盧錦標(biāo) 沈小兵 蘇城 楊蕾 都偉欣 王國(guó)治 陳保文

·論著·

異煙肼聯(lián)合重組結(jié)核疫苗AEC/BC02對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染豚鼠的治療效果評(píng)價(jià)

盧錦標(biāo) 沈小兵 蘇城 楊蕾 都偉欣 王國(guó)治 陳保文

目的 評(píng)價(jià)異煙肼聯(lián)合重組結(jié)核疫苗AEC/BC02(BCG-CpG復(fù)合佐劑，即BCG-CpG-DNA+Al)對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染豚鼠的治療效果。方法 選取30只無(wú)特定病原體(specific pathogen free，SPF)級(jí)豚鼠，在皮下注射結(jié)核分枝桿菌菌液[1000菌落形成單位(CFU)/只]1周后，按不同治療方式分成4個(gè)組：即AEC/BC02組(6只)，采用AEC/BC02疫苗進(jìn)行肌肉免疫；INH組(6只)，采用異煙肼10 mg進(jìn)行灌胃治療；INH+AEC/BC02組，先采用異煙肼進(jìn)行灌胃治療2周后，再采用AEC/BC02疫苗進(jìn)行肌肉免疫；生理鹽水(NS)組(12只)，作為陰性對(duì)照，僅注射NS。所有豚鼠在進(jìn)行攻毒(注射結(jié)核分枝桿菌菌液)后第10周被解剖，以豚鼠肝、脾、肺臟病變指數(shù)評(píng)分評(píng)價(jià)臟器病變，并計(jì)算各臟器活菌載量(lg CFU)。結(jié)果 AEC/BC02組、INH組和INH+AEC/BC02組的整體臟器綜合病變?cè)u(píng)分分別為(36.7±28.2)、(20.0±12.7)和(3.3±5.2)分，均低于NS組的(69.2±24.5)分，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別為q=4.37，P=0.023；q=6.61，P<0.001；q=8.85，P<0.001)；INH+AEC/BC02組整體臟器綜合病變?cè)u(píng)分低于AEC/BC02組，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=3.88，P=0.049)。INH+AEC/BC02組的脾臟活菌載量為(1.06±1.64) lg CFU，低于INH組的(3.55±1.90) lg CFU、AEC/BC02組的(4.21±0.78) lg CFU及NS組的(4.73±0.79) lg CFU，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別為q=4.84，P=0.011；q=6.12，P=0.001；q=8.23，P<0.001)。INH+AEC/BC02組的肺臟活菌載量為(0.69±1.07) lg CFU，低于INH組的(2.66±1.70) lg CFU、AEC/BC02組的(3.01±0.90) lg CFU及NS組的(4.36±0.79) lg CFU，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別為q=4.43，P=0.021；q=5.21，P=0.006；q=9.50，P<0.001)；INH組的肺臟活菌載量低于NS組，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=4.39，P=0.022)。結(jié)論 異煙肼和AEC/BC02疫苗聯(lián)合使用優(yōu)于單一治療方式，能夠明顯減輕動(dòng)物臟器病變，降低脾臟和肺臟的活菌載量。

分枝桿菌，結(jié)核； 異煙肼； 疫苗,合成； 藥物療法, 聯(lián)合； 疾病模型, 動(dòng)物； 對(duì)比研究

據(jù)WHO估計(jì)[1-2]，2015年全球共有1040萬(wàn)例新發(fā)結(jié)核病患者，其中中國(guó)新發(fā)患者92萬(wàn)例，在全球30個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家中位列第三。盡管卡介苗作為現(xiàn)在唯一可用的結(jié)核病疫苗在中國(guó)被廣泛使用，但其對(duì)成人的保護(hù)效果不確定，且對(duì)潛伏性結(jié)核感染(LTBI)無(wú)效[3]。中國(guó)的LTBI者早期估計(jì)達(dá)到全人群的1/3，最近的研究認(rèn)為這一人數(shù)被高估，但其數(shù)量仍然巨大[4]；對(duì)這一人群進(jìn)行提前干預(yù)，降低發(fā)病率，是中國(guó)結(jié)核病防制體系實(shí)施工作的關(guān)鍵。

