趙 丹，姚 浩，蔡雪薛，孔蘇偉，惲 茜，談衛(wèi)軍，潘志明，殷月蘭，焦新安

4b型單核細(xì)胞增生李斯特菌內(nèi)化素基因NTSN_0462的功能初探

趙 丹，姚 浩，蔡雪薛，孔蘇偉，惲 茜，談衛(wèi)軍，潘志明，殷月蘭，焦新安

目的 單核細(xì)胞增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes，Lm)對宿主的粘附、侵襲作用與其多種內(nèi)化素蛋白密切相關(guān)。本研究以4b型菌株LmNTSN的內(nèi)化素基因NTSN_0462為研究對象，初步探究其致病作用。方法 利用同源重組技術(shù)構(gòu)建該基因缺失的突變株，研究0462基因?qū)TSN在生長、細(xì)胞侵襲和體內(nèi)定植中的作用。人結(jié)腸腺癌細(xì)胞Caco-2、人肝癌細(xì)胞HepG2的侵襲率，以及BALB/c小鼠體內(nèi)肝、脾臟中定植能力的差異。結(jié)果 缺失株的生長曲線結(jié)果顯示，NTSN_0462基因?qū)m在BHI培養(yǎng)基中的生長及代謝未造成明顯影響。以人結(jié)腸腺癌細(xì)胞Caco-2、人肝癌細(xì)胞HepG2進(jìn)行的體外試驗表明，缺失株的侵襲能力低于野生株(P<0.001)。以BALB/c小鼠進(jìn)行的體內(nèi)試驗顯示，缺失株在肝臟中定殖的能力顯著低于野生株(P<0.001)，在脾臟中無統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論NTSN_0462基因在LmNTSN入侵肝臟和定植中發(fā)揮重要作用，是侵襲相關(guān)的重要毒力因子。

單核細(xì)胞增生李斯特菌；NTSN_0462；血清型4b；內(nèi)化素

單核細(xì)胞增生性李斯特菌是一種兼性胞內(nèi)寄生菌，其感染的宿主范圍較廣，可引發(fā)人和多種動物的李斯特菌病。作為食源性病原菌，Lm主要通過污染的食物進(jìn)入腸道繼而引發(fā)宿主的感染，感染后的臨床癥狀主要表現(xiàn)為胃腸炎、腦膜炎、腦炎、流產(chǎn)等。新生兒、孕婦、老年人以及免疫功能缺陷者較容易感染Lm，對于人類致死率高達(dá)20%～30%[1-3]。20世紀(jì)90年代，Lm已被WHO世界衛(wèi)生組織列為食品中的四大致病菌之一。

在導(dǎo)致宿主食源性感染過程中，Lm可以依賴其特有的表面蛋白侵入宿主非吞噬細(xì)胞，進(jìn)而突破宿主腸道屏障、血胎屏障和血腦屏障。內(nèi)化素家族蛋白是一類含有亮氨酸重復(fù)區(qū)域(LRRs)序列的表面蛋白，在Lm入侵宿主非吞噬細(xì)胞過程中發(fā)揮重要的作用[5]。依據(jù)內(nèi)化素蛋白的一級結(jié)構(gòu)，可以將其分為3類：含有LPXTG結(jié)構(gòu)的內(nèi)化素，含有GW/WxL結(jié)構(gòu)的內(nèi)化素和分泌型內(nèi)化素。其中含有LPXTG結(jié)構(gòu)的內(nèi)化素的C末端LPXTG結(jié)構(gòu)可以被轉(zhuǎn)肽酶A(StrA)識別，并以共價鍵的方式結(jié)合于細(xì)胞壁磷壁酸；而GW結(jié)構(gòu)是以甘氨酸和色氨酸為起始的含80個氨基酸序列的重復(fù)結(jié)構(gòu)，WxL區(qū)域與GW結(jié)構(gòu)類似，均通過非共價鍵的方式與磷壁酸結(jié)合，將蛋白錨定于細(xì)菌細(xì)胞壁表面[5]。

