于朋飛, 劉暉, 牟之健, 陸治學(xué), 黎華壽, 張定煌, 賀鴻志,*

1. 農(nóng)業(yè)部華南熱帶農(nóng)業(yè)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，廣州 510642 2. 中山市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究所，中山 528401

當(dāng)前，納米材料已進(jìn)入大規(guī)模開發(fā)和應(yīng)用階段，部分納米材料正被釋放到環(huán)境中。人們普遍擔(dān)心納米材料的特殊理化性質(zhì)，會(huì)使其容易被生物體吸收并和生物體的各級(jí)結(jié)構(gòu)相互作用，影響生物的生長(zhǎng)和健康[1]。因此，研究納米材料對(duì)水生態(tài)環(huán)境健康和安全的影響具有重要意義。但當(dāng)前國(guó)內(nèi)、外對(duì)其釋放風(fēng)險(xiǎn)研究相對(duì)滯后。納米銀(AgNPs)是一種金屬納米材料，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、電子、紡織、衛(wèi)生等領(lǐng)域，AgNPs的生態(tài)毒理學(xué)研究是當(dāng)前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，已被證實(shí)是現(xiàn)有的金屬納米材料中對(duì)水生生物毒性最強(qiáng)的，但對(duì)其毒性效應(yīng)機(jī)制的解釋尚存在爭(zhēng)議[2]。

藻類是水生和濕地生態(tài)系統(tǒng)的重要生物組分，作為第一生產(chǎn)者，可以為全球提供大約40%的初級(jí)生產(chǎn)力，其種類的多樣性和初級(jí)生產(chǎn)量直接影響水生生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能[3-4]。同時(shí)，藻類對(duì)毒物敏感、個(gè)體小、繁殖快，在較短時(shí)間內(nèi)可評(píng)估化學(xué)物質(zhì)對(duì)其多個(gè)世代和種群水平的影響，是生態(tài)毒理學(xué)研究中常用的測(cè)試生物。國(guó)內(nèi)、外關(guān)于AgNPs對(duì)普通小球藻和銅綠微囊藻的毒性效應(yīng)已有一些研究報(bào)道，但都各有側(cè)重，如單風(fēng)娟等[5]和郝從芳等[6]研究了其對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)、葉綠素合成和細(xì)胞表面形態(tài)的影響，Oukarroum等[7]開展了對(duì)普通小球藻細(xì)胞活力、活性氧自由基形成和脂質(zhì)過氧化等方面的研究。苑志華等[8]研究了其對(duì)普通小球藻光合作用和呼吸作用的影響。Qian等[9]則從蛋白組和生理方面對(duì)其藻毒性進(jìn)行了研究。而關(guān)于AgNPs對(duì)藻類毒性究竟是由其自身的作用還是由AgNPs顆粒在培養(yǎng)液中釋放銀離子(Ag+)所導(dǎo)致，仍然存在爭(zhēng)議。而很多研究中沒有將AgNPs的毒性效應(yīng)與Ag+對(duì)藻的效應(yīng)進(jìn)行對(duì)比。本論文主要采用電鏡技術(shù)(掃描電鏡SEM和透射電鏡TEM)和葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)研究AgNPs和Ag+對(duì)藻細(xì)胞形態(tài)和光合系統(tǒng)II的影響，以進(jìn)一步探討AgNPs對(duì)微藻毒性效應(yīng)的可能機(jī)制。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用藻種為普通小球藻(Chlorella vulgaris)(FACHB-1227)和銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)(FACHB-1322)，均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫(kù)。實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基為BG11培養(yǎng)基。所有化學(xué)試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 AgNPs的制備和表征

AgNPs合成方法參考Munro等[10]的方法，稍加改進(jìn)：取0.017 g硝酸銀溶于100 mL超純水中，調(diào)節(jié)pH值為6.5，制得1 mmol·L-1硝酸銀溶液。在磁力攪拌器上加熱攪拌硝酸銀溶液至沸騰，然后加入1%(w/V)檸檬酸三鈉二水化合物溶液2 mL，持續(xù)攪拌煮沸1 h，最終形成銀灰色膠體。用經(jīng)過預(yù)處理的透析袋(截留分子量17 kD)在超純水中透析72 h以除去多余的Ag+和檸檬酸三鈉等小分子殘留物。分別在0.5、1、2、3、5、7、12、24、36、48、60、72 h更換新鮮的超純水進(jìn)行透析，以除去多余的Ag+和檸檬酸三鈉等小分子物質(zhì)。在原子吸收光譜儀上進(jìn)行測(cè)定以確認(rèn)最終Ag+濃度低于儀器檢測(cè)限。最后，在超凈工作臺(tái)上用無菌的0.45 μm微孔濾膜過濾頭和針筒過濾，最終獲得均勻穩(wěn)定的無菌AgNPs，置于預(yù)先滅菌的試劑瓶中封口，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

AgNPs表征：取無菌的蒸餾水和BG11培養(yǎng)液，加入AgNPs溶膠使?jié)舛冗_(dá)0.6 mg·L-1，用納米粒度和Zeta電位分析儀(Nano ZS，英國(guó)馬爾文公司)測(cè)定AgNPs的水合粒徑和Zeta電位。

