伍嬌，饒大偉，嚴濤，王爽，陳鵬，張永奎，楊坤,*

1. 四川大學化學工程學院，成都 610065 2. 夏威夷馬諾大學土木與環(huán)境工程系，美國 夏威夷 96822

細菌抗藥性(antibiotic resistance，AR)熱點不僅僅局限在醫(yī)療行業(yè)，許多其他環(huán)境場所，如市政污水處理系統(tǒng)、制藥廠的排污、水產及畜牧養(yǎng)殖廠，因受到人為抗生素壓力的作用，也成為抗生素抗性釋放進入環(huán)境的熱點[1]。越來越多的證據表明：環(huán)境中的抗生素抗性可以傳遞給臨床致病菌，從而威脅人類健康[2-4]，這使得細菌的抗藥性成為緊迫的環(huán)境問題。而抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes，ARGs)也越來越被認為是新興的環(huán)境污染物[5]。它們和重金屬一樣，具有其他持久化學污染物 “易形成，難消除”的特性[6-7]。在抗生素的選擇性壓力下，細菌抗藥性可以持久地存在于環(huán)境中。針對單個菌和細菌群落水平的適應性代價研究表明：在沒有抗生素選擇性壓力的情況下，抗性菌通常也能續(xù)存相當長的一段時間[8]。抗性基因與其他被選擇基因之間在基因水平上的鏈接會導致所謂的共選擇效應。由此，一個非被選擇的抗藥性由于其與被選擇基因之間存在某種鏈接而能夠續(xù)存在生態(tài)群落中[9]。有報道證明這種共選擇效應不僅存在于不同的細菌抗藥性之間[10-12]，也存在于抗生素與其他選擇性壓力如重金屬[13-14]、清潔劑和殺蟲劑[15]之間，從而使得細菌抗藥性在沒有抗生素選擇性壓力下，也能在環(huán)境中續(xù)存相當長的時間。由此，估計環(huán)境中細菌抗藥性的影響范圍及程度并評估抗藥性感染風險而非單純檢測釋放入環(huán)境中的抗生素，對于維護人類健康顯得尤為重要。

但時至今日，在評估環(huán)境抗藥性方面仍存在技術障礙[1]。到目前為止，直接用于環(huán)境樣品的抗藥性測試方法仍未開發(fā)。一種好的方法應該能實現從地理上相隔較遠的環(huán)境區(qū)劃采集到的樣品間的對比，并能夠追蹤抗性的動態(tài)變化。世界范圍內的微生物學家和環(huán)境科學家均借鑒臨床標準判斷菌體是否抗藥，需要預設抗藥閾值。這一預設的抗藥閾值通常具有臨床意義，但對于環(huán)境研究，其缺乏統(tǒng)計意義，且并不適用于所有的環(huán)境區(qū)劃。此外，也有可能忽略一些潛在的抗藥性機制。盡管基于非培養(yǎng)的分子生物學手段(特別是定量PCR)已經成功用于環(huán)境抗藥性的評估[16-21]，而此類方法的普遍運用由于一些技術原因而受到了限制。這類方法主要基于之前的臨床研究。但是最近的環(huán)境研究表明，環(huán)境中的抗藥性組成及其規(guī)模還遠未完全了解[12, 22, 23]。而其他內在的技術因素，如DNA的提取方法，目標抗性的基因型以及所使用的引物集均會影響最終的結果，因此在沒有統(tǒng)一規(guī)范的前提下，很難實現不同環(huán)境區(qū)劃間的直接比較。

為解決上述環(huán)境抗藥性評估中存在的問題，在本研究中，使用一種基于培養(yǎng)的表型分析方法來評估環(huán)境抗藥性。在2個不同的地理區(qū)域(中國成都和美國夏威夷)，對從不同環(huán)境區(qū)劃(天然水系和市政污水)分離到的大腸桿菌，分別確定其各抗生素的最小抑制濃度(minimum inhibitory concentrations，MIC)。對MIC數據進行系統(tǒng)的統(tǒng)計學分析以評估環(huán)境中的抗藥性，實現環(huán)境抗藥性的跨時空對比。不同環(huán)境區(qū)劃的抗藥性通過MIC分位數、抗性百分比及多抗藥性指數(multiple antibiotic resistance indexes，MARI)進行評價。通過對標準化的MIC數據進行聚類和非度量多維測度(non-metric multidimensional scaling，NMDS)解析兩地環(huán)境細菌的抗藥模式，比較了3個星期分離到的細菌的抗藥性，分析中國內陸河流(錦江)中抗藥性的時間變化情況。對環(huán)境菌株進行廣譜β-內酰胺酶(extended-spectrumβ-lactamases，ESBLs)基因的PCR篩查證明抗性基因與抗性表型之間的聯系。結合實驗數據及兩地現有的抗生素使用狀況信息，分析兩地抗藥性水平與當地人類活動及抗生素實踐之間的聯系。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 樣品采集

