蔡深文++徐仲瑞++熊治廷

摘要：為研究銅脅迫下海州香薷（Elsholtzia haichowensis Sun）非礦區(qū)種群細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶（EhNcwINV）和礦區(qū)種群細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶（EhCcwINV）活性差異的機(jī)理，運(yùn)用在線分析工具對(duì)細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶基因推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行分析，利用SWISS-MODEL進(jìn)行同源建模，并將細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶與蔗糖分子進(jìn)行模擬對(duì)接。結(jié)果表明，海州香薷兩個(gè)種群細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶蛋白質(zhì)在443位點(diǎn)和538位點(diǎn)處存在氨基酸趨異位點(diǎn)，模擬的3D結(jié)構(gòu)非常相似，僅在趨異位點(diǎn)Leu433/Pro433和Tyr538/His538處有差別。EhNcwINV、EhCcwINV和模擬突變體（EhNcwINV-L433P和EhNcwINV-Y538H）與蔗糖分子對(duì)接形成的催化活性中心構(gòu)象基本一致，但在空間位置上存在細(xì)微差異，氨基酸趨異可能是造成兩個(gè)種群細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶活性差異的原因之一。

關(guān)鍵詞：海州香薷（Elsholtzia haichowensis Sun）；細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶；同源建模；分子對(duì)接

中圖分類號(hào)：Q51；Q942.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）01-0166-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.01.042

Protein Structure and Molecular Modeling Docking of Cell Wall Invertase from

Different Populations in Elsholtzia haichowensis Sun

CAI Shen-wen1，XU Zhong-rui2，XIONG Zhi-ting2

（1.School of Resource and Environment，Zunyi Normal College，Zunyi 563002，Guizhou，China；

2.School of Resource and Environmental Sciences，Wuhan University，Wuhan 430079，China）

Abstract： It was to study the mechanism of enzyme activity difference of cell wall invertase from different populations，one from non-mine population（EhNcwINV），the other from mine population（EhCcwINV） in Elsholtzia haichowensis Sun under copper stress. The amino acid sequences of cell wall invertase were analyzed by ExPASy（http：//au.expasy.org/tools/）. The three-dimensional structure was constructed by homologous modeling. The structures of cell wall invertase from two populations of E. haichowensis Sun and non-mine population with each single point mutation in complex with sucrose were simulated. The results showed that there were two divergent amino acids at position 443 and 538 between EhNcwINV and EhCcwINV. The three-dimensional structures were exactly similar between EhNcwINV and EhCcwINV. It showed difference at Leu433/Pro433 and Tyr538/His538，which were divergent sites. The structures of catalytic active center of EhNcwINV，EhCcwINV，and simulated mutants（EhNcwINV-L433P，EhNcwINV-Y538H） binding with sucrose showed no significant differences. However，there were differences on spatial position. It might be one of the reasons for the difference of cell wall invertase activity between two populations.

Key words： Elsholtzia haichowensis Sun；cell wall invertase；homologous modeling；molecular docking

在重金屬污染的土壤中，植物生長(zhǎng)受重金屬的脅迫，為了維持重金屬抗性機(jī)制，植物必須獲得足夠的由糖提供的碳源和能量。對(duì)于大多數(shù)高等植物，糖在源器官葉中合成，以蔗糖的形式轉(zhuǎn)運(yùn)至庫(kù)器官根中，用于維持異養(yǎng)代謝和生長(zhǎng)[1]。然而，蔗糖不能夠被植物直接用于新陳代謝，必須通過(guò)蔗糖合酶或轉(zhuǎn)化酶水解為己糖才能被利用。細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶（Cell wall invertase，cwINV）在水解蔗糖的過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，且在調(diào)節(jié)韌皮部糖代謝、控制儲(chǔ)藏器官內(nèi)糖的組成、參與植物應(yīng)對(duì)逆境脅迫以及植物早期生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控等方面均具有重要的作用[2]。細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶為酸性轉(zhuǎn)化酶，其最適pH為4.5～5.5，也叫β-呋喃果糖苷酶[3]，為不溶性轉(zhuǎn)化酶，通過(guò)離子作用結(jié)合在細(xì)胞壁上，等電點(diǎn)為堿性。在靠近成熟蛋白質(zhì)的N-末端含有一個(gè)β-呋喃果糖苷酶的特征序列（NDPNG/A），在其半胱氨酸催化域具有特征序列WECPD，這兩個(gè)特征序列高度保守[3，4]。

