蔡金萍

摘 要：在當(dāng)前的污水處理過程中，重點(diǎn)研究了微生物的處理方式，在污水生物處理的過程中，污水生物處理系統(tǒng)的地位是不可動(dòng)搖的，但是在過去的研究過程中，對(duì)于微生物而言，存在著十分明顯的缺陷，這主要是因?yàn)檫^去采用的技術(shù)手段過于單一，以純培養(yǎng)技術(shù)為主，這樣只能進(jìn)行菌種分離，但是在污水生物處理的相關(guān)系統(tǒng)中含有較多的微生物菌群，這些菌群中蘊(yùn)含著眾多的微生物，所以在空間中聚集在一起，微生物并不是單一存在的，而是需要不斷的競爭以及依存才能得到成長，所以在進(jìn)行菌種分離以后，就無法創(chuàng)造這樣一個(gè)空間，由此便出現(xiàn)了分子生物技術(shù)。

關(guān)鍵詞：硝化菌群；分子生物技術(shù)；熒光原位雜交

分子生物技術(shù)的應(yīng)用對(duì)于污水生物處理帶來了一定的幫助，是現(xiàn)階段應(yīng)用比較普遍的一項(xiàng)技術(shù)手段，在進(jìn)行污水生物處理的過程中，主要包含兩個(gè)階段，一個(gè)階段是硝化，一個(gè)階段是反硝化，這兩個(gè)階段都是脫氮的主要環(huán)節(jié)，在硝化過程中，主要的微生物是硝化菌群，其中包含了眾多的微生物離子，在污水生物處理的過程中，主要依靠了生物活性以及穩(wěn)定的菌群分布兩個(gè)主要特點(diǎn)，這樣才能促進(jìn)污水生物系統(tǒng)中脫氮更加穩(wěn)定的運(yùn)行。在應(yīng)用分子生物技術(shù)處理污水中硝化菌群的過程中，已經(jīng)有相關(guān)研究項(xiàng)目對(duì)此展開了詳細(xì)的分析，本文主要對(duì)此加以論述，希望對(duì)今后的研究工作帶來一定的幫助。

1 基于FISH技術(shù)的分析方法

這一技術(shù)的應(yīng)用主要是在目標(biāo)微生物的基礎(chǔ)上根據(jù)基因的特異性進(jìn)行排列而成的，在設(shè)計(jì)的過程中，其中還含有寡核苷酸探針，具有熒光染料的特點(diǎn)，在堿基序列互補(bǔ)性的基礎(chǔ)上，只要經(jīng)過相應(yīng)的雜交，就會(huì)顯示出熒光信號(hào)，這說明雜交成功，在顯微鏡的顯示下，可以對(duì)目的基因加以相對(duì)定量分析以及定性分析，在典型的FISH技術(shù)中，可以選擇具有不同特異性序列的微生物加以檢測，這樣就可以對(duì)微生物群中的結(jié)構(gòu)的變化情況進(jìn)行研究，從而得出應(yīng)有的信息。這種方法在污水生物系統(tǒng)中的應(yīng)用是十分普遍的，并且隨著信息技術(shù)的發(fā)展，這一技術(shù)也得到了進(jìn)一步的完善。

以FISH-MAR技術(shù)為例，這一技術(shù)是建立在FISH技術(shù)基礎(chǔ)之上的，因?yàn)閱为?dú)采用FISH技術(shù)處理生物代謝等問題還存在一定的局限性，所以在現(xiàn)代化的應(yīng)用過程中建立起了FISH-MAR技術(shù)，這一技術(shù)是通過顯微照片的形式將生物的復(fù)雜性展示出來，清晰的顯示出相應(yīng)的菌群結(jié)構(gòu)以及空間分布等問題，這一技術(shù)的核心在于可以在無機(jī)底物中加以培養(yǎng)，并且對(duì)具有放射性的細(xì)胞進(jìn)行收集，在影像中所呈現(xiàn)出來的顏色是黑色，具體的實(shí)驗(yàn)流程是先將適量的污泥加入到血清瓶中，然后在血清瓶中加入適量的放射性標(biāo)記底物，再經(jīng)過2h的好氧培養(yǎng)，這樣就可以得到污泥樣品，將樣品固定以后加以沖洗，經(jīng)過FISH程序與MAR程序以后通過顯微鏡進(jìn)行觀察，得出相應(yīng)的結(jié)論。

這種方式對(duì)微生物代謝與微生物群種結(jié)構(gòu)的研究具有重要的意義，但是不足之處在于對(duì)目標(biāo)含量較低的微生物結(jié)構(gòu)來說并不適用，因?yàn)檫@種方式需要建立在熒光信號(hào)以及放射自顯影的基礎(chǔ)上，所以在活性污泥中，如果目標(biāo)微生物的細(xì)胞過低，那么就會(huì)造成目標(biāo)微生物的rRNA也具有較低的含量，這樣就會(huì)對(duì)熒光信號(hào)產(chǎn)生一定的影響，不能得到正常的顯影，進(jìn)而無法準(zhǔn)確的檢測出結(jié)果。因此，如果硝化菌群無法呈現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)菌群的特征時(shí)，那么就不適合采用FISH-MAR這一技術(shù)，即便是使用了這一方法，也無法獲得顯著的效果。