分別于2014年3月26日、4月2日和4月9日在沿錦江的5個固定采樣點采集水樣。采樣地點限于東經104°5'18.2''至 104o5'31.6''，北緯30°37'43.9''至 30°38'27.5''范圍內。5個固定采樣點的位置如圖1所示。每個采樣日，從5個采樣點分別收集500 mL水樣。采集的水樣迅速送往實驗室及時處理(3 h內)。在成都市污水處理系統(tǒng)的主干管上收集一個城市污水水樣。夏威夷Manoa河的水樣及采集詳見文獻[24]。沿著Manoa河設置6個采樣點，其中3個位于熱帶叢林中的河流上游，另外3個位于市區(qū)的河流中下游，在設定的采樣點分別采集水樣。夏威夷污水樣品采自當地污水處理廠Honouliuli wastewater treatment plant (WWTP)。

1.2 實驗材料

夏威夷菌株測試所用抗生素卡那霉素A(kanamycin A)、阿米卡星(amikacin)、慶大霉素(gentamicin)、多粘菌素(colistin)、環(huán)丙沙星(ciprofloxacin)購自美國Enzo Life Sciences公司，鏈霉素(Streptomycin)、頭孢氨芐(cefalexin)、頭孢曲松鈉(ceftriaxone)、氨芐青霉素(ampicillin)購自美國TCI公司，四環(huán)素(tetracycline)、萘啶酮酸(nalidixic acid)購自美國Alfa Aesar公司，氯霉素(chloramphenicol)購自美國VWR公司，頭孢西丁(cefoxitin)購自加拿大Toronto Research Chemicals公司。成都菌株所用抗生素除了卡那霉素A(kanamycin A)購自美國Amresco公司，阿米卡星、慶大霉素、鏈霉素、頭孢氨芐、環(huán)丙沙星、萘啶酮酸、青霉素、四環(huán)素、多粘菌素、頭孢曲松鈉均購自中國上海恒遠公司(所有抗生素純度信息具體見附表S1)，蛋白胨大豆瓊脂(TSA)、mTEC(membrane-Thermotolerant E. coli)瓊脂購自北京陸橋技術公司，0.45 μm S-PAK?濾膜來自美國Merck Millipore公司。

1.3 實驗方法

菌體計數及大腸桿菌分離：錦江河水樣品分別進行異養(yǎng)菌平板計數(HPC)和大腸桿菌列舉。HPC中用滅菌蒸餾水10倍系列稀釋后，取適當濃度稀釋液400 μL涂布在蛋白胨大豆瓊脂板上。在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22 h后，記錄平板上的菌落數目，并估算原水品的HPC數值。大腸桿菌計數：取1 mL稀釋水樣(10-1和10-2)通過0.45 μm S-PAK?濾膜(Merck Millipore, Billerica, USA)過濾(微孔)進行過濾。過濾后將截留有細菌的過濾膜轉移至mTEC瓊脂平板上。大腸桿菌的列舉采用EPA標準方法(方法1103)[25]。隨機選取mTEC瓊脂平板上的大腸桿菌在LB培養(yǎng)基上劃線純化。挑選的大腸桿菌的通過IMViC(indole-methyl red-Voges-Proskauer-citrate)實驗進行測試以確定其屬性，大腸桿菌驗證率大于90%，經過驗證的大腸桿菌制成甘油管于-80 ℃下保存并用于隨后的分析。從錦江河水樣中共收集96株大腸桿菌。依相同的方法從成都污水水樣中分離出46株大腸桿菌。在夏威夷大學實驗室中采用類似的方法從環(huán)境樣品中分離了大腸桿菌。從Manoa河的水樣和土樣中共分離到190株大腸桿菌[24]。從當地的污水樣品中分離到94株大腸桿菌。