1.2.2 AgNPs和Ag+對(duì)2種藻的急性毒性測(cè)試

通過預(yù)實(shí)驗(yàn)求出AgNPs和Ag+對(duì)2種藻的100%抑制濃度(絕對(duì)抑制濃度EC100)和無抑制濃度(最大耐受濃度EC0)。對(duì)于96 h-EC50的測(cè)定，在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，設(shè)置AgNPs處理濃度為：普通小球藻0、0.59、0.89、1.33、2、3 mg·L-1，銅綠微囊藻0、0.6、0.75、1、1.2、1.6 mg·L-1。設(shè)置Ag+濃度為：普通小球藻0、0.05、0.07、0.09、0.13、0.18 mg·L-1，銅綠微囊藻0、0.01、0.016、0.025、0.04、0.06 mg·L-1。AgNPs和Ag+濃度均以Ag計(jì)。實(shí)驗(yàn)在50 mL玻璃三角瓶中進(jìn)行，三角瓶中加入20 mL無氮BG11培養(yǎng)基，封口后經(jīng)高壓蒸汽滅菌鍋121 ℃滅菌15 min備用。以培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的藻種進(jìn)行接種，調(diào)整各實(shí)驗(yàn)三角瓶中的藻液濃度到最終OD680值為0.1，測(cè)定此接種藻液的葉綠素a(Chla)含量。培養(yǎng)溫度(25±1) ℃，光照(2 500 ± 50) lx，光暗比16 h：8 h，每天定時(shí)搖瓶4～6次。96 h后測(cè)定Chla含量，采用幾率單位法計(jì)算AgNPs和Ag+對(duì)2種藻的半效應(yīng)濃度(96 h-EC50)[11]。

Chla取樣測(cè)定方式如下：取適量藻液用0.45 μm微孔濾膜抽濾，然后將帶藻的濾膜放入10 mL離心管中，加80%丙酮7 mL，充分搖勻后，置于冰箱4 ℃避光靜置提取24 h。在離心機(jī)上4 ℃、6 000 r·min-1離心10 min，取上清液在可見分光光度計(jì)上663 nm處讀取吸光值OD663。根據(jù)公式Ca= 12.21×OD663求出Chla含量。

1.2.3 葉綠素a含量測(cè)定、葉綠素?zé)晒鉁y(cè)定和藻細(xì)胞形態(tài)觀察實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)在250 mL玻璃三角瓶中進(jìn)行，三角瓶中加入100 mL的BG11培養(yǎng)基，封口后經(jīng)高壓蒸汽滅菌鍋121 ℃滅菌15 min。設(shè)置AgNPs處理濃度為：普通小球藻0、0.9、2 mg·L-1，銅綠微囊藻0、0.6、1 mg·L-1。設(shè)置Ag+濃度為：普通小球藻0、0.09、0.13 mg·L-1，銅綠微囊藻0、0.025、0.04 mg·L-1。處理4 d后進(jìn)行測(cè)定。葉綠素a含量測(cè)定方法同1.2.2。

瞬時(shí)葉綠素?zé)晒鉁y(cè)定方法：取處理4 d后的藻液，用光分光光度計(jì)調(diào)整其吸光值OD680=0.3，黑暗處理30 min后，用手持式葉綠素?zé)晒鈨xAquaPen-P 100(捷克)測(cè)定瞬時(shí)葉綠素?zé)晒狻Ｊ覝貤l件下測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)的快速熒光，歸一化后以瞬時(shí)可變熒光對(duì)時(shí)間對(duì)數(shù)作圖即得快速熒光動(dòng)力學(xué)曲線。同時(shí)，計(jì)算獲得ΦP0、VJ、ΦE0、Ψ0、ABS/RC、TR0/RC、ET0/RC、DI0/RC和PI_Abs等參數(shù)值[12]。

1.2.4 藻細(xì)胞形態(tài)觀察

將上述AgNPs和Ag+處理4 d的藻液，在4 ℃、6 000 r·min-1離心10 min，棄去上清液，收集藻細(xì)胞于2 mL離心管中備用。將藻細(xì)胞經(jīng)過前固定、漂洗、后固定、漂洗、脫水、干燥、粘樣、臨界點(diǎn)干燥和離子濺射噴金鍍膜處理后用掃描電鏡SEM(XL30 ESEM，荷蘭FEI)觀察。將藻細(xì)胞經(jīng)過前固定、漂洗、后固定、漂洗、脫水、過度、滲透、包埋、超薄切片等前處理后，用透射電鏡TEM(Tecnai 12，荷蘭FEI)觀察。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用Excel 2013和SPSS 20.0分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、分析和統(tǒng)計(jì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用 Excel 軟件進(jìn)行處理，利用SPSS 20的單因素方差分析(One-way ANOVA)對(duì)每個(gè)測(cè)定項(xiàng)目統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行顯著性方差分析。圖表中的不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。

2 結(jié)果(Results)

2.1 AgNPs的表征

由檸檬酸鈉還原法制得的AgNPs呈灰褐色(圖1-a)。透射電鏡觀察呈球形，粒徑(44.7±8.3) nm，分散較均勻，狀態(tài)穩(wěn)定，可以在冰箱4 ℃保存1個(gè)月以上(圖1-b)。而在蒸餾水中的平均水合粒徑為(59.7±1.1) nm(圖1-b)，zeta電位為(-13.7±0.51) mv。

2.2 毒性測(cè)試結(jié)果

AgNPs和Ag+對(duì)普通小球藻和銅綠微囊藻的毒性測(cè)試結(jié)果見表1。從表1可知，AgNPs對(duì)普通小球藻的96 h-EC50值(1.113 mg·L-1)為Ag+的10倍左右，而其對(duì)銅綠微囊藻的96 h-EC50值(0.697 mg·L-1)超過Ag+的20倍，說明AgNPs對(duì)2種微藻的毒性遠(yuǎn)低于Ag+。同時(shí)，AgNPs和Ag+對(duì)普通小球藻的96 h-EC50值均分別高于對(duì)銅綠微囊藻的，說明2種物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻的毒性比普通小球藻強(qiáng)。

