李曉婷，宋佰芬，崔玉東

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院）

雞白介素18與雞γ干擾素基因融合表達(dá)載體構(gòu)建

李曉婷1，宋佰芬2，崔玉東1

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院）

為了研究新型細(xì)胞因子制劑，構(gòu)建雞白細(xì)胞介素18和雞干擾素γ的基因融合表達(dá)載體。無菌提取雞脾細(xì)胞的總RNA，以其為模板經(jīng)過RT-PCR的方法分別擴(kuò)增出ChIL-18和ChIFN-γ基因片段，并連接到pMDTM18-T克隆載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMDTM18-T-ChIL-18和pMDTM18-T-ChIFN-γ。以重組質(zhì)粒pMDTM18-T-ChIL-18和pMDTM18-T-ChIFN-γ為模板，利用多肽氨基酸接頭和overlap技術(shù)，獲得ChIL-18-ChIFN-γ融合基因并連接到克隆載體pMDTM18-T上，經(jīng)PCR、酶切及測(cè)序鑒定正確后連接到pET32a原核表達(dá)載體中。構(gòu)建ChIL-18-ChIFN-γ原核表達(dá)載體。為下一步研究二者之間的作用關(guān)系及抗病毒功能奠定了基礎(chǔ)。

雞白細(xì)胞介素18；雞干擾素γ；overlap；原核表達(dá)載體

白介素18（interleukin-18，IL-18）在結(jié)構(gòu)上屬于IL-1家族，在功能上與IL-12相似[1]，雞IL-18作為免疫佐劑，具有增強(qiáng)免疫和治療作用[2]。白細(xì)胞介素18又叫IFN-γ誘導(dǎo)因子，IL-18介導(dǎo)Thl型細(xì)胞反應(yīng)，刺激IFN-γ的產(chǎn)生。分泌白介素18的細(xì)胞主要是單核巨噬細(xì)胞系，其具有多種生物學(xué)功能。白介素18能增強(qiáng)CTL細(xì)胞和NK細(xì)胞的活性，增強(qiáng)Fas介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用[3]，促進(jìn)T細(xì)胞增殖[4]。在增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、抗病原微生物感染、抑制病毒活性等方面有著潛在的應(yīng)用前景。IL-18具有免疫佐劑的作用，已經(jīng)證明IL-18能明顯增加IFN-α的抗病毒活性[5]。白介素18能夠刺激Thl等細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ、GM-CSF、IL-2等細(xì)胞因子[6-7]。Digby等[8]于1995年成功克隆雞干擾素γ（interferon γ，IFN-γ）的基因，隨后，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)IFN-γ是機(jī)體發(fā)揮免疫功能[9]，清除體內(nèi)病原體不可缺少的成分。IFN-γ，又被稱為免疫干擾素，主要由活化的T淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞產(chǎn)生。IFN-γ具有強(qiáng)效免疫調(diào)節(jié)，抗腫瘤，和抗病毒特性的細(xì)胞因子[10]。IFN-γ參與誘導(dǎo)MHC類抗原的表達(dá)和免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)的重要作用，IFN-γ可以提高機(jī)體抵抗力、增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬活性以及淋巴細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的特殊細(xì)胞毒性[11]。禽IFN-γ具有增強(qiáng)機(jī)體二次免疫應(yīng)答、提高機(jī)體抵抗力和促進(jìn)生長(zhǎng)等作用，是一種有效的免疫佐劑和治療型制劑。很多研究也證明白介素18和干擾素γ具有抗病毒的功能。因此備受國內(nèi)外研究者的關(guān)注。

實(shí)驗(yàn)采用overlap的方法，將重組質(zhì)粒ChIL-18和ChIFN-γ串聯(lián)在一起，構(gòu)建ChIL-18-ChIFN-γ的克隆和原核表達(dá)載體。使得IL-18和IFN-γ能同時(shí)發(fā)揮作用，利用IL-18能促進(jìn)IFN-γ分泌研究IL-18作為外源佐劑的作用，以及對(duì)IFN-γ抗病毒活性的影響。為后續(xù)研究二者是否具有免疫相關(guān)性以及該蛋白是否具有較單獨(dú)蛋白更強(qiáng)的抗病毒活性研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸埃希菌Escherichia coli BL21、DH5α菌株購自天根生化科技有限公司，質(zhì)粒載體pET-32a由實(shí)驗(yàn)室保存，克隆載體pMDTM18-T購自寶生物公司。