內(nèi)化素InlB蛋白由630個氨基酸序列組成，其一級結(jié)構(gòu)包括信號肽序列、7個LRRs序列、IR序列、B重復(fù)序列和3個GW序列，是含有GW/WxL結(jié)構(gòu)的典型內(nèi)化素蛋白。Bielecki的研究表明，inlA和inlB基因均由Lm毒力島Ⅱ(LIPI-Ⅱ)編碼，LIPI-Ⅱ主要介導(dǎo)Lm對宿主非吞噬細(xì)胞的粘附侵襲作用，InlA蛋白與細(xì)胞表面受體E-鈣粘蛋白(E-cad)的相互作用介導(dǎo)Lm對上皮細(xì)胞的侵襲作用[2,4]。InlB蛋白主要有3種受體：補(bǔ)體分子受體(gC1qR)、肝細(xì)胞生長因子受體(Met)和葡糖氨基聚糖類(GAGs)，其中Met為InlB蛋白的主要受體[5]。NTSN_0462基因是具有GW結(jié)構(gòu)的內(nèi)化素蛋白，為了研究該蛋白的功能，本研究以從暴發(fā)李斯特菌病的綿羊腦內(nèi)分離株LmNTSN為親本株，通過同源重組的方法構(gòu)建了NTSN_0462的缺失突變株，并對其生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，為今后4b型Lm致病機(jī)理的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α、血清型4b的綿羊腦分離株LmNTSN、穿梭載體pKSV7均由本實驗室保存，pGEM-T載體購自大連寶生物工程(TaKaRa)有限公司。

1.1.2 實驗動物和細(xì)胞 6周齡雌性BALB/c小鼠購自北京維通利華公司。人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系Caco-2由本實驗室保存，人肝癌細(xì)胞系HepG2購自上海博古科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 試劑BHI培養(yǎng)基(BactoTM Brain Heart Infusion)購自BD公司。

1.1.4 主要試劑和儀器 細(xì)菌基因組DNA抽提純化試劑盒、質(zhì)粒DNA抽提試劑盒購自北京天根生物科技有限公司，DNA純化回收試劑盒、DNA聚合酶、高保真DNA聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶(SalⅠ、KpnⅠ)、DL2000 DNA Marker、λ-14 DNA Marker、T4連接酶、氨芐青霉素(Amp)均購自大連寶生物工程(TaKaRa)有限公司，氯霉素購自生工生物工程公司，PCR擴(kuò)增儀、凝膠成像系統(tǒng)購自Bio-RAD公司，離心機(jī)、電轉(zhuǎn)化儀、Biophotometer分光光度計購自德國Eppendorf公司，恒溫CO2培養(yǎng)箱購自Thermo公司。

1.1.5 引物 從NTSN全基因組中獲得NTSN_0462基因及其上下游序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計其上游片段引物P1和P2，引物之間跨度為500 bp；設(shè)計其下游片段引物P3和P4，引物之間的跨度為700 bp。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，引物序列如表1所示。

表1 目的基因引物序列
Tab.1 Primers sequences of target genes

PrimersSequence(5'-3')SizeofPCRproduct(bp)DigestionsiteP1GCGTCGACATCAAAT-CATTGCGAATAAT-AGTG500SalⅠP2GAAATAGCTTTTCG-TAGGTTGATGATTAAT-AGATTTP3TCTGAATAAATCTAT-TAATCATCAACCTAC-GAAAAGCTATTTC700P4CACGGTACCATTTA-AACCACTCCTTCAKpnⅠPP1CTATTATTTTTAGTT-TATGG1577PP2TTCCTACGAATGCTT-GCTT