2.3 葉綠素a(Chla)含量

從圖2可知，普通小球藻和銅綠微囊藻的Chla含量均隨AgNPs和Ag+濃度增加而逐漸降低，2 mg·L-1AgNPs處理時(shí)普通小球藻Chla含量為1.019 mg·L-1，僅為CK的33.4%。而1 mg·L-1AgNPs處理時(shí)銅綠微囊藻Chla含量為0.521 mg·L-1，僅約為CK的17.4%。與AgNPs比較Ag+在低濃度就顯示高毒性，0.13 mg·L-1Ag+處理時(shí)普通小球藻Chla含量為1.096 mg·L-1，約為CK的36.0%。而0.04 mg·L-1Ag+處理時(shí)銅綠微囊藻Chla含量為0.874 mg·L-1，僅約為CK的29.3%。這說明AgNPs對(duì)2種微藻Chla含量的影響低于Ag+。

圖1 透射電鏡下觀察到AgNPs顆粒(a)和AgNPs的水合粒徑分布圖(b)Fig. 1 TEM image of AgNPs (a) and its particle size distribution in pure water (b)

圖2 不同濃度AgNPs和Ag+對(duì)普通小球藻(A)和銅綠微囊藻(B)葉綠素a含量的影響注：不同小寫字母表示不同處理之間差異顯著(P<0.05)。Fig. 2 Effects of AgNPs and Ag+ on the Chla contents of Chlorella vulgaris (A) and Microcystis aeruginosa (B)Note: Different lower-case letters indicate significant differences between treatments (P<0.05).

處理Treatment擬合方程FittingequationR296h-EC50/(mg·L-1)96h-EC0/(mg·L-1)96h-EC100/(mg·L-1)ChlorellavulgarisAgNPsY=4.892+1.005×lnC0.9501.1130.2506.000Ag+Y=7.060+0.918×lnC0.9790.1060.0100.500MicrocystisaeruginosaAgNPsY=5.766+2.122×lnC0.9860.6970.1204.000Ag+Y=9.684+1.357×lnC0.9980.0320.0040.300

2.4 電鏡觀察

AgNPs處理前后2種藻的掃描電鏡結(jié)果見圖3，正常的小球藻和微囊藻細(xì)胞表面飽滿，勻稱，光滑。小球藻在經(jīng)過2 mg·L-1AgNPs處理后細(xì)胞聚集狀態(tài)發(fā)生改變，藻細(xì)胞表面出現(xiàn)明顯的褶皺和變形，部分細(xì)胞遭到嚴(yán)重破壞向內(nèi)塌陷(圖3f)，甚至發(fā)生裂解。而微囊藻經(jīng)1 mg·L-1AgNPs處理后，明顯看到AgNPs在細(xì)胞表面的粘附(圖3j)，部分細(xì)胞出現(xiàn)變形，但沒有出現(xiàn)像小球藻那樣的皺褶。同時(shí)，可觀察到一些形狀不規(guī)則的物質(zhì)使細(xì)胞粘連在一起，推測(cè)是藻細(xì)胞的胞外分泌物或細(xì)胞破裂釋放的細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)。

透射電鏡觀察結(jié)果顯示：對(duì)照組(圖4a～b)普通小球藻細(xì)胞膜和細(xì)胞壁緊密連接，細(xì)胞呈飽滿狀態(tài)。蛋白核明顯，被一層近橢圓形的淀粉鞘所保護(hù)，且可明顯看到蛋白核有幾條與葉綠體類囊體區(qū)的通道。0.13 mg·L-1Ag+處理后的普通小球藻細(xì)胞見圖4c～d，部分細(xì)胞發(fā)生了質(zhì)壁分離現(xiàn)象，原生質(zhì)體呈現(xiàn)收縮狀態(tài)，部分細(xì)胞已經(jīng)轉(zhuǎn)變?yōu)殒咦?圖4～d)。經(jīng)2 mg·L-1AgNPs處理后的普通小球藻細(xì)胞見圖4e～f，蛋白核增大，且觀察不到與類囊體區(qū)有明顯的連接通道。部分細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞，胞內(nèi)物出現(xiàn)混亂，已經(jīng)觀察不到明顯的蛋白核結(jié)構(gòu)(圖4e～f)。

圖3 AgNPs處理前后2種藻的SEM圖注：a～c，普通小球藻CK；d～f，2 mg·L-1AgNPs處理普通小球藻；g～i，銅綠微囊藻CK；j～l，1 mg·L-1 AgNPs處理銅綠微囊藻。Fig. 3 SEM images of algaeNote: a-c, Chlorella vulgaris CK; d-f, C. vulgaris with 2 mg·L-1 AgNPs; g-I, Microcystis aeruginosa CK; j-l, M. aeruginosa with 1 mg·L-1 AgNPs.

圖4 AgNPs或Ag+處理普通小球藻細(xì)胞的TEM圖注：a～b，CK；c～d，0.13 mg·L-1 Ag+處理；e～f，2 mg·L-1 AgNPs處理。Fig. 4 TEM images of Chlorella vulgaris cells treated with AgNPs or Ag+Note: a-b, CK; c-d, 0.13 mg·L-1 Ag+; e-f, 2 mg·L-1 AgNPs.

圖5 AgNPs或Ag+處理銅綠微囊藻細(xì)胞的TEM圖注：a-b，CK；c～d，0.04 mg·L-1 Ag+處理；e～f，1 mg·L-1 AgNPs處理。Fig. 5 TEM images of Microcystis aeruginosa cells treated with AgNPs or Ag+Note: a-b, CK; c-d, 0.04 mg·L-1 Ag+; e-f, 1 mg·L-1 AgNPs.