1.1.2 試劑

LPS購自上海生工有限公司；ConA、氨芐青霉素和IPTG購自Sigma試劑公司；trizol購自ambion公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和DMEM改良型RPMI-1640培養(yǎng)液購自賽默飛世爾科技有限公司；胎牛血清（FCS）購自GIBCO公司；Taq DNA聚合酶購自Trans公司；T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司；限制性內(nèi)切酶（BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ）購自Fermentas公司；質(zhì)粒提取及DNA純化試劑盒購自Axygen公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成

用primer5輔助設(shè)計(jì)引物，根據(jù)GeneBank登陸的ChIL-18（gb|AY775780.1|）基因序列設(shè)計(jì)上游和下游引物F1、R1，上游引入酶切位點(diǎn)BamHⅠ，下游引入酶切位點(diǎn)HindⅢ；ChIFN-γ（gb|FJ788637.1|）基因序列設(shè)計(jì)上游和下游引物F2、R2上游引入酶切位點(diǎn)EcoRⅠ，下游引入酶切位點(diǎn)HindⅢ；設(shè)計(jì)人工肽段linker（（G4S）3）將雞白介素18和雞干擾素γ融合，命名為ChIL-18-ChIFN-γ，采用overlapPCR方法設(shè)計(jì)連接白介素18和干擾素γ的引物P1、P2，分別引入酶切位點(diǎn)BamHⅠ和HindⅢ。引物均由上海生工合成。實(shí)驗(yàn)所用引物詳見表1，下劃線代表引入的Enzyme loci。

表1 試驗(yàn)所用引物Table 1Primer used in the experiment

1.2.2 ChIL-18和ChIFN-γ目的片段的獲得

1.2.2.1 雞脾淋巴細(xì)胞總RNA的提取

提取雞脾臟淋巴細(xì)胞總RNA，具體實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[12]。方法如下：無菌取本地三黃雞雞脾，收集單層淋巴細(xì)胞。在37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時(shí)后分別加10 μg·mL-1的LPS和10 μg·mL-1的ConA刺激物培養(yǎng)12小時(shí)。取出后按trizol說明書提取細(xì)胞總RNA。測(cè)RNA濃度，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定提取物。

1.2.2.2 RT-PCR擴(kuò)增目的基因

將提取的細(xì)胞總RNA利用thermo逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，在無Rnase的0.5 ml EP管中加入提取的RNA 3 μL，隨機(jī)引物1 μL，DEPC水8.5 μL于65℃作用5 min，再加buffer 4 μL，dntp 2 μL，逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL，逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑0.5 μL在42℃作用2 h，再于72℃作用10 min，獲得的產(chǎn)物為cDNA。以此cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將利用LPS刺激細(xì)胞獲得的cDNA用F1和R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用ConA刺激細(xì)胞獲得的cDNA用F2和R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。取5 μL PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，觀察結(jié)果。

1.2.2.3 ChIL-18和ChIFN-γ目的基因片段的克隆

將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，在280 nm波長(zhǎng)的紫外光照射下切取目的條帶，利用膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化DNA。用獲得的目的DNA利用連接儀連接到pMDTM18-T載體上。將反應(yīng)產(chǎn)物導(dǎo)入到裝有大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Dh5α中，將培養(yǎng)好的菌液均勻涂到含有0.1%AMP+抗性的固體LB培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)8-12 h。挑取陽性菌株接種到3 mL含有0.1%AMP+抗性的液體LB培養(yǎng)基中進(jìn)行37℃，180 rpm·min-1震蕩培養(yǎng)10～12 h，進(jìn)行PCR、測(cè)序和雙酶切鑒定。

1.2.3 ChIL-18-ChIFN-γ融合表達(dá)載體的構(gòu)建

1.2.3.1 ChIL-18-ChIFN-γ融合基因的構(gòu)建

參照文獻(xiàn)[13]，用F1、P1引物對(duì)，以pMDTM18-TChIL-18為模板，以及P2、R2引物對(duì)，以pMDTM18-T-ChIFN-γ為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，利用膠回收試劑盒回收純化ChIL-18和ChIFN-γ。回收的目的片段各自帶有l(wèi)inker的上游和下游，將兩種片段各取1 μL混合后用作模板，以F1、R2為引物，P1、P2引物中的linker相互結(jié)合將兩段片段串聯(lián)在一起，形成融合基因ChIL-18和ChIFN-γ，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。產(chǎn)物利用膠回收試劑盒回收純化目的片段。