1.2LmNTSNΔ0462缺失突變株的構(gòu)建

1.2.1 目的基因的制備 收集LmNTSN過夜培養(yǎng)物，利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取NTSN基因組。以得到的基因組為模板，以P1、P2為引物合成NTSN_0462基因上游片段bu；以P3、P4為引物合成NTSN_0462基因下游片段bd。PCR擴(kuò)增體系：10×PCR buffer 5 μL；dNTP 4 μL；DNA 模板2 μL；P1/P2 1 μL；P3/P4 1 μL；高保真酶0.5 μL；SW 36.5 μL。PCR擴(kuò)增條件：Tm為55 ℃，30個循環(huán)。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳回收，以回收產(chǎn)物為模板，以P1、P4 為引物，經(jīng)SOEing PCR 合成融合基因片段bu/bd。

融合片段bu/bd經(jīng)DNA純化回收試劑盒純化后與pGEM-T載體相連，熱擊法轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α宿主菌中，經(jīng)過藍(lán)白斑篩選，挑取白色菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，PCR體系如前所述，驗證正確后進(jìn)行SalⅠ和KpnⅠ的雙酶切鑒定。將初步鑒定為陽性的克隆pGEM-T-bu/bd送南京金斯瑞生物科技有限公司測序，測序結(jié)果通過NCBI中的BLAST進(jìn)行比對分析，取比對正確的陽性克隆進(jìn)行保存，并作為下一步構(gòu)建的實驗材料。

1.2.2 目的基因與pKSV7載體的連接 取測序正確的陽性克隆提取質(zhì)粒，經(jīng)SalⅠ、KpnⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)DNA純化回收試劑盒回收，穿梭載體pKSV7經(jīng)同樣的方法處理。對回收后的載體片段和目的基因在T4連接酶作用下于16 ℃恒溫器中過夜連接。次日，連接產(chǎn)物通過熱擊法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coliDH5α感受態(tài)中。通過PCR和雙酶切法鑒定重組質(zhì)粒，將鑒定正確的質(zhì)粒送南京金斯瑞生物科技有限公司測序，并將測序正確的質(zhì)粒命名為pKSV7-bu/bd。

1.2.3LmNTSNΔ0462的構(gòu)建及鑒定 挑取測序正確的pKSV7-bu/bd質(zhì)粒，采用電轉(zhuǎn)化的方法(2 100 V)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至LmNTSN感受態(tài)中，電轉(zhuǎn)化涂布于氯霉素(Cm+)抗性(10 μg/mL)BHI平板，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。挑取菌落進(jìn)行PCR鑒定，鑒定正確的菌株即為陽性克隆。將獲得的陽性克隆在溫度(42 ℃)及氯霉素抗性(10 μg/mL)雙重壓力下傳至14代，使目的片段與細(xì)菌基因組發(fā)生同源重組，將同源重組成功的細(xì)菌在30 ℃無抗性壓力下脫去抗性載體，獲得在氯霉素(10 μg/mL)抗性平板上無法生長而在無抗BHI平板上正常生長的細(xì)菌。以NTSN_0462基因上下游臂外圍引物PP1、PP2為引物，對獲得的菌株進(jìn)行PCR鑒定，PCR擴(kuò)增序列送南京金斯瑞生物科技有限公司測序，測序結(jié)果經(jīng)BLAST比對，將鑒定正確的細(xì)菌命名為LmNTSNΔ0462。

1.3 細(xì)菌生長曲線的測定 將Lm菌株NTSN、NTSNΔ0462分別接種到新鮮BHI培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，次日取1 mL菌液，12 000 r/min 室溫離心2 min。經(jīng)PBS重懸，測定細(xì)菌的OD600值，將細(xì)菌分別轉(zhuǎn)接到含有10 mL BHI 培養(yǎng)基的小錐形瓶中，每組細(xì)菌設(shè)立3個平行重復(fù)，并使其初始OD600值為0.05，放于37 ℃搖床培養(yǎng)，間隔1 h 測定1次各瓶的OD600值并做相應(yīng)記錄。