MICs值測定：運用改良的微量肉湯稀釋法[26]確定環(huán)境大腸桿菌的抗生素MIC值。首先，將分離得到大腸桿菌接種在含有LB肉湯的96孔板中，置于37oC過夜培養(yǎng)至穩(wěn)定生長區(qū)。然后，將細胞培養(yǎng)物接種到含一定濃度范圍抗生素(0.25，0.5，1，2，4，8，16，32，64，和128 μg·mL-1)的LB培養(yǎng)基測試板中。對于2種抑菌效價較高的抗生素，ceftriaxone和 ciprofloxacin，在培養(yǎng)液中的濃度范圍設置為0.0125，0.025，0.05，0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，3.2和6.4 μg·mL-1。接種采用火焰滅菌的48-針復制器以確保每株菌統(tǒng)一的接種量。在37 ℃培養(yǎng)20 h后，MIC終點值記為沒有明顯生長的最低抗生素濃度。每個濃度進行一次重復的測試，計算2個重復的平均值為最終的MIC值。不含抗生素的陽性和陰性對照分別用于檢驗環(huán)境大腸桿菌在實驗室條件下的生長情況和滅菌的徹底性。整個過程的質量控制采用大腸桿菌標準菌株ATCC 25922，結果顯示標準菌株ATCC 25922的抗生素MIC值與文獻報道類似[27]。

環(huán)境大腸桿菌菌株的ESBL基因篩查：β-內酰胺酶是最常見的抗生素抗藥性機制，尤其在革蘭氏陰性菌中。其中，廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)因其多抗藥性和世界范圍內的散播而受到廣泛關注。本研究對環(huán)境菌株的TEM 、SHV和OXA型β-內酰胺酶基因[28]進行了多重PCR的篩查以證明這些菌株經由MIC數據確定的對β-內酰胺類抗生素的抗性。利用夏威夷市政污水環(huán)境DNA提取物作為模板擴增這3個ESBL基因來作為blaTEM、blaSHV和blaOXA PCR檢測的陽性對照，ESBL基因的PCR產物通過測序進行驗證。

1.4 數據分析

將得到的MIC數據評價各環(huán)境區(qū)劃的AR。在確定環(huán)境分離菌株的抗生素MIC值時，大腸桿菌標準菌株ATCC 25922作為敏感控制菌。該標準菌株對本研究中所使用的所有抗生素均敏感[27]。從不同環(huán)境區(qū)劃分離到的各組大腸桿菌的MIC50和MIC90值分別從獲得的MIC數據獲得。以標準菌株MIC值的16倍作為截斷點，判斷各環(huán)境菌株是否抗藥。即當分離菌株MICs值大于該截斷點時，則認為該菌株抗藥。環(huán)境樣品的多抗性通過計算其多抗藥性指數(MARIs)來衡量，采用下列公式計算[29]。

c代表從單個的環(huán)境樣品中分離菌株的數目，ai為菌株i所抗的抗生素數目，b是受測抗生素的數量(成都菌株為11，夏威夷的為13)。在對MIC數據進行統(tǒng)計學分析時，首先將成都和夏威夷環(huán)境大腸桿菌的MICs數據對當地所確定的標準菌株ATCC 25922的MIC值分別進行標準化。然后，標準化的MIC數據乘以100后以2為底進行對數轉換。轉換后的各抗生素或大腸桿菌的MIC數據可以被看作多維向量，分別表示抗生素的抑菌譜或大腸桿菌的抗藥譜。利用MATLAB R2012a (MathWorks, Natick, USA)內置的聚類分析軟件Clustergram將轉換后的數據繪制成聚類熱圖。各抗生素或大腸桿菌分別依據其MIC向量間的線性相關性和Euclidean距離完成聚類。各菌株MIC向量的Euclidean距離被用于NMDS分析，從而比較從不同環(huán)境區(qū)劃和采樣日期獲得的各大腸桿菌的抗藥譜。NMDS采用100次重復的隨機啟動配置樣本點(大腸桿菌菌株)，其準確性通過計算Kruskal應力指數(Kruskal stress)確定[30]。

2 結果(Results)