對(duì)于銅綠微囊藻，正常藻細(xì)胞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁緊密連接，細(xì)胞呈飽滿狀態(tài)。類囊體片層結(jié)構(gòu)清晰，垛疊整齊連續(xù)(圖5a～b)。0.04 mg·L-1Ag+處理后的銅綠微囊藻細(xì)胞見圖5c～d，細(xì)胞出現(xiàn)質(zhì)壁分離。擬核區(qū)出現(xiàn)離散，類囊體排列混亂，結(jié)構(gòu)模糊。同時(shí)，部分細(xì)胞破壞嚴(yán)重，內(nèi)部亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)變得難以區(qū)分，色素體幾乎完全降解，細(xì)胞周邊出現(xiàn)很多細(xì)胞破壞殘余物。經(jīng)1 mg·L-1AgNPs處理后的銅綠微囊藻細(xì)胞見圖5e～f，多數(shù)細(xì)胞內(nèi)部總體結(jié)構(gòu)尚能維持，但擬核區(qū)有膨大趨勢(shì)，類囊體和色素體被推向四周，部分區(qū)域類囊體結(jié)構(gòu)變得混亂(圖5e)，另外一些細(xì)胞中斷裂明顯(圖5f)。同時(shí)，在部分細(xì)胞邊緣出現(xiàn)分布規(guī)則的顆粒物(圖5d)，結(jié)合SEM的結(jié)果判斷應(yīng)該是出現(xiàn)了胞外物質(zhì)吸附了部分AgNPs顆粒。

2.5 快速葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)和葉綠素?zé)晒鈪?shù)

不同濃度AgNPs和Ag+對(duì)2種藻快速葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)曲線(OJIP)的影響如圖6所示，相對(duì)于CK，0.09 mg·L-1Ag+處理的普通小球藻OJIP曲線高于CK，但0.13 mg·L-1Ag+處理的OJIP曲線低于CK。對(duì)于AgNPs處理，隨濃度升高，曲線依次降低，到2 mg·L-1處理時(shí)OJIP曲線已經(jīng)變得很平(圖6A)。而在幾乎相同的以葉綠素a含量計(jì)的抑制率條件下，Ag+(0.13 mg·L-1)對(duì)普通小球藻OJIP的影響小很多。

這說明AgNPs和Ag+處理對(duì)普通小球藻葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)的影響存在明顯差異。而對(duì)于銅綠微囊藻，AgNPs處理效果跟普通小球藻一樣，隨濃度升高，OJIP曲線逐漸降低。但0.04 mg·L-1Ag+處理與1 mg·L-1AgNPs處理的OJIP曲線幾乎重合(圖6B)。

AgNPs和Ag+對(duì)普通小球藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響見表2。相對(duì)于CK，0.9 mg·L-1AgNPs處理后，除VJ顯著降低以外，普通小球藻其他葉綠素?zé)晒鈪?shù)均無顯著變化，而2 mg·L-1AgNPs處理后，ΦP0顯著降低，而ΦD0、ABS/RC和DI0/RC顯著升高。0.09 mg·L-1Ag+處理后，相對(duì)于CK，Ψ0、ΦP0、ΦE0和PI_Abs均顯著升高，而ΦD0、VJ和DI0/RC顯著降低。

圖6 AgNPs和Ag+對(duì)普通小球藻(A)和銅綠微囊藻(B)OJIP曲線的影響Fig. 6 Effects of AgNPs and Ag+ on the OJIP curves of Chlorella vulgaris (A) and Microcystis aeruginosa (B)

ΦP0Ψ0ΦD0ΦE0VJABS/RCTR0/RCDI0/RCET0/RCPI_AbsCK0.463b0.334b0.537b0.155b0.666a1.623b0.751a0.872b0.251a0.267c0.9mg·L-1AgNPs0.463b0.421b0.537b0.194b0.579bc1.394b0.646a0.748b0.27a0.457c2mg·L-1AgNPs0.405c0.373b0.595a0.151b0.627ab1.91a0.773a1.136a0.29a0.215c0.09mg·L-1Ag+0.612a0.511a0.407c0.313a0.514c1.24b0.736a0.504c0.39a1.227a0.13mg·L-1Ag+0.412c0.408b0.566a0.176b0.634a1.853a0.835a1.018a0.33a0.634b

注：不同小寫字母表示不同處理之間差異顯著(P<0.05)，下同。

Note：Different lower-case letters indicate significant differences between treatments (P<0.05), the same below.

但0.13 mg·L-1Ag+處理相對(duì)于CK，ΦD0、ABS/RC、DI0/RC和PI_Abs均顯著升高，僅ΦP0顯著降低，而若與2 mg·L-1AgNPs處理比較，僅PI_Abs存在顯著差異。光系統(tǒng)Ⅱ的最大光化學(xué)量子產(chǎn)率ΦP0是反映藻類受脅迫大小的重要參數(shù)，低濃度的AgNPs和Ag+均未對(duì)普通小球藻ΦP0造成抑制，甚至0.09 mg·L-1Ag+處理都顯著促進(jìn)，但2種毒物在高濃度均顯示顯著抑制。另一個(gè)參數(shù)是PI_Abs，代表光系統(tǒng)II性能，AgNPs在實(shí)驗(yàn)最高濃度都未對(duì)該參數(shù)造成影響，而2種Ag+處理均使得該參數(shù)顯著升高。同時(shí)，由于ABS/RC為TR0/RC與DI0/RC之和，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看光吸收能通量ABS/RC和耗散能通量DI0/RC受到高濃度的毒物(2 mg·L-1AgNPs和0.13 mg·L-1Ag+)影響顯著升高，卻均未對(duì)普通小球藻的捕獲能通量TR0/RC造成影響，說明普通小球藻在高濃度2種毒物脅迫下，通過提高光吸收能通量補(bǔ)償耗散能量以滿足自身對(duì)光能的需要。

