枸杞多糖改善糖尿病腎病作用的研究

趙蕊，王春仁，黃玉蘭，賈桂燕

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院）

枸杞多糖改善糖尿病腎病作用的研究

趙蕊1，2，王春仁1，黃玉蘭1，賈桂燕1

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院）

應(yīng)用2型糖尿病小鼠模型，觀察中藥活性成分枸杞多糖（LBP）對2型糖尿病小鼠腎臟的保護(hù)作用。免疫組化半定量法檢測各組小鼠腎組織PPAR-γ蛋白的表達(dá)，并通過Western blot檢測LBP對2型糖尿病小鼠腎組織中的p38MAPK表達(dá)的影響，初步探討LBP改善糖尿病腎?。―N）的可能作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常對照組比較，2型糖尿病小鼠腎組織PPAR-γ蛋白含量降低，LBP作用4 w后，能上調(diào)2型糖尿病小鼠腎組織PPAR-γ蛋白含量，且還能對高糖引起的腎組織p38MAPK活性增加表現(xiàn)出明顯的對抗作用。總之，LBP對2型糖尿病小鼠腎組織具有保護(hù)作用，且與上調(diào)PPAR-γ蛋白表達(dá)有關(guān)。

枸杞多糖；糖尿病腎病；PPAR-γ；p38MAPK

糖尿病腎?。―N）的主要病因是由于糖代謝異常所致的腎小球硬化，并伴有尿蛋白含量增高，是2型糖尿病中最常見的并發(fā)癥之一。西醫(yī)藥尚無安全有效的治療手段。而中醫(yī)藥可從整體水平對DN進(jìn)行綜合調(diào)理，因此，研究開發(fā)高效低毒的治療DN的藥物，對于延長患者的壽命，提高生活質(zhì)量具有重大的意義。枸杞子是我國藥食兩用的名貴中藥材，枸杞多糖（LBP）是枸杞子中的主要活性成分，具有廣泛的藥理作用。研究表明，過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）-γ與DN的發(fā)病有密切的關(guān)系，上調(diào)PPAR-γ蛋白水平可明顯改善DN小鼠腎臟的損傷[1]。血糖持續(xù)升高可激活p38MAPK的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致DN的發(fā)生、發(fā)展。p38MAPK是細(xì)胞信號傳導(dǎo)的交匯點(diǎn)[2]，但它在DN發(fā)病中的作用機(jī)制以及它與PPAR-γ關(guān)聯(lián)的研究國內(nèi)外尚未見報道。研究應(yīng)用2型糖尿病小鼠模型，觀察LBP對2型糖尿病小鼠腎臟的保護(hù)作用，并通過檢測LBP對2型糖尿病小鼠腎組織中的PPAR-γ和p38MAPK表達(dá)的影響，初步探討LBP改善DN的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

選取4周齡，體重20±2 g的SPF級昆明小鼠（購于長春白求恩醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心）。

1.2 主要試劑

尿微量白蛋白試劑盒、肌酐試劑盒、尿素氮試劑盒（北京晶美生物技術(shù)有限公司）；PPAR-γ和Phospho-p38MAPK單克隆抗體（Santa Cruz Biotechnology公司）；SP免疫組化染色試劑盒和DAB顯色試劑盒（北京晶美生物技術(shù)有限公司）；ECL顯色試劑盒（Santa Cruz Biotechnology公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 枸杞多糖制備

寧夏枸杞子烘干粉碎，氯仿：甲醇（2∶1）回流脫脂、脫色處理。用80%的乙醇脫小分子糖后于80℃下進(jìn)行水提，提取3次，合并濾液，減壓蒸餾濃縮，置于95%的乙醇中過夜，離心。獲得的沉淀分別用95%的乙醇、無水乙醇、丙酮脫水，最后經(jīng)真空干燥得LBP。

1.3.2 型糖尿病小鼠模型的建立與分組

小鼠隨機(jī)分為正常組和造模組。正常組給予普通飼料喂養(yǎng)。造模組小鼠先給予高糖高脂飲食4 w，再行一次性腹腔注射0.5%的鏈脲佐菌素（STZ，現(xiàn)用現(xiàn)配，60 mg·kg-1），3 d后用京都血糖儀空腹測血糖。模型成功的小鼠（血糖濃度＞11.1 mmol·L-1）再隨機(jī)分為模型對照組、LBP（200 mg·kg-1）組和羅格列酮組（3 mg·kg-1），按照每10 g小鼠體重0.2 mL持續(xù)灌胃4 w，正常對照組和模型對照組給予同等劑量的生理鹽水。

