胎衣不下奶牛母體胎盤差異表達(dá)bta-miR-31分析及驗(yàn)證

劉瑤，張雷，鄭程遠(yuǎn)，鄒曉，羅春海，劉健瑩，付世新

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319）

胎衣不下奶牛母體胎盤差異表達(dá)bta-miR-31分析及驗(yàn)證

劉瑤，張雷，鄭程遠(yuǎn)，鄒曉，羅春海，劉健瑩，付世新

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319）

通過分析及驗(yàn)證胎衣不下奶牛母體胎盤組織中差異bta-miR-31，探討奶牛胎衣不下的發(fā)病機(jī)理。選取年齡胎次體重等因素?zé)o明顯差異并且排除其他疾病影響的胎衣正常排出奶牛（N）和胎衣不下奶牛（F）各3頭作為我們的研究對象，利用HiSeq高通量測序技術(shù)，分析兩組奶牛的母體胎盤組織間bta-miR-31的差異表達(dá)變化，并運(yùn)用qRT-PCR對其進(jìn)行驗(yàn)證。胎衣不下奶牛母體胎盤中bta-miR-31與正常排出組奶牛相比表達(dá)量明顯偏高，經(jīng)Spss19.0分析結(jié)果為P＜0.01，兩組數(shù)據(jù)表現(xiàn)出極顯著的差異。發(fā)生胎衣不下的奶牛母體胎盤中bta-miR-31異常表達(dá)，提示bta-miR-31可能參與胎衣不下的發(fā)生。

胎衣不下；HiSeq；bta-miR-31

奶牛胎衣不下是一種常見的動(dòng)物繁殖障礙性疾病，胎兒胎盤與母體胎盤分離，正常情況下胎衣會(huì)在產(chǎn)后4～6 h排出。胎衣在6～12 h為延遲排出，但仍為正常排出。胎衣在12 h內(nèi)未排出即為胎衣不下[1-3]。該病的發(fā)生會(huì)增加患子宮內(nèi)膜炎的風(fēng)險(xiǎn)，乳房炎與蹄葉炎的發(fā)病率也會(huì)隨之提高。這同時(shí)會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)間隔延長，低產(chǎn)奶量，以及不孕從而造成經(jīng)濟(jì)損失[4]。另一個(gè)引起經(jīng)濟(jì)損失的原因是，胎衣不下奶牛的治療費(fèi)用。1997年，治療一頭胎衣不下奶牛需花費(fèi)285美元[5]。迄今為止，盡管對于胎衣不下的研究為數(shù)不少，但都沒有解釋胎衣不下的根本發(fā)病機(jī)制。microRNA是一類非編碼的小RNA分子，它能夠經(jīng)與之相對應(yīng)的mRNA的3’端非編碼區(qū)互補(bǔ)，調(diào)節(jié)靶向mRNA而發(fā)揮效應(yīng)[6]。從而調(diào)控生物體多樣的生理和病理過程。Luiz L.Coutinho等[7]在牛的免疫細(xì)胞和胚胎組織中發(fā)現(xiàn)了bta-miR-31的存在，而bta-miR-31可能參與胚胎的發(fā)育過程，而胚胎的發(fā)育也可能與胎衣不下的發(fā)生相關(guān)[8]。因此，試驗(yàn)為進(jìn)一步探索發(fā)生胎衣不下的根本原因，對母體胎盤中的差異表達(dá)的bta-miR-31進(jìn)行研究，希望能夠?yàn)樘ヒ虏幌碌陌l(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

液氮，DEPC（Solarbio），瓊脂糖（Sigma），Prime－ScriptTMTranscriptor First Strand cDNA Synthesis Kit Transcriptor（Roche），GenEluteTMMammalianTotal RNA Miniprep Kit sufficient for 10 purifications（Sigma），F(xiàn)astStart TaqManProbe Master（Roche），6× LoadingBuffer（TaKaRa），DL2，000DNAMarker（TaKaRa），無水乙醇、氯仿等試劑均采購于上海生工公司，引物由上海生工合成。