2.1 HPC和大腸桿菌計數

根據HPC和大腸桿菌計數結果(附表S2)，不同采樣日錦江水體中細菌的數量彼此不同。4月2號水樣中細菌濃度明顯高于其他2個采樣日，尤其是大腸桿菌數目 (P < 0.01)。4月2日當天有中雨，河流的水位顯著增加，這意味著在流域的其他地方有暴雨。地表徑流給錦江河水體帶來更多的細菌。在各采樣日期，沿著河流水中的細菌濃度呈現規(guī)律性的變化，即在采樣點1的細菌豐度(特別是大腸桿菌的豐度)顯著高于其他4個地點(P < 0.05)。在采樣點1的上游有一個擋水壩，形成的落差導致河床底部的污泥懸浮，從而攪起額外的細菌。隨著河水流向下游部分細菌再次沉降，而細菌的濃度又回落到一個相對穩(wěn)定的水平。

2.2 MICs數據

成都和夏威夷實驗室確定的標準菌株的MIC值大致相等。其中MIC值存在偏差的4種抗生素是streptomycin, tetracycline, cefalexin 和 colistin，這可能是由于2個實驗室所使用的這4種抗生素的效價和培養(yǎng)基成分存在差異所造成的。各組大腸桿菌的MIC分位數(MIC50和MIC90)總結在表1中，可以看出成都的環(huán)境抗藥性總體高于夏威夷，僅有一種抗生素(Colistin)例外。

圖2 成都(a)和夏威夷(b)大腸桿菌的抗生素抗性Fig. 2 Antibiotic resistance (AR) among the E. coli strains isolated at Chengdu (a) and Hawai'i (b)

AntibioticsMIC50/MIC90/(μg·mL-1)JinRiverEscherichiacoliisolates(n=96)ChengdusewageEscherichiacoliisolates(n=46)ManoaStreamEscherichiacoliisolates(n=190)HawaiiansewageEscherichiacoliisolates(n=94)KanamycinA32/>12816/>12816/168/16Amikacin16/3216/>1288/168/16Gentamicin8/>1288/>1284/88/8Streptomycin>128/>128>128/>12816/16120/>128Tetracycline128/>128128/>1281/232/128ChloramphenicolND*ND*4/48/8Cefalexin>128/>12864/1288/168/32CefoxitinND*ND*4/84/64Ampicillin>128/>128>128/>1284/84/>128Colistin2/44/81/82/32Nalidixicacid>128/>128>128/>1284/44/8Ceftriaxone>6.4/>6.41.6/>6.40.05/0.10.05/>6.4Ciprofloxacin>6.4/>6.40.8/>6.40.025/0.0250.025/0.05

注： ND表示未檢測出結果。

Note:*ND denotes not determined.

2.3 抗生素抗性分析

錦江大腸桿菌對多數抗生素均表現出高的抗性百分比(超過50%)，除了kanamycin A, amikacin, gentamicin和colistin(圖2a)。有趣的是當地污水大腸桿菌也呈現相似的抗藥性水平，多抗藥性的情況也非常嚴重(圖3和表2)。其中有一株菌對所有11種抗生素均具抗性。錦江的多抗藥性指數(MARI，0.553)甚至稍高于當地污水的MARI值(0.484)。而夏威夷污水中大腸桿菌的抗藥性和多抗藥性均低得多(MARI值為0.169)，但仍然明顯高于Manoa河大腸桿菌的抗藥性(圖2b和圖3)。夏威夷的大腸桿菌對3種氨基糖苷類抗生素：kanamycin A, amikacin和gentamicin不具抗性。從2個地區(qū)分離到的大腸桿菌對tetracycline(TC)均表現出最高的抗藥性。

2.4 環(huán)境AR的時間-空間對比

針對錦江抗藥性的時空特性進行了分析。對單一采樣事件而言，從不同采樣點獲得的大腸桿菌抗藥性水平沒有表現出顯著的差異(表2)。而不同的采樣日獲得的水樣卻表現出不同的抗藥性。其中3月25日的樣品所分離的大腸桿菌顯示出最高的抗性水平，而4月2號的樣品所分離出大腸桿菌抗藥性最低(表2)。同樣的結果也反映在圖4中。