1.3.3 尿微量白蛋白檢測及生化分析

各組小鼠給藥4 w后，收集24 h尿液，離心，ELISA法測量尿微量白蛋白（Urinary albumin）。摘眼球取血，分離血清，全自動生化分析儀檢測尿素氮（BUN）和血肌酐（Scr）水平。小鼠處死后取腎臟，稱重，計(jì)算腎指數(shù)（腎重/體重（%））。取其中部分腎組織用于HE染色及免疫組化分析，另取一部分腎皮質(zhì)迅速置于液氮中用作蛋白提取。

1.3.4 病理學(xué)檢查

取適量腎組織在4%中性多聚甲醛中固定，脫水、透明及石蠟包埋制片等處理，5 μm厚度切片。HE常規(guī)染色，中性樹膠封片。光鏡觀察，記錄病理形態(tài)學(xué)變化。

1.3.5 免疫組化法檢測PPAR-γ在蛋白水平的表達(dá)

免疫組化半定量分析各組小鼠腎組織中PPAR-γ蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果觀察：每組6張切片，隨機(jī)選取20個視野，根據(jù)染色強(qiáng)度和面積計(jì)算陽性細(xì)胞占視野內(nèi)細(xì)胞數(shù)的比例并計(jì)分，具體評分為：陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)低于25%的為（+/-），25%～50%為（+），51%～75%為（++），超過75%的為（+++），且計(jì)為1、2、3、4分；染色強(qiáng)度分別以（+/-）、（+）、（++）表示，計(jì)為1、2、3分；二者分?jǐn)?shù)乘積作為免疫組化結(jié)果。

1.3.6 各組小鼠腎皮質(zhì)磷酸化p38 MAPK的檢測

稱取100 mg腎皮質(zhì)，用組織裂解液裂解后勻漿用超聲細(xì)胞粉碎儀超聲，離心取上清，BCA法測定蛋白濃度。定量后取各組標(biāo)本經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后濕法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。加入相應(yīng)的稀釋一抗，4℃孵育過夜。洗膜后加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，ECL試劑盒進(jìn)行顯影，凝膠成像系統(tǒng)采集成像。Western blot檢測條帶用凝膠成像儀分析系統(tǒng)Quantity One軟件掃描灰度值。計(jì)算目的蛋白與β-actin灰度值的比值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

所有的數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，兩組資料的比較采用兩樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)。多組間樣本比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 LBP對2型糖尿病小鼠腎功能的影響

為了研究枸杞多糖對2型糖尿病小鼠腎臟的保護(hù)作用，首先檢測造模后LBP處理4 w對2型糖尿病小鼠腎功能的影響，表1結(jié)果顯示，與正常對照組相比，STZ誘導(dǎo)的模型對照組小鼠的BUN、尿微量白蛋白、Scr、腎重/體重比值水平均增高（P＜0.01）。LBP灌胃4 w后，上述腎功能指標(biāo)均有降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），LBP給藥組與羅格列酮組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明LBP可以減輕2型糖尿病小鼠的腎損傷。

2.2 各組小鼠腎臟組織的HE染色結(jié)果觀察

為進(jìn)一步觀察LBP改善2型糖尿病小鼠的腎損傷，實(shí)驗(yàn)從形態(tài)學(xué)角度做了進(jìn)一步分析。各組小鼠腎組織HE染色切片觀察發(fā)現(xiàn)，正常小鼠腎小球大小適中，結(jié)構(gòu)完整，腎小管形態(tài)正常，無炎癥細(xì)胞浸潤和纖維組織增生。2型糖尿病小鼠腎小球體積增大，腎小管結(jié)構(gòu)模糊。LBP和羅格列酮作用4 w后，光鏡下觀察小鼠腎小球結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，結(jié)果顯示如圖1。

表1 LBP對2型糖尿病小鼠腎功能的影響Table 1Effect of LBP on renal function in type 2 diabetic mice

圖1 腎組織形態(tài)學(xué)變化（HE×400）Fig.1Morphological changes of kidney tissue（HE×400）

2.3 免疫組化分析小鼠腎組織PPAR-γ蛋白表達(dá)