海州香薷（Elsholtzia haichowensis Sun）是一年生草本植物，屬唇形科，廣泛分布于長(zhǎng)江中下游銅礦區(qū)和銅污染的土壤中，是一種銅礦指示植物，俗稱“銅草”[5，6]。海州香薷在非銅礦區(qū)也有發(fā)現(xiàn)[7]。銅礦區(qū)的海州香薷由于長(zhǎng)期生活在高濃度銅污染的環(huán)境脅迫條件下可能已經(jīng)發(fā)生了與Cu污染相適應(yīng)的抗性進(jìn)化，形成了與非礦區(qū)種群不同的抗性生態(tài)型[8]。通常來(lái)自礦區(qū)種群的海州香薷對(duì)Cu具有很高的吸收富積能力和耐受能力[9]。海州香薷作為一種研究銅抗性的模式植物，其基因信息公布的還較少，前期研究表明海州香薷兩個(gè)種群的細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶活性在銅脅迫下存在差異[10]，而酶活性通常與基因及其表達(dá)調(diào)控過(guò)程相關(guān)，因此獲得海州香薷細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶基因編碼的蛋白質(zhì)信息，對(duì)于進(jìn)一步深入研究銅脅迫下兩個(gè)種群酶活性差異的分子機(jī)理具有重要的理論意義。

1 材料與方法

1.1 材料

海州香薷非礦區(qū)種群細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶基因（EhNcwINV）和礦區(qū)種群細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶基因（EhCcwINV）序列為本實(shí)驗(yàn)室前期克隆所得，GenBank登錄號(hào)分別為JX500753和JX500754。

1.2 蛋白結(jié)構(gòu)分析

使用在線ExPASy序列分析工具（http：//au.expasy.org/tools/）對(duì)推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行分析，采用ProtParam分析蛋白的氨基酸序列組成、相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)等理化性質(zhì)，采用ProtScale分析蛋白質(zhì)的疏水性。將海州香薷兩個(gè)種群細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶和液泡轉(zhuǎn)化酶的氨基酸序列提交至在線分析工具SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）進(jìn)行同源建模，選擇擬南芥（Arabidopsis thaliana）細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶基因AtcwINV1的3D蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)（PDB：2AC1，www.pdb.org）為模板，預(yù)測(cè)海州香薷細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.3 分子對(duì)接

海州香薷細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶蛋白質(zhì)與蔗糖分子的對(duì)接采用自動(dòng)對(duì)接軟件AutoDock4.0完成。蔗糖分子結(jié)構(gòu)來(lái)自于MMsINC數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//mms.dsfarm.unipd.it/MMsINC/）。選擇細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶活性中心的GLU227設(shè)置為柔性殘基。蛋白質(zhì)分子和蔗糖分子在對(duì)接過(guò)程中同時(shí)被賦予Geister Huckel電荷，Grid大小設(shè)置為26×28×28（x，y，z），格點(diǎn)間隔為默認(rèn)值0.375 ？魡，Grid中心坐標(biāo)設(shè)置為74.158、112.502、-4.938（x，y，z）。Number of GA Runs設(shè)置為30，其他參數(shù)均使用系統(tǒng)默認(rèn)參數(shù)。對(duì)接過(guò)程使用拉馬克遺傳算法（Lamarckian Genetic Algorithm，LGA）對(duì)結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行搜索和能量評(píng)價(jià)，選擇結(jié)合自由能最低的構(gòu)象為最終的結(jié)合模式。同源模擬生成的PDB文件以及分子對(duì)接結(jié)果均使用PyMOL軟件顯示和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 海州香薷兩個(gè)種群細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶蛋白質(zhì)的基本特征