圖3 大腸桿菌多抗藥性Fig. 3 Multiple drug resistance (MDR) among the E. coli isolates

SamplingdateatJinRiverSamplingsitesalongJinRiver*12345ChengdusewageHawaiiansewageManoaStreamMar2520140.7580.6670.6820.7120.606Apr220140.3940.5300.2880.4090.5300.4840.1690.005Apr920140.6100.5970.4540.4940.568

注：在不同的取樣日期中，3月25日錦江河大腸桿菌的多抗藥性指數遠遠高于其他2天(P<0.05)，并且4月2日的錦江河大腸桿菌多抗藥性指數最低(P<0.05)，不同的采樣點的多抗藥性指數無太大差異。

Note:*Among different sampling dates, the Jin River water samples of Mar. 25 showed significantly higher MDR than other two days (P<0.05), while the water samples of Apr. 2 gave the lowest MDR (P<0.05). There is no significant difference in MDR among different sampling sites.

圖4 不同采樣日錦江水樣中大腸桿菌的抗藥(a)及多抗藥性(b)Fig. 4 AR (a) and MDR (b) among E. coli strains isolated from Jin River water samples of different dates

聚類熱圖(圖5)中抗生素(行)和大腸桿菌(列)依據相應的MIC向量完成Euclidean聚類。由于MIC數據進行了歸一化、乘以100及對數轉化等處理，并且設定抗藥截斷點為標準菌株MIC值的16倍。大于log2(1600)=10.64的數據代表抗藥，也就是說圖中暖色塊(不同飽和度的紅色)意味著抗藥，而冷色塊(不同飽和度的藍色)意味著敏感。大腸桿菌依據其抗藥譜的相似性形成聚類，而抗生素依據其抑菌譜的相似性形成聚類。

MIC數據反映大腸桿菌的抗藥譜，而菌體的抗藥譜反映其抗生素接觸史，菌體的抗藥譜曾作為細菌的表型“指紋”對細菌進行溯源[29, 31-34]。MIC數據的NMDS分析可以解析2個地區(qū)不同環(huán)境區(qū)劃大腸桿菌的抗藥譜。大腸桿菌依據其抗藥譜標示為二維空間的散點(圖6)。散點間的距離表示各菌株之間的抗藥譜的差異。對菌體多抗藥性數目進行插值連續(xù)化處理之后生成多抗藥性的等高圖襯在了NMDS圖下?？梢钥闯?，錦江河受到持續(xù)的抗藥性污染，而成都污水菌株(白色方點)的抗藥模式較為多樣，表明其來源的多樣性。夏威夷污水菌(紅色三角)散落在圖中多抗藥性相對較弱的區(qū)域，Manoa河菌(綠色星形)聚集在無多抗藥性的區(qū)域。成都地區(qū)污水及錦江河分離大腸桿菌整體較夏威夷污水中大腸桿菌有更嚴重的多抗藥性。

圖5 錦江(a)及夏威夷污水(b)大腸桿菌MIC數據的聚類熱圖Fig. 5 Clustered heat map generated from antibiotic MIC data of E. coli strains isolated from Jin River water (a) and Hawaiian sewage (b)

2.5 ESBLs結果

對于夏威夷大腸桿菌，我們檢測了頭孢菌素耐藥株中3種常見的ESBL基因(blaTEM、blaSHV和blaOXA)。在污水中分離到15株耐頭孢菌素大腸桿菌，其中只有4株檢測到blaTEM基因。對于成都大腸桿菌，對所有錦江河和污水分離株進行了全面調查，其中66.9%(142株中的95株)的大腸桿菌檢測到TEM基因，SHV 4.2%(n=6)和OXA 2.8%(n=4)。對3種β-內酰胺類抗生素均無抗性的10株大腸桿菌中，其中有9株沒有檢測到任何一種ESBL基因。圖7顯示了檢測到的ESBL基因和β-內酰胺類抗生素(頭孢氨芐、頭孢曲松和氨芐青霉素)MIC值及細菌多抗藥性的正相關性。

3 討論(Discussion)