1.2 樣品采集和總RNA提取

在某集約化奶牛場選取各種因素?zé)o明顯差異且排除其他疾病影響的胎衣正常排出奶牛（N）和胎衣不下奶牛（F）每組3頭，并在產(chǎn)后胎衣排出后用子宮內(nèi)膜采樣器采集分別約150 mg兩組奶牛的母體胎盤，將樣品按N1、N2、N3、F1、F2、F3進(jìn)行標(biāo)記。采集來的組織要使用無菌生理鹽水沖洗數(shù)次，沖凈血污后馬上放入液氮罐中儲存，到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后-80℃保存。將采集的樣品從-80℃低溫冰箱中取出，迅速移入液氮中研磨至粉末狀，使樣品一直在液氮中研磨。用Trizol法提取樣品的總RNA（參照RNA提取試劑盒操作說明），提取后的總RNA-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 胎衣不下奶牛胎盤組織差異表達(dá)miRNAs的篩選

提取對照組與實(shí)驗(yàn)組樣品中總RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測，經(jīng)小分子RNA富集、5’端接頭連接和純化、3’端接頭連接和純化、cDNA合成與PCR擴(kuò)增，獲得了小RNA的cDNA文庫。純化小分子RNA文庫，然后通過高通量Solexa平臺（Illumina Genome Analyzer）上機(jī)測序?qū)ξ膸熨|(zhì)量檢測合格，獲得各類miRNA。在Solexa測序中得到的35 nt序列小RNA進(jìn)行生物信息學(xué)分析，對小RNA的各條序列進(jìn)行分類注釋，得到樣品中各組分及表達(dá)量的信息。在運(yùn)用Solexa深度測序技術(shù)鑒定出已知和新發(fā)現(xiàn)miRNAs的條件下，利用建立的母體胎盤組織miRNAs表達(dá)譜，統(tǒng)計(jì)差異表達(dá)的miRNA，通過log2-ratio、Scatter plot圖比較miRNA表達(dá)量間差異，分析兩組間bta-miR-31差異表達(dá)情況。

1.4 Real Time Q-PCR

實(shí)驗(yàn)中所用引物是通過參考文獻(xiàn)中方法自行設(shè)計(jì)[9]，U6為內(nèi)參，見表1。反轉(zhuǎn)錄是根據(jù)Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit Transcriptor（Roche）的說明書進(jìn)行的，其中的引物應(yīng)用我們自行設(shè)計(jì)的RT-bta-miR-31。PCR的進(jìn)行是依據(jù)FastStart Taq－Probe Master（Roche）的說明書進(jìn)行，每組重復(fù)三次，以下為反應(yīng)體系：95℃3 min，94℃20 sec，60℃20 sec，72℃20 sec，72℃5 min，40個(gè)循環(huán)。最后，利用2（-Delta Delta C（T））做結(jié)果分析。

表1 U6和bta-miR-31反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR引物序列Table 1Sequences（5’to3’）of the primers used in the RT-PCR and quantitative real-time PCR

2 結(jié)果

2.1 總RNA提取及濃度測定結(jié)果

對實(shí)驗(yàn)組與對照組樣品中提取的RNA分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳所得結(jié)果如圖1、圖2。由圖1和圖2可以看出28 s、18 s和5 s三條條帶，沒有出現(xiàn)彌散現(xiàn)象，結(jié)果表明RNA樣品無污染、完整、無降解。測量RNA樣品的OD值和濃度結(jié)果見表2。由表2可以看出，OD值均在1.8～2.0之間說明我們提取的RNA純凈無雜質(zhì)。

2.2 差異miRNAs篩選的結(jié)果

在篩選和分析對照組與實(shí)驗(yàn)組母體胎盤組織間的差異miRNAs過程中，我們利用的是HiSeq高通量測序技術(shù)。分析結(jié)果如下，bta-miR-31對照組表達(dá)量為96.613 4，實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)量為：255.405。倍數(shù)變化（fold-change log2E/N）為1.402 491 56，兩組差異極顯著P＜0.01。

圖1 RNA提取后瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（從左起為N1N2N3組）Fig.1The result of agarose gel electrophoresis of total RNA

圖2 RNA提取后瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（從左起為F1 F2 F3組）Fig.2Result of agarose gel electrophoresis of total RNA

表2 提取后的各樣品RNA的濃度Table 2The concentration of RNA in the groups

2.3 熒光定量PCR結(jié)果

用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測正常排出組母體胎盤和胎衣不下組母體胎盤中的bta-miR-31基因的miRNA表達(dá)水平，結(jié)果如圖3，然后用Spss19.0分析結(jié)果可知P＜0.01，兩組差異極顯著。

