廖立敏，李建鳳，雷光東

內(nèi)江師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院， 內(nèi)江 641100

含氯苯酚類(lèi)化合物用途廣泛，如在木材防腐、水消毒、殺菌、除草等方面廣泛應(yīng)用。隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展、廢水的排放，含氯苯酚類(lèi)化合物正在不斷地進(jìn)入江、河、湖、海等各種水體。環(huán)境中的含氯苯酚類(lèi)化合物有毒、穩(wěn)定性好，嚴(yán)重威脅動(dòng)、植物生長(zhǎng)和繁殖，影響人類(lèi)健康。因此，研究含氯苯酚類(lèi)化合物的性質(zhì)對(duì)于規(guī)范其生產(chǎn)、使用和排放具有重要意義。定量構(gòu)效關(guān)系(QSAR)研究是快速獲取大量環(huán)境毒物生物毒性的有效手段之一，研究者們?cè)谶@方面已經(jīng)做過(guò)許多有意義的工作[1-3]，在這些工作中都要進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)優(yōu)化或結(jié)構(gòu)重疊等操作，計(jì)算工作量大、效率低，方法復(fù)雜難懂。含氯苯酚類(lèi)化合物在淡水中的生物毒性QSAR研究已有一些報(bào)道，如顧云蘭等[4]研究了氯酚化合物對(duì)發(fā)光細(xì)菌的毒性，仝建波等[5]研究了氯苯與氯酚類(lèi)化合物對(duì)戈卑魚(yú)的毒性。該類(lèi)化合物對(duì)海洋生物毒性的QSAR研究較少，本文研究該類(lèi)化合物對(duì)海洋中的杜氏鹽藻的毒性。在有機(jī)化合物定量結(jié)構(gòu)與性質(zhì)關(guān)系(QSPR)研究中，分子結(jié)構(gòu)參數(shù)化表達(dá)是關(guān)鍵的步驟之一。在分子結(jié)構(gòu)參數(shù)化方面，實(shí)驗(yàn)室做過(guò)許多有意義的探索[6-9]。本文在參閱了文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了新的結(jié)構(gòu)描述符用于分子結(jié)構(gòu)參數(shù)化表達(dá)，結(jié)構(gòu)描述符完全來(lái)自化合物分子自身結(jié)構(gòu)的計(jì)算，簡(jiǎn)單易懂、計(jì)算工作量小。采用偏最小二乘回歸(PLS)建立了含氯苯酚類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)與毒性(-lgIC50)關(guān)系模型，可為環(huán)境中有機(jī)污染物的QSAR研究提供參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

選取20 個(gè)含氯苯酚類(lèi)化合物為研究樣本，化合物毒性以其對(duì)海洋中的杜氏鹽藻96 h的半數(shù)抑制濃度IC50表示，-lgIC50實(shí)驗(yàn)值取自文獻(xiàn)[10]，列于表1。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 化合物分子結(jié)構(gòu)表征

化合物的毒性值(-lgIC50)除了與測(cè)量因素有關(guān)外，還與分子的結(jié)構(gòu)相關(guān)，取代基的種類(lèi)、大小及數(shù)目、雜原子等都會(huì)影響其毒性值(-lgIC50)。認(rèn)為在化合物的隱氫圖中，處于骨架地位的非氫原子及非氫原子之間的關(guān)系對(duì)化合物毒性值(-lgIC50)產(chǎn)生重要影響，而非骨架氫原子僅僅影響與其直接相連的非氫原子染色值。不同的非氫原子及不同類(lèi)型的關(guān)系對(duì)毒性值(-lgIC50)的影響可能不同，首先將非氫原子按照文獻(xiàn)[8-9]方法進(jìn)行分類(lèi)，記為A1、A2、A3、A4這4 種類(lèi)型，A1表示與1 個(gè)其他非氫原子直接相連，以此類(lèi)推。如與3 個(gè)非氫原子直接相連的叔碳原子屬于A3。然后在參閱文獻(xiàn)[11]的基礎(chǔ)上為每個(gè)非氫原子進(jìn)行參數(shù)化染色，采用式(1)計(jì)算。

Zi=[mi(ni-1)-hi]1/2

(1)