AgNPs和Ag+對(duì)銅綠微囊藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響見表3。0.6 mg·L-1AgNPs和0.025 mg·L-1Ag+處理相對(duì)于CK，均表現(xiàn)為僅ΦP0顯著降低和ΦD0顯著升高。而1 mg·L-1AgNPs和0.04 mg·L-1Ag+處理相對(duì)于CK均表現(xiàn)為：ΦP0、ΦE0和PI_Abs顯著降低，而ΦD0、ABS/RC和DI0/RC顯著升高。相對(duì)于CK，所有濃度的2種毒物均顯著降低銅綠微囊藻細(xì)胞光系統(tǒng)的最大光化學(xué)量子產(chǎn)率ΦP0。而光系統(tǒng)II性能參數(shù)PI_Abs僅在2種毒物的最高濃度顯著降低。而在能量通量方面，與普通小球藻實(shí)驗(yàn)結(jié)果規(guī)律完全一致，即在高濃度的2種毒物脅迫下，通過提高光吸收能通量補(bǔ)償耗散能量以滿足自身對(duì)光能的需要。同時(shí)，比較表2和表3中所有的參數(shù)，其中以PSII原初光能轉(zhuǎn)化效率ΦP0(Fv/Fm)最為敏感，在低濃度的2種毒物影響下2種藻的ΦP0即有顯著的改變。

3 討論(Discussion)

AgNPs的制備有很多方法，實(shí)驗(yàn)室常用是通過還原硝酸銀制備，可用還原劑包括鹽酸羥胺、硼氫化鈉、卡拉膠、丹寧酸和檸檬酸鈉等[8, 10, 13-14]。研究表明檸檬酸鈉包裹可以減少AgNPs的Ag+釋放[15]，所以是比較合適的還原和包裹劑。由于Ag+、還原劑和包裹劑等對(duì)藻影響很大，因此，對(duì)于毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)來說，制備過程中除去Ag+和其他毒性強(qiáng)的輔劑是非常關(guān)鍵的。在本實(shí)驗(yàn)中，制備AgNPs后在蒸餾水中進(jìn)行了充分的透析除去了多余的Ag+等小分子，可以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

色素是微藻進(jìn)行光合作用的主要細(xì)胞組分，其破壞或降解都會(huì)直接導(dǎo)致光合作用效率的降低[16]，而Chla含量可以作為一個(gè)反映植物在逆境條件下的光合能力的重要指標(biāo)。Dash等[3]和Oukarroum等[17]研究均發(fā)現(xiàn)AgNPs能抑制普通小球藻葉綠素合成。而El-Sheekh和El-Kassas[2]和單鳳娟等[5]研究發(fā)現(xiàn)AgNPs也可以抑制銅綠微囊藻細(xì)胞的存活和葉綠素的合成。這與本文結(jié)果一致?；谌~綠素含量進(jìn)行的毒性參數(shù)計(jì)算表明，Ag+對(duì)2種藻具有高毒性，而AgNPs表現(xiàn)為中等或低毒性。同時(shí)，Ag+對(duì)2種藻的毒性比AgNPs高了一個(gè)數(shù)量級(jí)，這2個(gè)結(jié)論與多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果是一致的[8, 9, 15, 17]。但對(duì)2種藻毒性絕對(duì)數(shù)據(jù)上的差異很大。如單風(fēng)娟等[5]研究表明AgNPs在1.965 mg·L-1開始顯著抑制銅綠微囊藻Chla合成，直到9.825 mg·L-1時(shí)完全抑制其合成。Oukarroum等[17]則發(fā)現(xiàn)10 mg·L-1AgNPs(粒徑50 nm)對(duì)普通小球藻在25 ℃和31 ℃的抑制率分別為64%和71%。這2個(gè)文獻(xiàn)報(bào)道的毒性均低于本文結(jié)果。但Park等[13]研究發(fā)現(xiàn)1 mg·L-1的AgNPs即對(duì)銅綠微囊藻產(chǎn)生87%的抑制，但其制備AgNPs時(shí)沒有透析等步驟，因此，并不能確認(rèn)是AgNPs的作用。而Qian等[9]研究則表明AgNPs對(duì)銅綠微囊藻的96 h-EC50僅為351.45 nmol·L-1(約為0.038 mg·L-1)，推測(cè)與實(shí)驗(yàn)所用的商業(yè)化AgNPs具有較小粒徑(9～10 nm)有關(guān)。而關(guān)于粒徑大小導(dǎo)致的毒性差異，Zouzelka等[18]研究發(fā)現(xiàn)Ag+和5 nm粒徑AgNPs對(duì)普通小球藻的毒性沒有顯著差異，但隨粒徑增加AgNPs對(duì)該藻的EC50顯著升高，并在37 nm粒徑時(shí)達(dá)到最大值。

表3 AgNPs和Ag+對(duì)銅綠微囊藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響Table 3 The values of the chlorophyll fluorescence parameters of Microcystis aeruginosa treated with AgNPs or Ag+