在本研究中，依據環(huán)境分離大腸桿菌的抗生素最小抑制濃度評估環(huán)境抗生素抗性。引入標準菌株(ATCC 25922)對MIC數據進行標準化，屏蔽了由于培養(yǎng)基成分、不同抗生素供貨商提供的抗生素純度和效價的差異等因素對實驗數據造成的影響。環(huán)境分離株和標準均屬于同個菌種，設置抗性截斷點為16倍于敏感標準菌株(ATCC 25922)的MIC值，而環(huán)境菌株在明顯較高的抗生素濃度下仍然能夠生長，環(huán)境菌株必然存在某種抗藥性機制使其能夠在如此高的抗生素濃度下生存。這樣的設定賦予了環(huán)境樣品的抗生素抗性統(tǒng)計學意義。在報道該方法確定的環(huán)境抗生素抗性時，明確指出了MIC截斷點，而標準菌株可從菌種庫獲得，其性質的表征也已為人熟知，任何人均可重復上述實驗并獲得類似的結果。除此之外，該方法另外一個好處是得到的結果比較全面，實現環(huán)境抗藥性的跨時空對比。從空間角度看，環(huán)境大腸桿菌抗生素MIC數據的多極化分布直觀地反映出抗性污染的存在以及抗性污染的程度。典型的，從夏威夷污水中分離到的大腸桿菌組，僅有3種抗生素(kanamycin A, amikacin和gentamicin)的MIC值沒有表現出多極分布(附錄Table S6)。而它們正是污水大腸桿菌不具抗性的3種抗生素(圖2b)。而對于Manoa河中分離到的大腸桿菌組，因其很可能沒有受到抗生素抗性污染，幾乎所有抗生素的MIC均無多極分布，而其中3個例外的抗生素(tetracycline, ampicillin和colistin)呈現出幾乎可以忽略的多極化分布(附錄Table S5)。對于從錦江和成都污水中分離的的大腸桿菌組，幾乎所有的抗生素都表現出多極的MIC分布。其中amikacin對錦江大腸桿菌的MIC數據，cefalexin和colistin對成都污水大腸桿菌的MIC數據例外，而這正是那些相應大腸桿菌組對抗生素不具抗性的情況(附錄Table S3，S4)。由此，通過該方法，可以實現抗生素抗性的跨地域對比。從時間角度看，錦江菌體抗藥性是隨時間變化的(圖4)。4月2日有中雨。盡管地表徑流給河道帶來了更多的細菌，但這些細菌包含來源于非抗性污染地區(qū)的抗藥性較弱的菌株。因此，降雨可以看作河道抗性菌的稀釋事件。根據NMDS分析(圖6)，錦江河道受到持續(xù)的抗藥性污染，而且此污染呈現出如下具體的特征：單一來源(NMDS顯示出單一的多抗藥性模式，即圖中紅圈圈住的點)及其嚴重的多抗藥性(平均抗藥數目在7左右)。4月2日(黑色菱形)大腸桿菌的抗藥模式分布更為分散，表明雨水的確為水體帶來了不同來源的大腸桿菌。4月9日(紫色圓點)的菌株中亦包含抗性模式不同的菌株，應該是降雨持續(xù)影響的結果。而成都污水菌株(白色方點)的抗藥模式較為多樣，表明其來源的多樣性。夏威夷污水菌(紅色三角)散落在圖中多抗藥性相對較弱的區(qū)域，Manoa河菌(綠色星形)聚集在無多抗藥性的區(qū)域。總之，成都地區(qū)污水及錦江河分離大腸桿菌整體較夏威夷污水中大腸桿菌有更嚴重的多抗藥性。環(huán)境抗生素抗性的跨區(qū)域的比較和動態(tài)追蹤均得以實現。但該方法的缺點是涉及的樣品較多，實驗中工作量較大，且只適用與能分離到大腸桿菌的情況。

圖6 大腸桿菌抗藥譜的NMDS分析Fig. 6 NMDS analysis of AR patterns of the E. coli isolatesNote: MDR, Contour map of multi-drug resistance; the numbers on the contour lines are the numbers of antibiotics that one strain is resistant to; the Kruskal stress is 0.0988.