為了探討枸杞多糖改善DN的可能機(jī)制，檢測腎病相關(guān)蛋白PPAR-γ的表達(dá)。圖2顯示各組小鼠腎組織PPAR-γ免疫組化染色結(jié)果。顯微鏡下顯示PPAR-γ陽性表達(dá)為棕黃色，根據(jù)染色強(qiáng)度和面積進(jìn)行半定量分析顯色結(jié)果。表2結(jié)果統(tǒng)計(jì)了各組小鼠腎組織PPAR-γ蛋白的表達(dá)含量。正常組小鼠腎組織PPAR-γ高表達(dá)，但是模型組PPAR-γ表達(dá)降低，與正常組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），與模型組比較，LBP和羅格列酮組PPAR-γ表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.4 Western bIot法檢測磷酸化p38MAPK蛋白表達(dá)

最后，通過分析磷酸化p38MAPK蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)一步研究LBP改善DN的可能機(jī)制。圖3顯示W(wǎng)estern blot法檢測各組小鼠腎皮質(zhì)p38MAPK蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型對照組p38MAPK蛋白表達(dá)量明顯增多；與模型對照組相比，LBP和羅格列酮兩組小鼠腎皮質(zhì)的p38MAPK表達(dá)量降低。

圖2 PPAR-γ蛋白在各組小鼠腎臟中的表達(dá)（×400）Fig.2The protein expression of PPAR-γ in kidneys of mice（×400）

表2 LBP對2型糖尿病小鼠腎組織PPAR-γ表達(dá)的影響Table 2Effect of LBP on the expression of PPAR-γ in kidney of in type 2 diabetic mice

圖3 LBP對2型糖尿病小鼠腎皮質(zhì)p38MAPK蛋白表達(dá)的影響Fig.3Effect of LBP on the expression of p38MAPK in renal cortex of type 2 diabetic mice

3 討論

糖尿病性腎病是糖尿病引起的嚴(yán)重和危害性最大的一種慢性并發(fā)癥，亦是糖尿病患者致死的主要原因之一。腎臟肥大，腎小球?yàn)V過功能異常和微量蛋白尿是本癥的主要特點(diǎn)[3]。研究結(jié)果顯示，小鼠經(jīng)高糖高脂飲食誘導(dǎo)，結(jié)合腹腔注射STZ造模后，2型糖尿病小鼠的尿素氮、血肌酐和尿微量白蛋白水平較正常小鼠均有顯著增加，腎重/體重指數(shù)明顯上升，說明2型糖尿病模型小鼠機(jī)體存在腎臟損傷，發(fā)生了腎病并發(fā)癥。課題組的前期研究結(jié)果證明LBP有很好的降糖活性，且能夠增加2型糖尿病大鼠的胰島素敏感性[4]，但其改善DN的活性及作用機(jī)制目前尚未完全闡明。實(shí)驗(yàn)旨在通過觀察LBP對2型糖尿病小鼠的腎臟保護(hù)作用，探討其改善DN的作用及機(jī)制，為進(jìn)一步研究LBP的臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)支持。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，經(jīng)LBP處理4 w后，腎功能等生化指標(biāo)得到改善（見表1）。表明LBP對糖尿病腎病具有一定的治療作用。

胰島素增敏劑噻唑烷二酮（TZDs）是臨床治療2型糖尿病和糖尿病腎臟并發(fā)癥常用的藥物，TZDs是PPAR-γ的配體，也是PPAR-γ的激動劑。而羅格列酮是TZDs的一種[5]。研究表明PPAR-γ在維持正常腎臟功能上起到重要作用，PPAR-γ的高表達(dá)與防治DN的發(fā)生有密切關(guān)系[6]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PPAR-γ蛋白在正常組小鼠腎組織中呈現(xiàn)功能性表達(dá)，但是PPAR-γ蛋白的表達(dá)在2型糖尿病性腎病小鼠卻明顯降低，實(shí)驗(yàn)經(jīng)LBP和羅格列酮灌胃給藥4 w后，小鼠腎臟病理形態(tài)學(xué)異常得到改善，且與模型組小鼠相比，腎組織PPAR-γ蛋白表達(dá)增加，這提示LBP可能發(fā)揮了PPAR-γ的特異性配體作用，通過與PPAR-γ結(jié)合，進(jìn)而影響了與胰島素效應(yīng)相關(guān)的某些基因的表達(dá)，最終改善2型糖尿病小鼠的腎功能。在DN的發(fā)展過程中，炎癥相關(guān)信號通路-p38絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路與腎組織損傷密切相關(guān)[7]。研究顯示，持續(xù)高血糖能激活p38MAPK通路，進(jìn)而發(fā)揮其相應(yīng)的生物學(xué)功能[8]，如P38 MAPK在高血糖所致的內(nèi)皮通透性增高中起著主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用[9]。高血糖可以使P38MAPK磷酸化，活性明顯升高，活化的P38MAPK作用于底物MAPKAP-K2/K3，后者則使熱休克蛋白-27（HSP-27）磷酸化。試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，給予LBP和羅格列酮灌胃4 w后，2型糖尿病小鼠腎組織的p38MAPK表達(dá)顯著減少。由此可見，LBP對持續(xù)高血糖引起的腎組織p38MAPK活性增加表現(xiàn)出明顯的抑制作用。