關(guān)于AgNPs對(duì)2種藻形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，有采用光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡的報(bào)道，如Oukarroum等[7]和El-Sheekh和El-Kassas[2]用光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)高濃度AgNPs可使培養(yǎng)液中的普通小球藻和銅綠微囊藻細(xì)胞大量聚集。在本實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)加入AgNPs后，大部分藻細(xì)胞均沉到三角瓶底部。而El-Sheekh和El-Kassas[2]利用掃描電鏡觀察到AgNPs結(jié)合在銅綠微囊藻細(xì)胞壁上，并引起細(xì)胞壁變形和裂解。另外，郝從芳等[6]根據(jù)丙二醛含量推斷AgNPs對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞膜造成了影響。Dash等[3]也發(fā)現(xiàn)普通小球藻表面聚集AgNPs顆粒，AgNPs對(duì)藻細(xì)胞有明顯的破壞作用。而在本文中，通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)AgNPs處理使普通小球藻細(xì)胞表面出現(xiàn)褶皺，部分細(xì)胞向內(nèi)塌陷，甚至發(fā)生裂解(圖3)。而對(duì)微囊藻，AgNPs可在藻細(xì)胞表面粘附(圖3j)，部分細(xì)胞出現(xiàn)變形，但沒有像普通小球藻一樣出現(xiàn)皺褶。另外，還可觀察到一些形狀不規(guī)則的物質(zhì)似乎使細(xì)胞粘連在一起。本文通過TEM觀察也發(fā)現(xiàn)藻細(xì)胞內(nèi)部出現(xiàn)了顯著變化，暫未發(fā)現(xiàn)相關(guān)報(bào)道。結(jié)合本文的SEM和TEM結(jié)果，銅綠微囊藻可能通過分泌胞外物質(zhì)吸附AgNPs顆粒，從而阻止其進(jìn)入細(xì)胞，推測(cè)這是該藻的解毒機(jī)制之一。與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，Zhou等[19]發(fā)現(xiàn)蛋白核小球藻細(xì)胞分泌胞外多聚物可以緩解AgNPs對(duì)的毒性。研究表明藻細(xì)胞壁和細(xì)胞膜可通過吸附和絡(luò)合作用阻止AgNPs的內(nèi)化[20]。雖然這可以降低AgNPs對(duì)藻的毒性，但值得注意的問題是通過胞外物質(zhì)吸附在細(xì)胞表面的非可利用度銀可以隨藻細(xì)胞遷移，并有通過食物鏈放大而產(chǎn)生生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)的可能[19]。

葉綠素?zé)晒馐窃u(píng)估逆境脅迫條件下植物光系統(tǒng)響應(yīng)的重要手段，可以快速準(zhǔn)確地反映出外界環(huán)境變化對(duì)植物生理的影響，近年來此技術(shù)得到快速的發(fā)展和應(yīng)用[12]。通過本實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)微藻在受脅迫條件下，其OJIP和部分葉綠素?zé)晒鈪?shù)發(fā)生較大變化。Oukarroum等[17]研究了AgNPs對(duì)普通小球藻光合系統(tǒng)II的影響，與本研究中波浪形OJIP曲線存在很大差異，可能跟藻株不同有關(guān)。而且該報(bào)道中不同處理濃度之間曲線的整體形狀差異非常小(最高處理濃度達(dá)10 mg·L-1)，而本文中高濃度AgNPs(2 mg·L-1)處理普通小球藻的OJIP曲線已經(jīng)變得很平，說明對(duì)PSII造成了嚴(yán)重影響。同時(shí)，本文還與Ag+對(duì)藻的影響進(jìn)行了比較，在幾乎相同的抑制率條件下(以葉綠素a含量計(jì))，Ag+對(duì)普通小球藻OJIP的影響比AgNPs的影響小很多。同時(shí)，所有參數(shù)中PSII原初光能轉(zhuǎn)化效率ΦP0最為敏感，在低濃度毒物影響下ΦP0即發(fā)生顯著改變，說明Ag+和AgNPs對(duì)原初光能轉(zhuǎn)化過程的影響是其對(duì)藻毒性機(jī)制之一。這與對(duì)中肋骨條藻的研究結(jié)果相似[4]，AgNPs粘附在細(xì)胞表面阻礙了藻細(xì)胞對(duì)光的吸收，抑制光能向光合作用電子傳遞的轉(zhuǎn)換，并使編碼光系統(tǒng)II反應(yīng)中心蛋白的基因顯著下調(diào)。這說明AgNPs的物理粘附和遮光效應(yīng)可能影響藻的光能傳遞系統(tǒng)，并損壞了PSII相關(guān)關(guān)鍵蛋白的功能。AgNPs引起的光合抑制效應(yīng)與Ag+的毒性作用存在顯著差異。但Qian等[9]研究卻發(fā)現(xiàn)AgNPs對(duì)普通小球藻ΦP0沒有顯著影響，推測(cè)與其實(shí)驗(yàn)濃度太低有關(guān)(最大濃度僅460 nmol·L-1)。