圖7 ESBL基因與β-內酰胺類抗生素MICs(a)及多抗藥性(b)之間的關系Fig. 7 The correlation of ESBL genes with MICs of β-lactam antibiotics (a) and MDR (b)

地理上相隔甚遠的2個地區(qū)，其天然水體的細菌抗藥性存在巨大的差異，這反映了兩地人類活動對水體所施加影響的差異。中國不僅是全球最大的抗生素生產國也是最大的消費國[35]。之前的研究表明，抗生素及細菌抗藥性在中國的不同環(huán)境區(qū)劃均有例行檢出[21, 36-44]。而這些研究主要集中在東南沿海地區(qū)。中國的地理地形決定了其主要河流發(fā)源于西部的大山而流向東部海岸。因此，要全面了解整個國家環(huán)境抗藥性的形勢并追尋其形成和發(fā)展的內在機制，監(jiān)控中國中西部內陸水系中的抗藥性具有重要意義。作為一條內陸水道，錦江河是2條河流(府河，其上游被稱為柏條河，與南河，其上游被稱為清水河)的匯流，這2條河都流經成都市區(qū)。它們都是岷江(長江上游主要支流之一)的分支，都由都江堰引流而至，都江堰是我國古代最著名的水利灌溉工程之一，至今仍在使用。在流入成都市區(qū)之前，它們都流經開闊的農業(yè)灌溉區(qū)。水樣的采集點則正好位于2條河流匯流點的下游位置(圖1)。在我國，對畜牧業(yè)與水產養(yǎng)殖業(yè)的抗生素使用沒有嚴格禁止。數十種抗生素作為飼料添加劑使用。在全球用于食用動物生產的抗生素消費中，中國占據最大的份額(2010年占23%)[45]。畜牧業(yè)以及水產養(yǎng)殖業(yè)的開放性排放可能對水體帶來嚴重的抗藥性污染。流經成都后，錦江重新匯入岷江。由于聯合下水排污系統(tǒng)在城市的部分地區(qū)仍在使用，錦江水體兼具農業(yè)與城市的雙重影響。而夏威夷的Manoa河發(fā)源于Koolau山脈的熱帶雨林，流經Manoa山谷居民區(qū)，最后經由Ala Wai Canal注入大海。夏威夷擁有自19世紀末便開始構建的完備的污水收集、處理和排放系統(tǒng)。因此Manoa河水很少受到人類活動的影響，而沒有觀察到明顯的抗生素抗性。

兩地市政污水中的抗生素抗性也存在差異。由于Honouliuli污水處理廠的污水收集區(qū)域中不存在畜牧業(yè)，市政污水中的抗生素抗性在一定程度上反映了當地抗生素的臨床使用狀況。2010年抗生素的銷售數據顯示，美國當年各抗生素的銷售量為頭孢菌素類抗生素502 561 kg，喹諾酮類281 557 kg，四環(huán)素類129 183 kg，氨芐青霉素42 643 kg及氨基糖苷類6 991 kg[46]。污水中對各抗生素的抗藥性(圖3-2b)與各抗生素的銷售量(使用量)之間似乎是正相關的。最明顯的結果是，3種氨基糖苷類抗生素(kanamycin A, amikacin和gentamicin)沒有觀察到抗性菌株可能源于這3種抗生素較低的使用量(銷售量)。2010年間，中國是繼印度之后的第二大臨床抗生素消費國[47]。這正是為什么在一個如此人口稠密的中國內陸城市(成都)的市政污水中檢測到嚴重細菌抗藥性的原因。對抗生素臨床使用的監(jiān)管不力也加劇了這一形勢。盡管中國政府近年來正逐步規(guī)范抗生素的臨床使用，但仍缺乏嚴格的行政和法律約束。在中國，沒有醫(yī)生處方的情況下一些常規(guī)抗生素仍能從普通藥店買到。通過比較兩地細菌的抗生素抗藥性，在成都具有更高的抗藥性感染風險。要扭轉這一形勢，當地的首要任務是進一步規(guī)范各類抗生素的使用并強化污水的收集及集中處理。而在夏威夷，盡管完備的污水收集和處理系統(tǒng)有效控制了自然環(huán)境中的抗生素抗性并降低了抗性菌感染的風險，保險起見，對污水處理系統(tǒng)出水中的細菌抗藥性的檢測仍然是必要的，這可能涉及到現有污水處理手段的改進。對于已經存在嚴重抗藥性的抗生素的使用，如在成都tetracycline，streptomycin，ceftriaxone，ampicillin，ciprofloxacin和nalidixic acid的使用，在夏威夷streptomycin和tetracycline的使用都需特別謹慎，對這些抗生素的使用必須嚴格限制。

