 ℃水浴中，恒溫時間分別為0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 min后取出，于554 nm測定吸光度。以吸光度變化△A判定羥自由基的含量。計算公式如下：

△A=A0-A1

式中，A0為空白對照組吸光度；A1為試驗組吸光度。

1.3.3 正交試驗 通過單因素試驗，確定各個影響因素的優(yōu)化范圍，進(jìn)行正交試驗，采用四因素三水平的正交試驗，選取的因素分別為FeSO4溶液、H2O2溶液、水浴溫度、反應(yīng)時間。

1.3.4 驗證試驗 根據(jù)正交試驗結(jié)果，F(xiàn)eSO4溶液的量、H2O2溶液的量、水浴溫度和反應(yīng)時間均按照正交試驗，選擇最優(yōu)體系方案，進(jìn)行驗證試驗。

1）乙醇的影響。分別加入30%、10%、5%、1%、0%的乙醇溶液1.0 mL，F(xiàn)eSO4溶液1.0 mL，番紅花紅T溶液1.0 mL，H2O2溶液0.6 mL，蒸餾水補足體積至8.0 mL；空白對照組分別加入30%、10%、5%、1%、0%的乙醇溶液1.0 mL，番紅花紅T溶液的量1.0 mL，蒸餾水補足體積至8.0 mL。放入25 ℃水浴中，恒溫35 min后，取出，于空白對照組測定波長處測定吸光度，計算公式如下：

△A=A0-A1

式中，A0為空白對照組吸光度；A1為試驗組吸光度。

2）pH的影響。分別加入pH調(diào)節(jié)溶液2.0 mL，F(xiàn)eSO4溶液1.0 mL，番紅花紅T溶液1.0 mL，H2O2溶液0.6 mL，蒸餾水補足體積至8.0 mL；空白對照組分別加入pH調(diào)節(jié)溶液2.0 mL，番紅花紅T溶液的量1.0 mL，蒸餾水補足體積至8.0 mL。放入25 ℃水浴中，恒溫35 min后，取出，于空白對照組測定波長處測定吸光度。以吸光度變化△A判定反應(yīng)體系適宜的酸堿范圍，計算公式如下：

△A=A0-A1

式中，A0為空白對照組吸光度；A1為試驗組吸光度。

3）抗壞血酸清除羥自由基的作用。分別加入5×10-1、1×10-1、5×10-2、1×10-2、1×10-3 mmoL/mL的抗壞血酸溶液2.0 mL，F(xiàn)eSO4溶液1.0 mL，番紅花紅T溶液1.0 mL，H2O2溶液0.6 mL，蒸餾水補足體積至8.0 mL；空白試驗為FeSO4溶液1.0 mL，番紅花紅T溶液1.0 mL，H2O2溶液0.6 mL，蒸餾水補足體積至8.0 mL；空白對照為番紅花紅T溶液的量1.0 mL，蒸餾水補足體積至8.0 mL。放入25 ℃水浴中，恒溫35 min后，取出，于554 nm測定吸光度，計算出羥自由基清除率D[17]。以羥自由基清除率D判定抗壞血酸溶液的抗氧化能力。羥自由基清除率計算公式如下：

D=[（A2-A1）/（A0-A1）]×100%

式中，A0為空白對照吸光度；A1為空白試驗吸光度；A2為試驗組吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 染料篩選試驗結(jié)果

根據(jù)對各種染料的全波長圖譜的分析，番紅花紅T的4支比色管得出的圖譜相比較，F(xiàn)enton反應(yīng)體系在300～350 nm間吸光度明顯升高，在560 nm左右處吸光度明顯降低；與FeSO4溶液、H2O2溶液單獨使用時，無明顯變化。其他染料不受羥自由基影響或與FeSO4溶液、H2O2溶液單獨使用時發(fā)生變化（圖1）。如圖1所示，番紅花紅T-·OH反應(yīng)體系吸光度在550～560 nm明顯降低，經(jīng)檢測波峰處為554 nm。選擇番紅花紅T染料做單因素試驗。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 FeSO4溶液用量分析 各試驗組出現(xiàn)明顯的顏色變化，隨著FeSO4溶液加入量的增加，△A急劇上升，F(xiàn)eSO4溶液1.0 mL時△A達(dá)到最高，隨后，F(xiàn)eSO4溶液1.5～5.0 mL，△A緩慢減小，即△A隨FeSO4溶液加入量增加先增大后減小（圖2）。故選擇FeSO4溶液的量為1.0 mL進(jìn)行以下試驗。

2.2.2 H2O2溶液用量分析 各試驗組出現(xiàn)明顯的顏色變化，隨著H2O2溶液加入量的增加，各試驗組顏色變淺，由粉紅色變?yōu)闇\黃色至無色。H2O2溶液加入量0～0.5 mL時，△A急劇上升；隨著H2O2溶液加入量的增加，在0.5～5.0 mL，△A隨H2O2溶液加入量增加變化不明顯（圖3）。H2O2溶液加入量2.0 mL時，反應(yīng)體系在554 nm處△A較穩(wěn)定，選擇H2O2溶液的量為2.0 mL進(jìn)行以下試驗。