關(guān)于AgNPs對(duì)微藻的毒性機(jī)理已有很多研究報(bào)道，被廣泛接受的是釋放Ag+在AgNPs的毒性方面扮演重要角色，但是究竟起到多大的作用依然存在爭(zhēng)議。如Navarro等[21]即發(fā)現(xiàn)碳酸鹽包裹的AgNPs通過釋放Ag+對(duì)萊茵衣藻產(chǎn)生毒性。同時(shí)，研究也表明半胱氨酸可完全抑制AgNPs對(duì)該藻光合產(chǎn)量的影響，說明AgNPs毒性主要由溶解銀離子導(dǎo)致，并認(rèn)為毒性與AgNPs顆粒大小和包裹劑類型沒有關(guān)系[22]。He等[23]也發(fā)現(xiàn)雖然以總銀計(jì)Ag(I)對(duì)海洋卡盾藻的毒性大于AgNPs，但半胱氨酸可完全解除Ag(I)對(duì)藻生長(zhǎng)的抑制作用，也可以解除AgNPs對(duì)該藻的代謝活性的抑制作用，因此，認(rèn)為AgNPs的毒性源于釋放的Ag(I)。Ribeiro等[24]通過相干反斯托克斯拉曼光譜儀觀察發(fā)現(xiàn)AgNPs大量聚集在藻細(xì)胞表面，并沒有內(nèi)化的現(xiàn)象。因此，認(rèn)為AgNPs不能直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，而藻細(xì)胞內(nèi)Ag的積累是通過吸收Ag+導(dǎo)致。Yue等[25]也發(fā)現(xiàn)藻細(xì)胞壁可以作為屏障阻止其對(duì)AgNPs顆粒的吸收，認(rèn)為AgNPs主要是吸附于細(xì)胞表面，其毒性是由溶解銀導(dǎo)致。Burchardt[26]則認(rèn)為AgNPs的藻毒性由納米顆粒-藻細(xì)胞作用和釋放Ag+產(chǎn)生毒性共同導(dǎo)致，毒性大小由聚合狀態(tài)、粒徑、制備物穩(wěn)定性、釋放銀的種類等決定。如Ivask等[27]研究發(fā)現(xiàn)雖然20～80 nm粒徑范圍的AgNPs毒性完全由Ag離子的釋放所導(dǎo)致，但10 nm粒徑AgNPs的毒性比預(yù)測(cè)的釋放Ag+引起毒性更強(qiáng)，推測(cè)較小的粒徑可能產(chǎn)生更有效的細(xì)胞-顆粒物作用。而Huang等[28]甚至認(rèn)為AgNPs對(duì)中肋骨條藻起決定作用的是納米顆粒-細(xì)胞直接作用。

當(dāng)然，必須注意AgNPs和Ag+對(duì)微藻的毒性會(huì)隨著暴露時(shí)間延長(zhǎng)而降低，在微藻的作用下這2種銀形態(tài)之間有著復(fù)雜的轉(zhuǎn)換關(guān)系。如González等[29]的研究表明，兩者對(duì)藻的EC50值隨暴露時(shí)間增加而增大，認(rèn)為這與藻逐漸增加胞外多糖和溶解有機(jī)碳的釋放以吸附和鰲合Ag+有關(guān)。Kadukova[30]研究發(fā)現(xiàn)凱氏擬小球藻活細(xì)胞24 h內(nèi)可以使溶液中銀含量降低68%，但在接下來的14 d里絕大部分的銀被重新釋放到溶液中。在此過程中生產(chǎn)了部分AgNPs，這說明環(huán)境中活的藻細(xì)胞可以通過吸附和還原作用將Ag+轉(zhuǎn)化為AgNPs而解毒。與本論文一樣，已有的多數(shù)研究?jī)H評(píng)估了AgNPs對(duì)微藻的急性毒性，因此，今后應(yīng)該進(jìn)一步研究其亞急性和慢性毒性效應(yīng)及機(jī)理。

[1] Nel A, Xia T, Madler L, et al. Toxic potential of materials at the nano level [J]. Science, 2006, 311(5761): 622-627

[2] El-Sheekh M M, El-Kassas H Y. Application of biosynthesized silver nanoparticles against a cancer promoter cyanobacterium, Microcystis aeruginosa [J]. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention, 2014, 15(16): 6773-6779

[3] Dash A, Singh A P, Chaudhary B R, et al. Effect of silver nanoparticles on growth of eukarytic green algae [J]. Nano-Micro Letters, 2012, 4(3): 158-165

[4] Huang J, Cheng J, Yi J. Impact of silver nanoparticles on marine diatom Skeletonema costatum [J]. Journal of Applied Toxicology, 2016, 36: 1343-1354

[5] 單風(fēng)娟, 羅輝, 江鳳波, 等. 納米銀抑制銅綠微囊藻的研究[J]. 生物技術(shù), 2013, 23(1): 83-86

Shan F J, Luo H, Jiang F B, et al. Studies on the inhibitory effect of silver nanoparticles on Microcystis aeruginosa [J]. Biotechnology, 2013, 23(1): 83-86 (in Chinese)

[6] 郝從芳, 金新, 沈志凱, 等. 納米銀抑制銅綠微囊藻的機(jī)理研究[J]. 生物技術(shù), 2015, 25(1): 61-65

Hao C F, Jin X, Shen Z K, et al. Studies on the inhibitory mechanism of silver nanoparticles on Microcystis aeruginosa [J]. Biotechnology, 2015, 25(1): 61-65 (in Chinese)

[7] Oukarroum A, Bras S, Perreault F, et al. Inhibitory effects of silver nanoparticles in two green algae,Chlorella vulgaris and Dunaliella tertiolecta [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2012, 78: 80-85

[8] 苑志華, 湯曉琳, 白炎青, 等. 納米銀對(duì)小球藻光合作用和呼吸作用的影響[J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2013, 33(8): 1468-1473

Yuan Z H, Tang X L, Bai Y Q, et al. Effects of silver nanoparticles on photosynthesis and respiration of Chlorella vulgaris [J]. China Environmental Science, 2013, 33(8): 1468-1473 (in Chinese)