海州香薷細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列為完整的開放閱讀框，由556個(gè)氨基酸殘基組成，兩個(gè)種群海州香薷細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶蛋白質(zhì)的氨基酸組成基本一致，丙氨酸（Ala）、甘氨酸（Gly）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、賴氨酸（Lys）和絲氨酸（Ser）含量較高，均高于6%，無(wú)吡咯賴氨酸（Pyl）和含硒半胱氨酸（Sec）（圖1）。兩個(gè)種群間共有2個(gè)氨基酸趨異位點(diǎn)，其中非礦區(qū)細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶在443位和538位分別為亮氨酸和酪氨酸，而礦區(qū)細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶在這兩個(gè)位點(diǎn)分別為脯氨酸和組氨酸。非礦區(qū)細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶蛋白質(zhì)原子總數(shù)為8 781個(gè)，分子式為C2 823H4 365N765O813S15，分子質(zhì)量為62 510.2 D，理論等電點(diǎn)為9.29。礦區(qū)細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶蛋白質(zhì)原子總數(shù)為8 775個(gè)，分子式C2 819H4 359N767O812S15，分子質(zhì)量為62 468.1 D，理論等電點(diǎn)為9.30。親水/疏水性分析結(jié)果表明，兩個(gè)種群細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶蛋白質(zhì)的疏水性在趨異位點(diǎn)443和538處存在差異，非礦區(qū)種群的細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶蛋白質(zhì)在該區(qū)域具有較強(qiáng)的疏水性（圖2）。

2.2 海州香薷不同種群細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶蛋白質(zhì)的3D結(jié)構(gòu)

非礦區(qū)和礦區(qū)種群海州香薷細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶蛋白質(zhì)的3D結(jié)構(gòu)非常相似，僅在趨異位點(diǎn)Leu433/Pro433和Tyr538/His538處有細(xì)微的差別，如圖3所示。二者均由N-末端類似螺旋槳形狀的β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)域和C-末端的β-折疊區(qū)組成，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域由兩個(gè)較短的α螺旋連接。其中N-末端的結(jié)構(gòu)域由5個(gè)β轉(zhuǎn)角組成，主要負(fù)責(zé)與底物蔗糖結(jié)合，是酶的催化中心，C-末端的結(jié)構(gòu)域由2組反向平行的β折疊組成。

2.3 海州香薷細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶蛋白模擬突變與分子對(duì)接

為了研究海州香薷不同種群細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶活性的差異，從細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶蛋白質(zhì)與底物結(jié)合的角度進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬分析，以非礦區(qū)種群的細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶為基礎(chǔ)，在兩個(gè)種群間的趨異位點(diǎn)處進(jìn)行模擬定點(diǎn)突變，獲得突變體酶蛋白質(zhì)分子EhNcwINV-L433P和EhNcwINV-Y538H，并與蔗糖分子進(jìn)行對(duì)接。首先使用擬南芥細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶蛋白質(zhì)AtcwINV1（PDB ID：2AC1）[11]、突變體AtcwINV1-E203Q（PDB ID：2OXB）、AtcwINV1-E203A（PDB ID：2QQV）和AtcwINV1-D239A（PDB ID：2QQU）[12]的晶體結(jié)構(gòu)模型檢測(cè)海州香薷細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶蛋白質(zhì)與蔗糖的對(duì)接程序，確保對(duì)接結(jié)果的可靠性。