目前，結(jié)核病患者和LTBI者的臨床治療手段主要是化療，但因化療存在不良反應(yīng)多、患者治療依從性不高等問(wèn)題，易導(dǎo)致耐藥結(jié)核病的發(fā)生。疫苗的作用機(jī)制決定其可以減輕或避免這些問(wèn)題，目前臨床上常用母牛分枝桿菌制劑(微卡)應(yīng)用于初治、復(fù)治及耐藥結(jié)核病的輔助治療，效果顯著[5-6]，新的治療型結(jié)核疫苗已有多個(gè)處于臨床試驗(yàn)階段[7]。值得注意的是，免疫治療時(shí)，由于免疫制劑含有結(jié)核分枝桿菌(MTB)抗原，已感染個(gè)體再次接觸此類抗原有發(fā)生超敏反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)[8-10]。因此，常采用化療和免疫治療相結(jié)合的方式，一方面先通過(guò)化療抑制MTB，降低機(jī)體的免疫應(yīng)答，使之規(guī)避后續(xù)疫苗免疫時(shí)的潛在風(fēng)險(xiǎn)；另一方面，化療聯(lián)合免疫方案較單一的化療或免疫治療可獲得更好的效果[11-13]。

用于LTBI人群的重組結(jié)核新疫苗AEC/BC02是由重組MTB抗原Ag85b、早期分泌性抗原靶6(ESAT6)-培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP10)與復(fù)合佐劑系統(tǒng)BC02(即BCG-CpG-DNA+Al)構(gòu)成的，已獲得臨床批件。前期動(dòng)物研究表明，AEC/BC02疫苗在豚鼠潛伏感染模型上具有保護(hù)效果[14]，誘發(fā)MTB感染豚鼠產(chǎn)生超敏反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)較低[15]。本研究中，筆者對(duì)MTB感染豚鼠先進(jìn)行INH治療后，再采用AEC/BC02疫苗進(jìn)行免疫，評(píng)價(jià)化療和免疫治療相結(jié)合后豚鼠的肝、脾、肺臟器病變程度和脾、肺臟活菌載量，并與單一化療或單一免疫治療結(jié)果進(jìn)行比較，以期為AEC/BC02的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

材料和方法

一、材料

1. 動(dòng)物：無(wú)特定病原體(specific pathogen free, SPF)級(jí)Hartley豚鼠30只，雌雄各15只，每只體質(zhì)量250～350 g，由中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK(京)2011-0008。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中飼養(yǎng)于達(dá)到生物安全Ⅲ級(jí)的負(fù)壓動(dòng)物房。

2. AEC/BC02疫苗和INH：AEC/BC02疫苗由重組MTB蛋白Ag85b和ESAT6-CFP10融合蛋白與BC02佐劑系統(tǒng)構(gòu)成，1人份為(10 μg Ag85b+10 μg ESAT6-CFP10)/0.5 ml BC02，即每0.5 ml的BC02佐劑中含有10 μg Ag85b和10 μg ESAT6-CFP10；由安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司提供。INH購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。

3. 攻毒試驗(yàn)菌液：MTB(CMCC95052，中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心提供)接種于改良羅氏培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)約4周后收集，比濁后稀釋成1 mg/ml菌懸液，分裝后保存于-70 ℃冰箱[16]。

二、方法

1. 豚鼠感染：從-70 ℃冰箱取出MTB菌液，室溫融化后，用生理鹽水將濃度稀釋為2×103菌落形成單位(CFU)/ml，置冰浴中備用。在進(jìn)行攻毒試驗(yàn)時(shí)，在豚鼠腹股溝皮下注射0.5 ml，即每只豚鼠感染量為1.0×103CFU。

2. 動(dòng)物分組和免疫：30只豚鼠進(jìn)行攻毒試驗(yàn)1周后，以雌雄各50%的比例通過(guò)隨機(jī)數(shù)字表法分成4個(gè)組：(1)AEC/BC02組，6只，每只采用AEC/BC02疫苗1人份/針進(jìn)行肌肉免疫，共6針，每針間隔9～10 d；(2)INH組，6只，每只采用INH灌胃，10 mg/次進(jìn)行治療，每周3次，共2周；(3)INH+AEC/BC02組，6只，先采用INH灌胃治療2周后(用量同INH組)，再采用AEC/BC02疫苗進(jìn)行肌肉免疫(劑量和針次同AEC/BC02組)；(4)NS組，12只，按AEC/BC02組的免疫間隔和針次僅注射NS作為陰性對(duì)照。所有豚鼠在進(jìn)行攻毒試驗(yàn)后第10周解剖。