2.2.3 溫度對反應(yīng)體系的影響 隨著水浴溫度的增加，各管顏色逐漸變淺，由淺橙黃色變?yōu)闇\黃色；空白管呈粉紅色。溫度為2～25 ℃，△A上升明顯；在溫度25 ℃時，△A達(dá)到峰值，隨后下降。即△A隨水浴溫度增加先增大后減小（圖4）。故選擇溫度為25 ℃進(jìn)行以下試驗。

2.2.4 時間對反應(yīng)體系的影響 隨著反應(yīng)時間的增加，顏色由淺橙黃色變?yōu)闇\黃色；反應(yīng)時間0～5 min，△A幾乎不變；5～35 min，△A逐漸上升；35～50 min，△A變化不顯著，即△A隨時間增加先增大，而后基本持平（圖5）。故選擇反應(yīng)時間為35 min。

2.3 正交試驗結(jié)果

根據(jù)表1正交試驗設(shè)計，對試驗進(jìn)行測定，試驗組與空白組番紅花紅T溶液均為1.0 mL，結(jié)果見表2。由表2可見，各因素影響由大到小為FeSO4溶液、溫度、H2O2溶液、時間；最主要的影響因素為FeSO4溶液，其余3個因素在既定的水平下影響較小。最佳組合為A1B2C2D2即FeSO4 1.0 mL、H2O2 0.6 mL、溫度25 ℃、時間35 min。

2.4 驗證試驗結(jié)果

選用A1B2C2D2組合，即FeSO4溶液的量為1.0 mL，H2O2溶液的量為0.6 mL，水浴溫度為25 ℃，保溫時間為35 min，番紅花紅T溶液的加入量為1.0 mL，△A=0.539。

2.4.1 乙醇的影響 分別加入30%、10%、5%、1%的乙醇溶液1.0 mL，F(xiàn)eSO4溶液1.0 mL，番紅花紅T溶液1.0 mL，H2O2溶液0.6 mL，蒸餾水補足體積至8.0 mL；對照組分別加入30%、10%、5%、1%的乙醇溶液1.0 mL，番紅花紅T溶液的量1.0 mL，蒸餾水補足體積至8.0 mL。放入25 ℃水浴中，恒溫35 min。結(jié)果顯示，番紅花紅T檢測羥自由基的體系中，加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，峰值處波長不變，為554 nm。對照組顏色均呈現(xiàn)粉紅色，試驗組中呈現(xiàn)橙紅色。于554 nm處測定吸光度，△A隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的減小而增大（表3）。由表3可見，乙醇對Fenton體系影響較大，即使少量乙醇也可對Fenton體系的產(chǎn)生明顯影響。乙醇與番紅花紅T混合顏色為粉紅色，試驗組中呈現(xiàn)橙紅色，推測乙醇具有清除/阻礙羥自由基的能力或阻礙自由基與番紅花紅T反應(yīng)的能力。因此，相關(guān)試驗中應(yīng)注意避免混入含有乙醇的物質(zhì)。

2.4.2 pH的影響 pH調(diào)節(jié)溶液2.0 mL，F(xiàn)eS04溶液1.0 mL，番紅花紅溶液1.0 mL，H202溶液0.6 mL，蒸餾水補足體積至8.0 mL；空白對照組分別加入pH調(diào)節(jié)溶液2.0 mL，番紅花紅T溶液的量1.0 mL，蒸餾水補足體積至8.0 mL。放入25 ℃水浴中，恒溫35 min。結(jié)果顯示，在堿性環(huán)境下，有沉淀生成；在酸性環(huán)境下，不同pH溶液各管顏色相近，均為淡黃；空白對照組均為粉紅色（表4）。由表4可見，番紅花紅T檢測羥自由基的體系在酸性環(huán)境pH 2～6.4保持穩(wěn)定。

2.4.3 抗壞血酸清除羥自由基的作用 在番紅花紅T檢測羥自由基的體系中，加入不同濃度的抗壞血酸溶液后，各試驗管顏色變化明顯（表5）。由表5可見，隨抗壞血酸溶液濃度增大，羥自由基的清除率增大，抗壞血酸溶液的濃度較低時，有助氧化作用。表明，此番紅花紅T檢測羥自由基的體系適合抗氧化物質(zhì)清除羥自由基能力的檢測。

3 結(jié)論

反應(yīng)體系中最主要的影響因素為FeSO4溶液，最佳組合為FeSO4溶液1.0 mL、H2O2溶液0.6 mL、溫度25 ℃、反應(yīng)時間35 min，測定波長為554 nm。

乙醇溶液對此反應(yīng)體系影響較大，此反應(yīng)體系適于檢測水浸提物或去除乙醇后再進(jìn)行檢測；體系在酸性環(huán)境pH 2～6.4穩(wěn)定，堿性浸提物不適合該反應(yīng)體系。

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Key words： safranine T； Fenton reaction； hydroxyl free radical