1.2.3.2 ChIL-18-ChIFN-γ融合基因的克隆、測(cè)序

將1.2.3.1中回收回來的PCR產(chǎn)物定向?qū)氲絧MDTM18-T載體中，轉(zhuǎn)化到Dh5α感受態(tài)細(xì)胞中，37℃震蕩培養(yǎng)1 h后將菌液均勻涂到含有0.1% AMP+抗性的固體LB培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng)8～12 h后，挑取陽性克隆菌株轉(zhuǎn)接到含有0.1%AMP+抗性的LB培養(yǎng)液中。篩選陽性菌株送到吉林庫美生物工程有限公司測(cè)序鑒定。將鑒定正確的陽性菌株采用質(zhì)粒提取試劑盒提取陽性質(zhì)粒pMDTM18-T-ChIL-18-ChIFN-γ。加BamHⅠ和HindⅢ對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切后連接到同樣被BamHⅠ和HindⅢ酶切后的pET-32a質(zhì)粒中，將構(gòu)建好的pET-32a-ChIL-18-ChIFN-γ重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中。經(jīng)培養(yǎng)后篩選陽性菌株送到吉林庫美生物工程有限公司測(cè)序鑒定。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR擴(kuò)增ChIL-18和ChIFN-γ

以提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，分別用F1、R1和F2、R2兩組引物PCR擴(kuò)增出目的片段長(zhǎng)度為597 bp的ChIL-18和495 bp的ChIFN-γ。用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果與預(yù)期大小相符，如圖1。

圖1 ChIL-18和ChIFN-γ的凝膠電泳結(jié)果Fig.1Gel electrophoresis results of ChIL-18 and ChIFN-γ

2.2 ChIL-18和ChIFN-γ片段的克隆

將上述PCR產(chǎn)物連接到pMDTM18-T載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌后進(jìn)行PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定。測(cè)序結(jié)果中ChIFN-γ與GeneBank登陸ChIFN-γ（gb｜FJ788637.1｜）基因序列BLAST結(jié)果完全一致，ChIL-18與GeneBank登陸的ChIL-18（gb｜AY775780.1｜）基因序列BLAST結(jié)果顯示存在兩個(gè)點(diǎn)突變，而其中一個(gè)點(diǎn)突變導(dǎo)致一個(gè)氨基酸突變。PCR鑒定結(jié)果如圖2，雙酶切鑒定結(jié)果如圖3。

2.3 ChIL-18-ChIFN-γ融合基因的構(gòu)建

以膠回收PCR產(chǎn)物ChIL-18和ChIFN-γ各取1 μL混勻?yàn)槟０?，用F1、R2引物對(duì)混合物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得大小為1128 bp的ChIL-18-ChIFN-γ。目的片段的長(zhǎng)度與預(yù)期相一致。說明采用overlap方法成功構(gòu)建融合基因。將目的片段連接到pMDTM18-T克隆載體中，經(jīng)測(cè)序鑒定表明成功構(gòu)建克隆菌株pMDTM18-T-ChIL-18-ChIFN-γ。PCR鑒定結(jié)果如圖4，雙酶切鑒定結(jié)果如圖5。

圖2 ChIL-18和ChIFN-γ的PCR鑒定結(jié)果Fig.2PCR identification results of ChIL-18 and ChIFN-γ

圖3 ChIL-18和ChIFN-γ的雙酶切鑒定結(jié)果Fig.3Double enzyme digestion of ChIL-18 and ChIFN-γ

圖4 pMDTM18-T-ChIL-18-ChIFN-γ的PCR鑒定結(jié)果Fig.4PCR identification results of pMDTM18-TChIL-18-ChIFN-γ

圖5 pMDTM18-T-ChIL-18-ChIFN-γ的雙酶切鑒定結(jié)果Fig.5Double enzyme digestion of pMDTM18-TChIL-18-ChIFN-γ

2.4 ChIL-18-ChIFN-γ融合基因表達(dá)載體的構(gòu)建

陽性菌株pET-32a-ChIL-18-ChIFN-γ測(cè)序結(jié)果表明目的基因序列全長(zhǎng)為1 128 bp，與克隆載體測(cè)序結(jié)果一致。表明成功構(gòu)建ChIL-18-ChIFN-γ融合基因表達(dá)載體。PCR鑒定結(jié)果如圖6，雙酶切鑒定結(jié)果如圖7。

圖6 pET-32a-ChIL-18-ChIFN-γ的PCR鑒定結(jié)果Fig.6PCR identification results of pET-32a-ChIL-18-ChIFN-γ