3. 臟器病變和細(xì)菌載量分析：感染后第10周，所有豚鼠處死解剖，先對(duì)肝臟、脾臟和肺臟分別進(jìn)行病變?cè)u(píng)分(表1)，總和為肝、脾、肺臟器的綜合病變?cè)u(píng)分；再剪取1/2的脾臟或肺臟置于研磨器中，加入3 ml生理鹽水研磨均勻。按0.5 ml脾、肺菌懸液︰4.5 ml生理鹽水的比例進(jìn)行10倍系列稀釋，根據(jù)臟器病變程度接種不同的稀釋度，每個(gè)稀釋度接種于改良羅氏培養(yǎng)基上，共計(jì)2支(0.1 ml/支)，37 ℃培養(yǎng)，4周后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

表1 豚鼠肝、脾、肺臟病變?cè)u(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(分)[17]

結(jié) 果

一、肝、脾、肺臟器病變分析

如圖1～4所示，各組豚鼠經(jīng)AEC/BC02、INH或INH+AEC/BC02不同方案免疫和(或)化療處理后，肝、脾、肺臟病變程度均有一定程度的減輕(圖1～3)，整體的臟器綜合病變?cè)u(píng)分分別為(36.7±28.2)、(20.0±12.7)和(3.3±5.2)分，與未治療的NS組[(69.2±24.5)分]進(jìn)行比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4，分別為q=4.37，P=0.023；q=6.61，P<0.001；q=8.85，P<0.001)。其中INH+AEC/BC02聯(lián)合治療的效果最好，綜合病變?cè)u(píng)分低于AEC/BC02，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=3.88，P=0.049)；也低于INH組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=1.94，P=0.527)。同時(shí)，病理組織切片分析顯示，各組豚鼠的肝臟、脾臟和肺臟均出現(xiàn)不同程度的以肉芽腫病灶為主的病理改變，病變程度由輕到重依次為INH+AEC/BC02組、INH組、AEC/BC02組和NS組。各組的肺部病理照片見(jiàn)圖5～8。

圖5～8 豚鼠肺臟病理組織切片分析(HE ×100)。圖5為NS組；圖6為AEC/BC02組；圖7為INH組；圖8為INH+AEC/BC02組。各組肺臟均出現(xiàn)不同程度的以肉芽腫病灶為主的病理變化，病變程度由輕到重依次為INH+AEC/BC02組、INH組、AEC/BC02組和NS組

注 一元方差分析后的Tukey多重比較檢驗(yàn)，a：P<0.05，b：P<0.01，c：P<0.001圖9, 10 脾臟、肺臟活菌載量計(jì)數(shù)

二、脾、肺臟活菌載量(圖9, 10)

豚鼠經(jīng)過(guò)治療后，INH+AEC/BC02組的脾臟活菌載量最低，為(1.06±1.64) lg CFU，與INH組的(3.55±1.90) lg CFU、AEC/BC02組的(4.21±0.78) lg CFU及NS組的(4.73±0.79) lg CFU比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別為q=4.84，P=0.011；q=6.12，P=0.001；q=8.23，P<0.001)，但I(xiàn)NH組、AEC/BC02組和NS組之間，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.12，P=0.146)。

在肺臟活菌載量方面，INH+AEC/BC02組為(0.69±1.07) lg CFU，與INH組的(2.66±1.70) lg CFU、AEC/BC02組的(3.01±0.90) lg CFU及NS組的(4.36±0.79) lg CFU比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別為q=4.43，P=0.021；q=5.21，P=0.006；q=9.50，P<0.001)；同時(shí)，INH組與NS組的差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=4.39，P=0.022)。

討 論

本研究在豚鼠模型上，將INH治療和結(jié)核疫苗AEC/BC02免疫相結(jié)合，與單一的INH治療或疫苗免疫比較，評(píng)價(jià)不同治療方式的治療效果。對(duì)于已感染MTB的豚鼠，抗生素治療?？善鸬搅⒏鸵?jiàn)影的效果。參照LTBI治療的臨床推薦劑量(10 mg·kg-1·d-1)[18]，本模型對(duì)感染豚鼠(按每只0.4 kg計(jì)算)灌胃INH劑量為每只每次10 mg，3次/周，但給藥療程并未采用臨床推薦的長(zhǎng)達(dá)24～36周的標(biāo)準(zhǔn)療程[18]。主要考慮感染動(dòng)物在長(zhǎng)時(shí)間的化療后，MTB可能徹底被清除或者長(zhǎng)期潛伏不能復(fù)發(fā)，將無(wú)法評(píng)估化療之后疫苗的免疫效果，因此，建立動(dòng)物模型時(shí)，采用縮短的療程更具有操作性[19-20]。