2 基于PCR技術(shù)的分析方法

2.1 amoA與16SrRNA基因

在應(yīng)用這一技術(shù)的過程中，主要是選擇具有進(jìn)化標(biāo)記的硝化菌群中的DNA序列進(jìn)行研究，在這一序列的基礎(chǔ)上，可以得知選擇的分子標(biāo)記基因?yàn)?6SrRNA基因以及amoA。在對(duì)其進(jìn)行研究的過程，這一技術(shù)所產(chǎn)生的影響是十分深遠(yuǎn)的，對(duì)于不同的微生物而言，16SrRNA在區(qū)域中所具有的差異也是十分明顯的，其中可以分為兩個(gè)組成部分，一個(gè)組成部分是古細(xì)菌，一個(gè)組成部分是細(xì)菌，在此基礎(chǔ)上對(duì)微生物開展了更加深入的分析，在進(jìn)行微生物分析的過程中，發(fā)現(xiàn)基因結(jié)構(gòu)也是具有一定差異性影響的，16SrRNA自身具有保守性以及差異性的特點(diǎn)，通過上述的特點(diǎn)可以對(duì)系統(tǒng)發(fā)育以及相應(yīng)的進(jìn)化距離加以進(jìn)一步的確定。

大部分AOB在分別基于amoA和16SrRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹上的分類有著高度的相似性。他們同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，盡管對(duì)AOB的16SrRNA基因和amoA基因進(jìn)行定性分析時(shí)都可以反映出環(huán)境中AOB的種類，但由于不同種AOB之間的16SrRNA基因序列的高度相似性和該類型引物的非特異性，限制了16SrRNA基因類引物對(duì)AOB菌群系統(tǒng)發(fā)育樹分析的精確度。而盡管amoA不是制定系統(tǒng)發(fā)育樹的因子，但由于amoA只存在于AOB中，而且不同種AOB的amoA序列差異度超過其16SrRNA基因的序列差異度，使得amoA類引物的擴(kuò)增特異性更強(qiáng)，因此對(duì)AOB菌群遺傳差異的分辨能力更高，從而能夠更精確地分辯出AOB的種屬。但無論是amoA類引物，還是16SrRNA基因類引物，目前都只針對(duì)β-變形菌綱的自養(yǎng)型AOB，因此在使用這兩類引物對(duì)AOB進(jìn)行分析研究時(shí)都會(huì)低估環(huán)境樣品中AOB菌群的多樣性。

2.2 PCR-T-RFLP

PCR-T-RFLP（PCR-terminal restriction fragment length polymorphism，PCR-末端限制性片段長度多態(tài)性）技術(shù)是對(duì)PCR擴(kuò)增過程中所使用的引物一端用熒光物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。當(dāng)用該引物對(duì)樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物就帶有了熒光標(biāo)記。然后選擇適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行消化，就可產(chǎn)生不同長度的限制性片段。傳統(tǒng)的T-RFLP技術(shù)通常只使用一條帶有熒光染料的引物和一種限制性內(nèi)切酶。隨著該技術(shù)的改進(jìn)，有的研究者會(huì)同時(shí)使用兩條帶有不同熒光染料的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而提高目標(biāo)微生物的分類水平。最后利用DNA自動(dòng)測序儀和帶有其它熒光染料標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)物對(duì)消化產(chǎn)物的長度進(jìn)行分析，并獲得峰值圖。由于每種微生物帶熒光標(biāo)記的限制性片段長度唯一，所以峰值圖中每一個(gè)峰至少代表一種微生物，每個(gè)峰面積與峰總面積的比值代表這種微生物的相對(duì)含量。相對(duì)于PCR-DGGE技術(shù)，PCR-T-RFLP技術(shù)能在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)對(duì)大量樣品的菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。PCR-T-RFLP技術(shù)還具有較好的重現(xiàn)性和更高的靈敏度，從而該技術(shù)能夠?qū)悠分泻枯^少的微生物進(jìn)行研究。

3 結(jié)論與展望

分子生物技術(shù)在污水生物處理系統(tǒng)內(nèi)硝化菌群研究中的應(yīng)用，從微生物學(xué)角度更本質(zhì)地揭示了影響污水生物處理系統(tǒng)硝化性能的因素。本文提到的分子生物技術(shù)在污水處理中脫氮除磷相關(guān)機(jī)理和理論的研究中也有著廣闊的應(yīng)用前景，如短程脫氮、反硝化除磷、同步硝化反硝化及厭氧氨氧化等。通過這些技術(shù)可以識(shí)別特定生物代謝過程的微生物種群；建立目標(biāo)菌群動(dòng)態(tài)變化與工藝運(yùn)行參數(shù)之間的相關(guān)關(guān)系；從微生物學(xué)角度對(duì)系統(tǒng)運(yùn)行狀態(tài)給予最直接、最可靠的分析與證明，為污水生物脫氮除磷系統(tǒng)的長期穩(wěn)定運(yùn)行奠定理論基礎(chǔ)，提供借鑒與指導(dǎo)。

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