式中ni表示非氫原子i的電子層數(shù)，mi表示其最外層電子數(shù)，hi為與其直接連接的氫原子數(shù)。

各種類(lèi)型的非氫原子自身對(duì)化合物毒性值(-lgIC50)的影響，按式(2)進(jìn)行分類(lèi)累加。

xk=∑Zi(k=1，2，3，4)

(2)

式中，k表示非氫原子i的原子類(lèi)型；i為非氫原子在分子中的編碼；Zi為非氫原子的染色值，按式(1)計(jì)算。根據(jù)非氫原子的分類(lèi)，對(duì)于一個(gè)化合物最多含有4 種原子類(lèi)型，因此最終可分類(lèi)累加得到4 個(gè)非氫原子自身對(duì)化合物性質(zhì)貢獻(xiàn)項(xiàng)，用x1, x2, x3及x4表示。

(3)

Zi、Zj為非氫原子的染色值，按式(1)計(jì)算；dij為關(guān)系中的非氫原子i到非氫原子j的相對(duì)距離(兩者間最短路徑所經(jīng)化學(xué)鍵鍵長(zhǎng)之和/碳碳單鍵鍵長(zhǎng)，如有多條路徑，則以最短的為準(zhǔn))；n和l為非氫原子按上述分類(lèi)法所屬類(lèi)型；a=0.5。化合物中4類(lèi)非氫原子可以組合出10種關(guān)系項(xiàng)：m11，m12，m13，m14，m22，m23，m24，m33，m34，m44，簡(jiǎn)寫(xiě)為x5，x6，… ，x13和x14，如m13(即x7)表示第1類(lèi)非氫原子跟第3類(lèi)非氫原子之間的關(guān)系，依此類(lèi)推。這樣對(duì)于所有的化合物最多將產(chǎn)生14個(gè)結(jié)構(gòu)描述符值來(lái)描述結(jié)構(gòu)信息。

1.2.2 QSAR建模與檢驗(yàn)

采用偏最小二乘(partial least squares, PLS)回歸方法建立模型，運(yùn)用“留一法”對(duì)模型穩(wěn)定性進(jìn)行檢驗(yàn)。PLS是近幾十年發(fā)展起來(lái)的多元統(tǒng)計(jì)方法，在定量構(gòu)效關(guān)系中廣泛應(yīng)用。PLS特別適合樣本數(shù)較少，而變量數(shù)較多的情況建模。它通過(guò)對(duì)X和Y矩陣同時(shí)做雙線性分解，并將分解所得潛隱變量再做一次最小二乘擬合以得到最終模型，詳細(xì)原理請(qǐng)參見(jiàn)文獻(xiàn)[12]。一般認(rèn)為，建模相關(guān)系數(shù)(R2)在0.64～1.0之間，表明模型高度相關(guān)；標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)與數(shù)值范圍的比例小于10%時(shí)，表明模型計(jì)算準(zhǔn)確性良好；交互檢驗(yàn)相關(guān)系數(shù)(Q2)≥0.50，表明模型具有良好的穩(wěn)健性[13]；模型對(duì)未參與建模的外部樣本毒性預(yù)測(cè)誤差小，表明模型預(yù)測(cè)能力強(qiáng)。

表1 化合物及其毒性(-lgIC50)Table 1 Compounds and their toxicity (-lgIC50)

2 結(jié)果(Results)

由于研究樣本中不含有第4類(lèi)非氫原子，因而得到的結(jié)構(gòu)描述符中與第4類(lèi)非氫原子相關(guān)的x4，x8，x11，x13，x14這5個(gè)變量為全“0”項(xiàng)，剩余9個(gè)變量用于建模分析。將化合物結(jié)構(gòu)描述符作為自變量X，化合物毒性值(-lgIC50)作為因變量Y，建立偏最小二乘(PLS)模型。發(fā)現(xiàn)主成分?jǐn)?shù)(A)為4的PLS模型效果良好，此時(shí)化合物毒性(-lgIC50)與原始自變量回歸方程式為：-lgIC50= 18.359+0.213×x1+0.174×x2+0.203×x3-32.426×x5-2.413×x6-0.01×x7-1.336×x9-0.475×x10-0.219×x12。此時(shí)PLS模型建模相關(guān)系數(shù)(R2)為0.948，處在0.64～1.0之間；交互檢驗(yàn)的相關(guān)系數(shù)(Q2)為0.922，遠(yuǎn)大于0.50；標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)為0.184，與數(shù)值范圍[2.91-(-0.3)=3.21]之比為5.73%，小于10%的標(biāo)準(zhǔn)。