本研究中，豚鼠進(jìn)行攻毒試驗(yàn)后單獨(dú)使用INH治療2周即可減輕各臟器的病變，體現(xiàn)在單個(gè)臟器的病變?cè)u(píng)分及綜合評(píng)分上，與NS組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1～4)。但是，由于INH給藥時(shí)間過(guò)短，并不能完全清除MTB，在停藥后經(jīng)過(guò)長(zhǎng)達(dá)7周的恢復(fù)期，MTB又得以復(fù)發(fā)。因此，INH組豚鼠的脾臟和肺臟活菌載量的下降幅度并不大(圖9～10)，脾臟活菌數(shù)下降1.18 lg CFU(4.73 lg CFU-3.55 lg CFU)，肺臟活菌數(shù)下降1.70 lgCFU(4.36 lg CFU-2.66 lg CFU)，其中僅肺臟活菌數(shù)與NS組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與抗生素的作用機(jī)制不同，疫苗通過(guò)調(diào)動(dòng)肌體的免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用。但對(duì)已感染MTB的動(dòng)物，單純依靠疫苗免疫，即便可誘導(dǎo)出強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫和體液免疫，保護(hù)作用往往十分有限[21-22]。本研究中，單獨(dú)免疫AEC/BC02疫苗6針后，盡管豚鼠臟器綜合病變?cè)u(píng)分與NS組比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但單個(gè)臟器中，肝臟和脾臟的病變程度沒(méi)有明顯減輕，與NS組比較，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)臟器的活菌計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，AEC/BC02組脾臟活菌載量下降0.52 lg CFU(4.73 lg CFU-4.21 lg CFU)，肺臟活菌載量下降1.35 lg CFU(4.36 lg CFU-3.01 lg CFU)，與INH組和NS組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？傊瑥呐K器的外觀來(lái)看，INH和AEC/BC02疫苗均能明顯減輕臟器的病變程度，但脾臟活菌載量上，與NS組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但是在肺臟活菌計(jì)數(shù)結(jié)果上，INH組肺臟活菌計(jì)數(shù)與NS組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示INH治療效果略好于AEC/BC02免疫效果?？傮w上，本模型中單一藥物的治療方式產(chǎn)生的保護(hù)效果不夠充分。

為獲得更好的治療效果，將INH化療和AEC/BC02免疫相結(jié)合，結(jié)果顯示，豚鼠各臟器的病變進(jìn)一步減輕，INH+AEC/BC02組6只豚鼠中僅2只觀察到脾臟有輕微病變(圖2)，且脾、肺臟能分離出活菌，而其他4只豚鼠的肝、脾、肺臟無(wú)病變，且脾、肺臟均未分離出活菌。這意味著INH+AEC/BC02組發(fā)病率下降到(2/6)，而其他組豚鼠均全部發(fā)病(6/6或12/12)。與INH組和AEC/BC02組比較，INH+AEC/BC02組脾臟、肺臟活菌計(jì)數(shù)值急劇下降(圖9～10)，其中，脾臟活菌數(shù)下降幅度分別達(dá)到2.49 lg CFU(3.55 lg CFU-1.06 lg CFU)和3.15 lg CFU(4.21 lg CFU-1.06 lg CFU)，肺臟活菌數(shù)下降幅度分別達(dá)到1.97 lg CFU(2.66 lg CFU-0.69 lg CFU)和2.32 lg CFU(3.01 lg CFU-0.69 lg CFU)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組織病理檢查也顯示，INH+AEC/BC02組臟器的病變程度最輕。這些結(jié)果表明，INH和AEC/BC02疫苗聯(lián)合使用明顯提高了對(duì)豚鼠的保護(hù)作用，能減輕豚鼠臟器病變，降低脾臟和肺臟的活菌載量。