不同抗生素的抑菌效價不同，而且菌體對各抗生素的抗藥性也各有差異，這使得不同抗生素對同組大腸桿菌的MIC數據經過標準化后呈現數量級上的差異。因此，標準化后的數據隨后進行了對數轉化，不同抗生素MIC向量間的線性相關性作為其聚類分析的依據，該聚類分析可顯示不同抗生素在抑菌譜上的相似性。根據聚類分析的結果(圖5)，不同抗生素的聚類機制至少有2種。其一，不同的抗生素屬于同一種類，其抗藥機制類似，即抗性決定子相同亦或處在接近的遺傳位點上。其二，同組環(huán)境大腸桿菌的抗生素接觸史決定了不同抗生素間的聚類。如果幾種抗生素并存于同組菌體的抗生素接觸史中，那么細菌在多種抗生素選擇性壓力下將表現出對這些抗生素的多抗藥性，而這些抗生素在聚類分析時便會聚類在一起。在我們的研究中，2種情形似乎都遇到了。對于2個地理區(qū)域采集到的大腸桿菌，3種頭孢菌素cefoxtin (對于成都的分離菌株未檢測)、cefalexin和ceftriaxone，2種氨基糖苷類抗生素kanamycin A和amikacin，以及2種喹諾酮ciprofloxacin和nalidixic acid，均分別緊密聚類在一起。另一方面，不同種類抗生素間的聚類可能源于這些抗生素曾協同出現在兩地細菌的抗生素接觸史中。如對于錦江河的分離株(圖5a)，ampicillin與喹諾酮類的抗生素聚類在一起，而對于夏威夷污水的分離株(圖5b)，colistin與頭孢菌素類抗生素聚類在一起。

colistin，也被稱作多粘菌素E (polymyxin E)，是一種環(huán)狀多肽的混合物，亦是作為治療多抗藥性細菌感染的“最后手段”之一。之前的研究表明，帶有NMD-1型金屬β-內酰胺酶的多抗藥性腸桿菌科對于colistin仍然敏感[48]。colistin曾經因為其腎和神經毒性而被中斷使用。但最近它又被用于與其他一種或多種抗生素連用以治療抗藥性感染[49-51]。成都分離株的colistin抗性很少見，這一點是意料之外的。在中國，多粘菌素是使用最為廣泛的獸用抗生素之一，通常作為畜牧業(yè)飼料添加劑使用。最近在中國已經發(fā)現了人和動物體內質粒介導的colistin抗性[52]。colistin作為一種多肽混合物，有報道指出其在消化道中被快速降解[53, 54]。這可能正是為什么在如此大的一個豬生產省份(四川)的環(huán)境中觀察到低于預期的colistin抗藥性的原因。此外，根據IMS Health MIDAS數據庫(https://resistancemapcddep.org/AntibioticUse.php)發(fā)布的數據，在中國自2007年起，多粘菌素就已經很少作為臨床抗生素使用，而在美國其臨床使用仍在繼續(xù)，并且每1 000個居民，其平均使用量為7個標準單位(standard unit per 1000 inhabitants)。成都污水分離株對這種抗生素均無抗性(圖2a)，而夏威夷污水分離株卻表現出較高的抗性(抗性百分比為26%，圖2b)，并且在進行聚類分析時，colistin與頭孢類抗生素聚類在一起(圖5b)。兩地具有高MIC值(≥128 μg·mL-1)的colistin大腸桿菌(成都1株，夏威夷3株)均表現出嚴重的多抗藥性。成都抗藥株的抗藥數目高達11，而夏威夷抗藥株的抗藥數目均超過6?？紤]到最近發(fā)現的質粒介導的colistin抗性，這些研究事實嚴重挑戰(zhàn)了colistin與其他抗生素的臨床聯合使用。

ESBLs基因的篩查證明：環(huán)境大腸桿菌的抗生素抗性與其抗性決定子(抗性基因)之間存在正相關。然而這種正相關性低于我們的預期，表明基因型與表型間的偏差。表型和基因手段已聯合使用于環(huán)境抗生素抗性的評估，其結果可彼此互補。而本研究的重點是表型分析手段，旨在實驗環(huán)境抗生素抗性的時空追蹤。而適用于環(huán)境研究的基因手段將是我們接下來的工作重點之一。

致謝：感謝國家自然科學基金(21677104)對本研究的支持。

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