圖1為樣本在偏最小二乘(PLS)前2個(gè)主成分得分圖，可以發(fā)現(xiàn)95%的樣本點(diǎn)都落在95%置信度Hotelling T2橢圓置信圈內(nèi)；為了考察樣本在X空間的擬合情況，對(duì)樣本在X空間的規(guī)格化模型距離作了分析(見(jiàn)圖2)，可以看到，所有樣本的規(guī)格化模型距離都在95%的置信區(qū)間內(nèi)，小于臨界值1.926，沒(méi)有特異點(diǎn)。以上說(shuō)明本文構(gòu)建的化合物結(jié)構(gòu)描述符能夠恰當(dāng)表現(xiàn)含氯苯酚類(lèi)化合物分子結(jié)構(gòu)特征，并在統(tǒng)計(jì)模型中得到正確反映，模型總體質(zhì)量良好，可以用于分析影響化合物毒性(-lgIC50)的結(jié)構(gòu)因素。

圖1 樣本在前2個(gè)主成分得分分布Fig. 1 Compounds score distribution in the front two principal components

模型對(duì)每個(gè)樣本的毒性值(-lgIC50)擬合程度的好壞，還可從樣本的殘差進(jìn)行分析，圖3為含氯苯酚類(lèi)化合物的毒性值(-lgIC50)的標(biāo)準(zhǔn)化殘差累積概率分布圖，樣本標(biāo)準(zhǔn)化殘差基本服從正態(tài)分布，所有樣本的標(biāo)準(zhǔn)化殘差均小于±3 倍標(biāo)準(zhǔn)偏差，絕大多數(shù)樣本的標(biāo)準(zhǔn)化殘差小于±2 倍標(biāo)準(zhǔn)偏差，只有1個(gè)樣本略微超出-2倍標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍，進(jìn)一步說(shuō)明模型擬合能力優(yōu)良。

圖2 偏最小二乘X空間規(guī)格化模型距離Fig. 2 Normalized distance to PLS model in X space

圖3 標(biāo)準(zhǔn)化殘差累積概率分布圖Fig. 3 The cumulative probability of standardized residual

為進(jìn)一步驗(yàn)證PLS模型穩(wěn)定性，說(shuō)明擬合效果是否為偶然因素所致，對(duì)模型進(jìn)行了20 次Y隨機(jī)排序驗(yàn)證(Y random permutations test)。以原始變量Y和排序后的變量Y的相關(guān)系數(shù)對(duì)模型的R2和Q2作圖(圖4)，并作線性回歸。一般來(lái)說(shuō)，好的模型要求R2和Q2的截距分別小于0.300和0.050[14]。圖中可以看到本文所建模型R2和Q2回歸線的截距分別為：-0.0167和-0.480，因此可以認(rèn)為模型的良好結(jié)果并非偶然因素所致。

圖4 Y隨機(jī)排序驗(yàn)證結(jié)果Fig. 4 The results of Y random permutations

圖5 樣本的偏最小二乘t1-u1圖Fig. 5 The t1-u1 plot of the samples

圖6 變量重要性投影Fig. 6 Importance of variables

為了分析X空間得分與Y空間得分的相關(guān)性，以t1-u1作圖(見(jiàn)圖5)，從圖中可以發(fā)現(xiàn)t1和u1之間表現(xiàn)出良好的線性相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)R2達(dá)0.688)，說(shuō)明第一個(gè)主成分就可以很好地解析毒性數(shù)據(jù)Y中的信息。以毒性值(-lgIC50)大小進(jìn)行著色，圖中可以發(fā)現(xiàn)毒性值(-lgIC50)大的樣本t1、u1得分值也較高，而毒性值(-lgIC50)小的樣本t1、u1得分值也較低，化合物毒性值(-lgIC50)大小得到很好的區(qū)分和歸類(lèi)。