目前抗結(jié)核藥物仍是臨床上治療結(jié)核病和LTBI 的首選藥物，但隨著耐藥和廣泛耐藥結(jié)核病患者的增多，化療和疫苗免疫相結(jié)合不啻為解決目前單一化療模式困境的新方法[7, 23-24]。先用抗結(jié)核藥物殺滅絕大多數(shù)活躍的MTB，減輕病變部位的炎癥反應(yīng)；再進(jìn)行疫苗免疫治療，誘發(fā)超敏反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)較低[13]，同時(shí)可激發(fā)免疫系統(tǒng)，清除殘余的MTB；兩者結(jié)合，期望達(dá)到徹底清除MTB的目的。本研究用豚鼠模型證實(shí)INH和AEC/BC02聯(lián)合使用優(yōu)于單一治療方式，為重組結(jié)核病疫苗AEC/BC02預(yù)防LTBI的臨床研究提供了新思路。

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(本文編輯：郭萌)

Therapeutic evaluation of isoniazid in combination with recombinant tuberculosis vaccine AEC/BC02 in guinea pigs infected withMycobacteriumtuberculosis

LUJin-biao,SHENXiao-bing,SUCheng,YANGLei,DUWei-xin,WANGGuo-zhi,CHENBao-wen.

DivisionofTuberculosisVaccines,NationalInstitutesforFoodandDrugControl,KeyLaboratoryoftheMinistryofHealthforResearchonQualityandStandardizationofBiotechProducts,Beijing100050,China

CHENBao-wen,Email:bwnchen@126.com

Objective To evaluate the therapeutic effect of isoniazid combined with recombinant tuberculosis vaccine AEC/BC02 inMycobacteriumtuberculosis(MTB) infected guinea pigs. Methods Thirty guinea pigs challenged subcutaneously with 1000 CFU of MTB were divided into four groups one week later according to different treatment methods: normal saline (NS), AEC/BC02 vaccine, isoniazid (INH), and INH+AEC/BC02. In AEC/BC02 group, the animals were intramuscularly immunized with the single dose of AEC/BC02 vaccine six times at 10-day intervals. In INH group, each animal was treated with 10 mg isoniazid by oral gavage three times a week for 2 weeks. In INH+AEC/BC02 group, the guinea pigs firstly received INH treatment and then vaccinated with AEC/BC02 vaccine as the same dose and frequency as the INH group and AEC/BC02 group. NS group only received six doses of normal saline as a negative control. At ten weeks after infection, all guinea pigs were killed for necropsy. The liver, spleen and lung lesion indexes of guinea pig were scored to evaluate the organ lesions, and then tissue suspensions were cultured and calculated the bacterial loads (lg CFU). Results The gross pathological scores in AEC/BC02 group, INH group and INH+AEC/BC02 group were (36.7±28.2), (20.0±12.7) and (3.3±5.2) respectively, and significantly lower than that in NS group (69.2±24.5) (q=4.37，P=0.023；q=6.61，P<0.001；q=8.85，P<0.001, respectively). There was also a significant difference between AEC/BC02 group and INH+AEC/BC02 group (q=3.88，P=0.049). The spleen bacterial load in INH+AEC/BC02 group was (1.06±1.64) lg CFU and significantly lower than INH group ((3.55±1.90) lg CFU), AEC/BC02 group ((4.21±0.78) lg CFU) and NS group ((4.73±0.79) lg CFU)(q=4.84，P=0.011；q=6.12，P=0.001；q=8.23，P<0.001, respectively). There was significant difference among INH group, AEC/BC02 group and NS group. The lung bacterial load in INH+AEC/BC02 group was (0.69±1.07) lg CFU and significantly lower than INH group ((2.66±1.70) lg CFU), AEC/BC02 group ((3.01±0.90) lg CFU) and NS group ((4.36±0.79) lg CFU)(q=4.43，P=0.021；q=5.21，P=0.006；q=9.50，P<0.001, respectively). Also the significant difference was observed between INH group and NS group (q=4.39，P=0.022). Conclusion INH in combination with AEC/BC02 vaccine was superior to single isoniazid or AEC/BC02 treatment, could reduced the organ lesions and lowered the bacterial loads in spleens and lungs.

Mycobacteriumtuberculosis; Isoniazid; Vaccines, synthetic; Drug therapy, combination; Disease models, animal; Comparative study

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.02.004

“十二五”國(guó)家科技重大專項(xiàng)(2012ZX10004701)

100050北京，中國(guó)食品藥品檢定研究院結(jié)核病疫苗室 衛(wèi)生部生物技術(shù)產(chǎn)品檢定方法及其標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

陳保文，Email：bwnchen@126.com

2016-11-24)