3 討論

IL-18是一種具有很多種免疫學(xué)功能的細(xì)胞因子，它在抗腫瘤、抗感染、抗炎癥及自身免疫性疾病治療中都有非常好的應(yīng)用前景。當(dāng)病毒侵染機(jī)體時(shí)先后激活巨嗜細(xì)胞中的caspase蛋白酶4、8、9和1、3，然后通過caspase-l將沒有活性的IL-18的前體蛋白剪切成為成熟的蛋白。而成熟的IL-18又刺激T細(xì)胞和NK細(xì)胞分泌IFN-γ。然后IFN-γ和被感染的巨嗜細(xì)胞分泌的IFN-γ又能反過來促進(jìn)caspase蛋白酶的表達(dá)[14]。干擾素因其具有廣譜抗病毒、抗腫瘤的活性及免疫調(diào)節(jié)作用，現(xiàn)已成為病毒學(xué)、細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)研究[15]。干擾素γ對(duì)多數(shù)病毒都具有明顯的抑制作用，活性高，可以產(chǎn)生顯著的抗病毒作用。ChIL-18蛋白可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，明顯誘導(dǎo)IFN-γ基因表達(dá)，增強(qiáng)疫苗的免疫效果。

圖7 pET-32a-ChIL-18-ChIFN-γ的雙酶切鑒定結(jié)果Fig.7Double enzyme digestion of pET-32a-ChIL-18-ChIFN-γ

研究使用一個(gè)柔性的linker利用overlap方法在體外連接ChIL-18和ChIFN-γ基因，該方法簡(jiǎn)單快速，linker并不會(huì)引起兩種蛋白的相互影響。串聯(lián)產(chǎn)物為下一步研究ChIL-18-ChIFN-γ融合蛋白的生物學(xué)活性和應(yīng)用奠定了有力基礎(chǔ)。該融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建為后續(xù)研究開發(fā)新型多功能、多靶點(diǎn)的細(xì)胞因子制劑奠定基礎(chǔ)。

一般來說，IFN-γ有比較嚴(yán)格的種屬特異性，不同物種之間使用會(huì)降低其生物活性。實(shí)驗(yàn)采用雞源的脾臟細(xì)胞進(jìn)行提取RNA，是因?yàn)槠⑴K中含有的T細(xì)胞比例較大，其他細(xì)胞相對(duì)較少。實(shí)驗(yàn)克隆到的雞IFN-γ基因與GenBank中登陸號(hào)為gb|FJ788637.1|的核苷酸序列同源性達(dá)到了100%，表明雞IFN-γ基因是比較保守的，而雞IL-18基因與GenBank中登陸號(hào)為gb|AY775780.1|的核苷酸序列同源性為99%，存在兩個(gè)不同的堿基，BLAST分析僅有一個(gè)氨基酸不同，與GeneBank中原序列相比，不同的氨基酸在第101位由原序列的賴氨酸變成精氨酸。進(jìn)行多次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果在該位置的氨基酸都為精氨酸，分析原因可能是雞個(gè)體差異。賴氨酸與精氨酸同屬于堿性氨基酸，分析該不同氨基酸并不影響整個(gè)融合蛋白的生物活性和應(yīng)用。

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)主要采用overlap方法將兩段目的基因連接，連接產(chǎn)物具有一株菌表達(dá)兩種蛋白的優(yōu)勢(shì)，為研究他們的共同抗病毒作用奠定了夯實(shí)的基礎(chǔ)。

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Construction of Chicken Interleukin 18 and Interferon Gamma Gene Fused Expression Vector

Li Xiaoting1，Song Baifen2，Cui Yudong1
（1.College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；
2.College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University）

In order to study the new cytokine preparation，the fused expression vectors of chicken interleukin 18 and interferon-γ gene were constructed.Total RNA of chicken spleen cells was extracted aseptically.ChIL-18 and ChIFN-γ gene fragments were amplified by RT-PCR method，then cloned into pMDTM18-T and constructed recombinant plasmid pMDTM18-T-ChIL-18 and pMDTM18-T-ChIFN-γ.Fused gene of ChIL-18-ChIFN-γ was obtained by peptide amino acid linker，overlap technology was used to recombinant plasmid pMDTM18-T-ChIL-18 and pMDTM18-T-ChIFN-γ as template.，ChIL-18-ChIFN-γ were clonedinto pMDTM18-T vector and were identified by PCR，digestion and sequencing.Positive plasmid was digested by restriction endonuclease and fused gene was inserted into pET32aprokaryotic expression vector.The prokaryotic expression vector of ChIL-18-ChIFN-γ was successfully constructed.It laid the foundation for studying the role of their relationship and the antiviral function.

Chicken Interleukin 18；chicken interferon gamma；overlap；fused expression vector

S85；S83

A

1002-2090（2017）01-0049-05

2015-12-10

黑龍江農(nóng)墾總局攻關(guān)項(xiàng)目（HNK125A-11-05）。

李曉婷（1991-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院2014級(jí)碩士研究生。

崔玉東，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：cuiyudong@yahoo.com。