4 結(jié)論

LBP對2型糖尿病小鼠損傷的腎臟具有改善作用，其機(jī)制可能與LBP抑制p38MAPK蛋白表達(dá)水平，激活2型糖尿病小鼠腎組織PPAR-γ有關(guān)。

［1］Gao D，Li Q，Gao Z，et al.Antidiabetic effects of Corni Fructus extract in streptozotocin_induced diabetic rats［J］. Yonsei Med J，2012，53（4）：691-700.

［2］Fujita H，Omori S，Ishikura K，et al.ERK and p38 mediate high-glucose-induced hypertrophy and TGF-beta expression in tubular cells［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2004，286（1）：120-126.

［3］周強(qiáng)，仝小林，劉桂芳，等.糖尿病腎病的中醫(yī)臨床治療概況［J］.中醫(yī)藥信息，2011，29（1）：95-97.

［4］Zhao R，Li Q W，Xiao B.Effect of Lycium barbarum polysaccharide on the improvement of insulin resistance in NIDDM rats［J］.Yakugaku Zasshi，2005，125（12）：981-988.

［5］Rane M J，Song Y，Jin S，et a1.Interplay between Akt and p38MAPK pathways in the regulation of renal tubular cell apoptosis associated with diabetic nephropathy［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2010，298（1）：49-61.

［6］Wang F F，Mullican S E，Dispirito J R，et al.Lipoatrophy and severe metabolic disturbance in mice with fat-specific deletion of PPAR-γ［J］.Proc Nati Acad Sci，2013，110（46）：18656-18661.

［7］Zhang R，ZhouS J，Li C J，et al.C-reactive protein/oxidised low-density lipoprotein/β2-glycoprotein I complex promotes atherosclerosis in diabetic BALB/c mice via p38mitogen-activated protein kinase signal pathway［J］.Lipids Health Dis，2013，26（12）：42.

［8］王健楠，阮洪生，崔玉東，等.身痛逐瘀湯通過調(diào)控P38 MAPK信號通路抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞一氧化氮的分泌［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報，2015，27（3）：75-78.

［9］Mima A，Kitada M，Geraldes P，et al.Glomerular VEGF resistance induced by PKCδ/SHP-1 activation and contribution to diabetic nephropathy［J］.FASEB J，2012，26（7）：2963-2974.

Study of Lycium Barbarum.Polysaccharide on Diabetic Nephropathy

Zhao Rui1，2，Wang Chunren1，Huang Yulan1，Jia Guiyan1
（1.College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.Basic Medical Science College，Harbin Medical University）

The protective effect of Lycium barbarum.polysaccharides（LBP）was observed in kidney of type 2 diabetic mice model.To explore the possible mechanisms of LBP on diabetic nephropathy（DN），the protein expression of PPAR-γ in kidney was tested by immunohistochemical method，and the p38MAPK expression was detected through the Western blot.The results showed that the protein expression of PPAR-γ in kidney was decreased compared with control group.After 4 w treatment，the protein level of PPAR-γ in kidney increased，and LBP also showed the obvious antagonism on p38MAPK in kidney tissues by high sugar.In a word，LBP had a protective effect in kidney of type 2 diabetic mice by improving the protein level of PPAR-γ signaling pathway.

Lycium barbarum；polysaccharides；diabetic nephropathy；PPAR-γ；p38MAPK

R285

A

1002-2090（2017）01-0089-05

2016-05-15

LBP擇時給藥逆轉(zhuǎn)小鼠胰島素抵抗的晝夜節(jié)律機(jī)制（2014M551281）。

趙蕊（1975-），女，副教授，燕山大學(xué)畢業(yè)，現(xiàn)主要從事新藥研究與開發(fā)方面的研究工作。