海州香薷細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶與蔗糖分子的對(duì)接模擬結(jié)果顯示，蔗糖分子在EhNcwINV、EhCcwINV、EhNcwINV-L433P和EhNcwINV-Y538H催化活性中心的構(gòu)象基本一致（圖4），呋喃果糖環(huán)上的氧原子O6分別與N46上的氮原子ND2、Q63上的氧原子OE1和W71上的氮原子NE1，O4分別與S107上的N和D173上的OD1，O3分別與D173上的OD2、R172上的NE和E227上的OE2，O2與N46上的ND2，O1與D47上的OD1之間形成氫鍵相互作用。吡喃葡萄糖環(huán)上的O2與E227上的OE2，O3與N260上ND2之間也形成了氫鍵相互作用，使蔗糖分子穩(wěn)定地結(jié)合在細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶的催化活性中心。盡管蔗糖分子與EhNcwINV、EhCcwINV、EhNcwINV-L433P和EhNcwINV-Y538H之間對(duì)接的構(gòu)象基本一致，但在空間位置上存在細(xì)微差異，計(jì)算機(jī)模擬對(duì)接的結(jié)合能分別為-35.42、-35.34、 -35.17和-35.42 kJ/mol（表1）。

3 討論

本研究在前期擴(kuò)增獲得的海州香薷兩個(gè)種群細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶基因全長(zhǎng)cDNA序列（EhNcwINV和EhCcwINV）的基礎(chǔ)上，推測(cè)得到的氨基酸序列屬于GH32糖苷水解酶家族，該家族成員的成熟蛋白質(zhì)有40%～60%的同源性[13]，具有多個(gè)植物細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶基因的保守序列，包括兩個(gè)最為保守的特征基序β-呋喃果糖苷酶（NDPN）和催化區(qū)域的重要組成部分（WECP/VD）。推測(cè)的蛋白分子質(zhì)量及等電點(diǎn)與其他物種已報(bào)道的細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶蛋白質(zhì)都相似[3，14，15]，且與其他物種的細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶氨基酸序列具有較高的同源相似性。幾乎所有高等植物的細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶在催化區(qū)域的保守位點(diǎn)上都有一個(gè)脯氨酸（P）[16]，海州香薷細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶也相同。植物細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶和果糖基轉(zhuǎn)移酶的同源性較高，具有相同的保守區(qū)域，如蔗糖結(jié)合基序、RDP基序和EC基序[17]，海州香薷細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶也具有這些特征序列。

海州香薷非礦區(qū)細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶（EhNcwINV）與礦區(qū)細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶（EhCcwINV）的氨基酸序列存在兩個(gè)趨異位點(diǎn)，這可能是由于兩個(gè)種群長(zhǎng)期生活在不同的環(huán)境中，礦區(qū)種群在銅脅迫下發(fā)生適應(yīng)性進(jìn)化的結(jié)果，從而使礦區(qū)種群具有較高的轉(zhuǎn)化酶活性，獲得更多的能量來(lái)源，用以維持銅抗性機(jī)制。氨基酸序列的改變可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)活性的改變，F(xiàn)ridman等[18]研究證實(shí)番茄細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶催化活性中心附近的一個(gè)氨基酸Glu突變?yōu)锳sp后，其酶活性升高了3倍。NDPN基序和EC基序在轉(zhuǎn)化酶中高度保守，如果將Asp23替換為Asn23，或者將Glu203替換為Ala203，轉(zhuǎn)化酶將失去活性[19]，擬南芥細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶晶體結(jié)構(gòu)X射線衍射分析顯示這兩個(gè)氨基酸殘基與RDP基序中的Asp149都位于轉(zhuǎn)化酶的活性位點(diǎn)[11]。海州香薷細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶EhNcwINV和EhCcwINV對(duì)應(yīng)的NDPN、RDP和EC基序中3個(gè)保守的同源氨基酸分別為Asp47、Asp173和Glu227。最近，通過(guò)對(duì)擬南芥突變體的研究表明，除高度保守的NDPN、RDP和EC基序外，其附近的氨基酸殘基Trp82、Asp239和Lys242對(duì)于底物分子結(jié)合的穩(wěn)定性也具有重要意義，這些位點(diǎn)的突變將改變轉(zhuǎn)化酶水解蔗糖的活性參數(shù)，如Km和Kcat值[12，20，21]。Asp239突變?yōu)锳sn239后與野生型AtcwINV1的活性無(wú)差別，但突變?yōu)锳la239后將使AtcwINV1失去轉(zhuǎn)化酶活性，表現(xiàn)出果聚糖水解酶（1-FEH）活性[20]。AtcwINV1的Trp82、Asp239和Lys242同源氨基酸在海州香薷EhNcwINV和EhCcwINV中分別為Trp106、Asn260和Phe263。顯然，海州香薷兩個(gè)種群細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶的趨異氨基酸位點(diǎn)都不在上述活性位點(diǎn)及其附近。