圖6為變量重要性投影指標(biāo)圖，通過(guò)該圖可以清楚地顯示各結(jié)構(gòu)描述符對(duì)化合物的毒性值(-lgIC50)的影響大小。一般認(rèn)為，VIP大于1的變量對(duì)Y影響較大，解釋能力較強(qiáng)。x5的VIP值明顯大于1，因而對(duì)化合物毒性值(-lgIC50)影響最顯著。x5對(duì)應(yīng)于第 1 類(lèi)非氫原子之間的關(guān)系項(xiàng)，說(shuō)明第1類(lèi)非氫原子的種類(lèi)、數(shù)量及分布情況對(duì)該類(lèi)化合物毒性值(-lgIC50)的影響顯著，例如20號(hào)化合物具有最多的第1類(lèi)非氫原子(取代基Cl)，且分布均勻，因而具有最大的毒性值(-lgIC50)。含氯苯酚類(lèi)化合物對(duì)杜氏鹽藻產(chǎn)生毒性可能分為兩步：化合物穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入生物體內(nèi)；化合物作為電子給與體或氫鍵受體而與生物體內(nèi)的受體物質(zhì)發(fā)生作用?；衔锱c受體發(fā)生作用主要是在羥基上，苯環(huán)上取代基Cl對(duì)羥基O原子凈電荷影響較小，因而各化合物表現(xiàn)出的毒性效應(yīng)主要取決于化合物對(duì)生物膜的穿透能力。苯環(huán)上的取代基Cl越多，化合物具有越大的脂水分配系數(shù)(KOW)，越容易穿透細(xì)胞膜，因而毒性越大。

為進(jìn)一步說(shuō)明運(yùn)用本文的結(jié)構(gòu)描述符及所采用的建模方法構(gòu)建的模型對(duì)外部樣本的預(yù)測(cè)能力，抽取5、10、15和20號(hào)化合物(毒性值分別為0.88、1.39、1.73和2.91)作為外部測(cè)試樣本，利用剩下的15個(gè)化合物同法建立模型。模型對(duì)上述樣本毒性的預(yù)測(cè)值分別為0.88、1.28、1.63和2.46，誤差分別為0.00、0.11、0.10和0.45。預(yù)測(cè)誤差小，說(shuō)明運(yùn)用本文構(gòu)建的結(jié)構(gòu)描述符所建立的PLS模型預(yù)測(cè)能力強(qiáng)、預(yù)測(cè)效果好。PLS模型對(duì)全部化合物的毒性值(-lgIC50)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)值列于表1的Cal.列，誤差列入Err.列，從表中也可以大致發(fā)現(xiàn)模型對(duì)化合物的毒性值(-lgIC50)預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性高、誤差小，效果優(yōu)良。

3 討論(Discussion)

將化合物分子中非氫原子按照所連其他非氫原子數(shù)進(jìn)行分類(lèi)，將不同類(lèi)非氫原子進(jìn)行參數(shù)化染色，將分子中非氫原子自身染色參數(shù)值分類(lèi)累加及非氫原子之間的關(guān)系作為結(jié)構(gòu)描述符，對(duì)部分含氯苯酚類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行了參數(shù)化表達(dá)，進(jìn)而采用偏最小二乘回歸(PLS)方法構(gòu)建了該類(lèi)化合物定量結(jié)構(gòu)-毒性值(-lgIC50)的QSAR模型。模型經(jīng)檢驗(yàn)，具有可接受的預(yù)測(cè)能力與總體穩(wěn)健性，可以用于含氯苯酚類(lèi)化合物毒性值(-lgIC50)預(yù)測(cè)。本文所構(gòu)建的分子結(jié)構(gòu)描述符與文獻(xiàn)[2-3]相比，不需要考慮分子構(gòu)象優(yōu)化、重疊等問(wèn)題，因而具有簡(jiǎn)單易懂、計(jì)算方便、計(jì)算工作量小等優(yōu)點(diǎn)，本文可為環(huán)境中有機(jī)污染物的QSAR研究提供一種新的方法，具有一定的參考價(jià)值。

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