[9] Qian H, Zhu K, Lu H, et al. Contrasting silver nanoparticle toxicity and detoxification strategies in Microcystis aeruginosa and Chlorella vulgaris: New insights from proteomic and physiological analyses [J]. Science of the Total Environment, 2016, 572: 1213-1221

[10] Munro C H, Smith W E, Garner M, et al. Characterization of the surface of a citrate-reduced colloid optimized for use as a substrate for surface-enhanced resonance Raman scattering [J]. Langmuir, 1995, 11(10): 3712-3720

[11] 周永欣, 張宗涉. 水生生物毒性試驗(yàn)方法[M]. 北京: 農(nóng)業(yè)出版社, 1989: 114-122

Zhou Y X, Zhang Z S. Test Methods for Aquatic Biotoxicology [M]. Beijing: Agricultural Press, 1989: 114-122 (in Chinese)

[12] Jena S, Acharya S, Mohapatra P K. Variation in effects of four OP insecticides on photosynthetic pigment fluorescence of Chlorella vulgaris [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2012, 80: 111-117

[13] Park M H, Kim K H, Lee H H, et al. Selective inhibitory potential of silver nanoparticles on the harmful cyanobacterium Microcystis aeruginosa [J]. Biotechnology Letters, 2010, 32(3): 423-428

[14] Zaheer K, Shaeel A A, Abdullah Y O, et al. Preparation and characterization of silver nano-particles by chemical reduction [J]. Method Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2011, 82(2): 513-517

[15] Dorobantu L S, Fallone C, Noble A J, et al. Toxicity of silver nanoparticles against bacteria, yeast, and algae [J]. Journal of Nanoparticle Research, 2015, 17(4): 172-185

[16] 鄧祥元, 胡小麗, 成婕, 等. 納米二氧化鈰對(duì)蛋白核小球藻的生物學(xué)效應(yīng)研究[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2016, 11(5): 111-116

Deng X Y, Hu X L, Cheng J, et al. Effects of nanoparticle CeO2on the physiology of Chlorella pyrenoidosa [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(5): 111-116 (in Chinese)

[17] Oukarroum A, Polchtchikov S, Perreault F, et al. Temperature influence on silver nanoparticles inhibitory effect on photosystem II photochemistry in two green algae, Chlorella vulgaris and Dunaliella tertiolecta [J]. Environmental Science and Pollution Research, 2012, 19(5): 1755-1762

[18] Zouzelka R, Cihakova P, Ambrozova J R, et al. Combined biocidal action of silver nanoparticles and ions against Chlorococcales (Scenedesmus quadricauda, Chlorella vulgaris) and filamentous algae (Klebsormidium sp.) [J]. Environmental Science and Pollution Research, 2016, 23(9): 8317-8326

[19] Zhou K, Hu Y, Zhang L, et al. The role of exopolymeric substances in the bioaccumulation and toxicity of Ag nanoparticles to algae [J]. Scientific Reports, 2016, DOI: 10.1038/srep32998

[20] Piccapietra F, Allué C G, Sigg L, et al. Intracellular silver accumulation in Chlamydomonas reinhardtii upon exposure to carbonate coated silver nanoparticles and silver nitrate [J]. Environmental Science & Technology, 2012, 46: 7390-7397

[21] Navarro E, Piccapietra F, Wagner B, et al. Toxicity of silver nanoparticles to Chlamydomonas reinhardtii [J]. Environmental Science & Technology, 2008, 42: 8959-8964

[22] Navarro E, Wagner B, Odzak N, et al. Effects of differently coated silver nanoparticles on the photosynthesis of Chlamydomonas reinhardtii [J]. Environmental Science and Technology, 2015, 49: 8041-8047

[23] He D, Dorantes-Aranda J J, Waite T D. Silver nanoparticle algae interactions: Oxidative dissolution, reactive oxygen species generation and synergistic toxic effects [J]. Environmental Science and Technology, 2012, 46(16): 8731-8738

[24] Ribeiro F, Gallego-Urrea J A, Goodhead R M, et al. Uptake and elimination kinetics of silver nanoparticles and silver nitrate by Raphidocelis subcapitata: The influence of silver behaviour in solution [J]. Nanotoxicology, 2014, 9(6): 1-10

[25] Yue Y, Li X, Sigg L, et al. Interaction of silver nanoparticles with algae and fish cells: A side by side comparison [J]. Journal of Nanobiotechnology, 2017, 15: 16-26

[26] Burchardt A D, Carvalho R N, Valente A, et al. Effects of silver nanoparticles in diatom Thalassiosira pseudonana and cyanobacterium Synechococcus sp. [J]. Environmental Science and Technology, 2012, 46: 11336-11344

[27] Ivask A, Kurvet I, Kasemets K. Size-dependent toxicity of silver nanoparticles to bacteria, yeast, algae, crustaceans and mammalian cells in vitro [J]. PLOS One, 2014, DOI: 10.1371/journal.pone.0102108.

[28] Huang T, Sui M, Yan X, et al. Anti-algae efficacy of silver nanoparticles to Microcystis aeruginosa: Influence of NOM, divalent cations, and pH [J]. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 2016, 509: 492-503

[29] González A G, Fernández-Rojo L, Leflaive J, et al. Response of three biofilm-forming benthic microorganisms to Ag nanoparticles and Ag+: The diatom Nitzschia palea, the green alga Uronema confervicolum and the cyanobacteria Leptolyngbya sp. [J]. Environmental Science and Pollution Research, 2016, 23: 22136-22150

[30] Kadukova J. Surface sorption and nanoparticle production as a silver detoxification mechanism of the freshwater alga Parachlorella kessleri [J]. Bioresource Technology, 2016, 216: 406-413