EhNcwINV和EhCcwINV的2個(gè)趨異位點(diǎn)都位于C末端，盡管不在活性中心及其附近，但Leu433/Pro433緊鄰酸性轉(zhuǎn)化酶保守區(qū)域FGL（430～432），Tyr538/His538靠近保守區(qū)域FNNG（533～536）。這些氨基酸殘基結(jié)構(gòu)的差異可能會(huì)導(dǎo)致其臨近區(qū)域的蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生細(xì)微改變，而這種細(xì)微改變可能會(huì)影響整個(gè)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性或活性。在玉米細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶INCW2中，C末端的一個(gè)胞嘧啶突變?yōu)樾叵汆奏?dǎo)致Pro變?yōu)長(zhǎng)eu，盡管這個(gè)突變位點(diǎn)不在催化活性中心（WECPD），不在糖基化位點(diǎn)，也不在β-呋喃果糖基序（NDPNG）中，但突變使INCW2的蛋白質(zhì)活性在Incw2轉(zhuǎn)錄正常的情況下僅為正常值的6%，這可能是由于該位點(diǎn)的Pro被替換后降低了整個(gè)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[22]。雖然計(jì)算機(jī)模擬結(jié)果表明海州香薷不同種群細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶趨異位點(diǎn)處的疏水性存在差異，但3D結(jié)構(gòu)模擬表明并未造成蛋白質(zhì)構(gòu)象的顯著差異。分子對(duì)接結(jié)果表明EhNcwINV和EhCcwINV與蔗糖分子的結(jié)合構(gòu)象基本一致，且EhNcwINV和EhCcwINV與蔗糖分子對(duì)接的結(jié)合能差異較小，可能是由于趨異的氨基酸位點(diǎn)在C末端，遠(yuǎn)離活性中心，對(duì)活性中心的構(gòu)象沒有產(chǎn)生影響。雖然海州香薷不同種群間的細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶與蔗糖分子結(jié)合的構(gòu)象差異不顯著，但蔗糖分子與細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶蛋白質(zhì)催化活性中心氨基酸之間的空間距離具有細(xì)微差異。雖然模擬定點(diǎn)突變結(jié)果也顯示突變位點(diǎn)差異對(duì)結(jié)合的整體構(gòu)象不產(chǎn)生顯著影響，但蔗糖分子與酶催化中心之間的空間距離發(fā)生細(xì)微變化，這種細(xì)微差別可能是由于趨異氨基酸的結(jié)構(gòu)差異導(dǎo)致其附近的氨基酸殘基的構(gòu)象發(fā)生改變，盡管這種改變很小，但也可能會(huì)傳遞至活性中心的氨基酸，從而使活性中心底物結(jié)合的口袋構(gòu)象產(chǎn)生差異。但是這種構(gòu)象上的細(xì)微差異是否會(huì)導(dǎo)致不同種群間細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶的活性或蛋白質(zhì)穩(wěn)定性表現(xiàn)出顯著差異還需進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證。

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