3 討論

微小RNA（miRNA）幾乎參與生命體的所有生物過程，所以胎衣不下奶牛母體胎盤組織的差異miRNA極有可能參與胎衣不下的發(fā)生[10]。但miRNA具有序列短、同源性高等特點(diǎn)，所以利用基因芯片檢測miRNA尤為困難[11]。solexa高通量測序技術(shù)通量高，價(jià)格低，操作簡便，所以我們選擇運(yùn)用solexa高通量測序技術(shù)對胎衣不下組與胎衣正常排出組的差異miRNA中的miR-31進(jìn)行分析。

圖3 實(shí)驗(yàn)組與對照組子宮肉阜中bta-miR-31基因的miRNA表達(dá)水平Fig.3Relative expression of the bta-miR-31 genes were showed in the control and RFM groups

影響奶牛發(fā)生胎衣不下的因素主要有子宮的收縮、炎癥反應(yīng)、胎盤間的粘附作用、激素、營養(yǎng)代謝、氧化應(yīng)激等[12]。Palma V S E等[13]在研究各個(gè)發(fā)情期的奶牛子宮內(nèi)膜中的miRNA表明，miR-31在發(fā)情周期的3～7 d的子宮內(nèi)膜上大量表達(dá)，并且提示該miRNA可能參與Toll樣受體通路，而toll樣受體參與機(jī)體的免疫反應(yīng)，一些免疫因子恰恰是引起胎衣不下的因素之一[14]。一些研究中表示[15]miR-31能夠參與調(diào)控細(xì)胞的凋亡，而在Kamemori Y等[16]的研究表明，由于脂肪酸合成酶受到抑制導(dǎo)致細(xì)胞凋亡異常極有可能造成胎衣不下發(fā)生。另外，胎衣不下與奶牛的能量代謝也有著聯(lián)系[17]，在對奶牛圍產(chǎn)期能量負(fù)平衡的研究中也同時(shí)發(fā)現(xiàn)了miR-31的顯著表達(dá)，CD14又被預(yù)測為mir-31的靶基因，并且CD14在炎癥反應(yīng)中扮演重要角色[18]。炎癥反應(yīng)可使MAPK通路激活，使細(xì)胞表面的多種粘附因子表達(dá)增加，進(jìn)而另細(xì)胞間的粘附作用和炎癥反應(yīng)的得到促進(jìn)[19]。而炎性反應(yīng)的發(fā)生會(huì)導(dǎo)致胎兒胎盤的粘連，從而導(dǎo)致了胎衣不下的發(fā)生[20]。這進(jìn)一步說明了miR-31參與了奶牛胎衣不下的發(fā)生。同時(shí)，我們的研究中母體胎盤組織中的miR-31也表現(xiàn)出了顯著的上調(diào)，至于miR-31具體通過那些通路調(diào)控胎衣不下的發(fā)生，這有待我們后續(xù)的試驗(yàn)與研究。

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Analysis and Verification of the differentially expressed bta-miR-31 of cow with retained fetal membranes

Liu Yao，Zhang Lei，Zheng Chengyuan，Zou Xiao，Luo Chunhai，Liu Jianying，F(xiàn)u Shixin
（College of Animal Science and Veterinary Medicine，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

The differentially expressed miRNA（bta-miR-31）was analysed and identified to discuss the pathogenesis of retained fetal membranes（RFM）.Three RFM placenta tissues of three cows and the same number of normal placenta tissues were selected as the study object.The variation of different expressed miRNA between nomal fatel membranes（NFM）and RFM tissue was analysed by High throughput sequencing，and identified by qRT-PCR.The expression quantity of bta-miR-31 in NFM group was lower than RFM group.Spss 19.0 analysis result was P＜0.01，which showed significant difference between these two groups.bta-miR-31 in maternal placenta was expressed abnormally，which meant bta-miR-31 participated in the occurance of RFM probably.

RFM；HiSeq；bta-miR-31

S857.2

A

1002-2090（2017）01-0038-04

2015-12-31

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31272629）；黑龍江省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（C201323）。

劉瑤（1992-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院2014級碩士研究生。

付世新，女，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：fushixin@163.com。