1.4 細(xì)胞侵襲實驗 對生長狀態(tài)良好的Caco-2或HepG2細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，同時換用無抗DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)1 h。按細(xì)菌與細(xì)胞的數(shù)量比(MOI)=20加入新鮮培養(yǎng)的NTSN、NTSNΔ0462菌株繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，細(xì)胞用無菌PBS洗3次，加入含100 mg/mL硫酸慶大霉素的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 h。PBS洗3次，加入1 mL 0.2% Triton X-100裂解細(xì)胞8 min，釋放細(xì)菌，用無菌PBS稀釋裂解液，涂布與BHI平板，置于37 ℃溫箱培養(yǎng)20 h后菌落計數(shù)，每組設(shè)置3個重復(fù)。

1.5Lm對BALB/c小鼠的腹腔感染實驗 挑單菌落接種于BHI液體培養(yǎng)中，于37 ℃、180 r/min過夜培養(yǎng)，次日將種子液按1∶50的比例重新接種于新鮮的BHI培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min振搖培養(yǎng)3 h，經(jīng)無菌PBS洗滌2次后，調(diào)整細(xì)菌OD600值至0.8。將6周齡BALB/c雌性小鼠隨機(jī)分為2，每組5只，腹腔注射免疫。每只小鼠的注射劑量為100 μL，1×104CFU細(xì)菌/只，同時將細(xì)菌適度稀釋后涂布BHI平板，菌落計數(shù)。72 h后，分析小鼠肝臟和脾臟中的細(xì)菌載量，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié) 果

2.1LmNTSNΔ0462缺失株的構(gòu)建

2.1.1 目的基因的制備 通過PCR的方法擴(kuò)增出NTSN_0462基因上下游片段bu、bd，片段大小分別為500 bp、700 bp。對這兩個DNA片段進(jìn)行SOEing PCR，擴(kuò)增出一條為1 200 bp的特異性條帶。純化回收，與pGEM-T載體16 ℃過夜連接后轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)中。通過雙酶切方法驗證，目的基因條帶大小為1 200 bp，載體條帶大小約為3 000 bp，結(jié)果正確。將酶切鑒定正確的克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司測序，對測序結(jié)果進(jìn)行比對分析，結(jié)果表明bu/bd融合片段與pGEM-T載體正確連接。

2.1.2 目的基因與pKSV7載體的連接 雙酶切顯示目的基因條帶大小為1 200 bp，載體條帶大小為6 900 bp，結(jié)果正確。將酶切鑒定正確的質(zhì)粒送南京金斯瑞生物科技有限公司測序，對測序結(jié)果進(jìn)行比對分析，表明bu/bd融合片段與pKSV7載體正確連接。

2.1.3LmNTSNΔ0462的構(gòu)建及鑒定 取測序正確的的重組質(zhì)粒pKSV7-bu/bd電轉(zhuǎn)化至NTSN感受態(tài)中。PCR鑒定轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。取PCR結(jié)果為陽性的克隆在溫度和氯霉素抗性雙重選擇壓力下傳至14代，使目的片段與細(xì)菌基因組之間發(fā)生同源重組。將同源重組成功的細(xì)菌在30 ℃無抗性壓力下脫去抗性載體，獲得在氯霉素(10 μg/mL)的抗性平板上無法生長，在無抗BHI平板可正常生長的菌株。對獲得的細(xì)菌進(jìn)行PCR驗證，結(jié)果如圖1所示，在1 200 bp處有一條清晰的目的條帶。再以外側(cè)引物PP1、PP2 PCR鑒定獲得的細(xì)菌，如圖2所示，缺失株擴(kuò)增的目的條帶大小為1 577 bp，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送南京金斯瑞生物科技有限公司測序，對測序結(jié)果進(jìn)行比對分析，結(jié)果表明LmNTSN的inlB基因已成功缺失。

M: DL2000 DNA marker;1-2: PCR product of NTSN-pKSV7-bu/bd.圖1 重組菌的PCR篩選Fig.1 Result of mutant strains identified by PCR

M: λ-14 DNA marker;1-2: PCR product of NTSN Δ0462;3: PCR product of NTSN圖2 突變株的鑒定圖Fig.2 Identification of mutant strains by PCR

2.2 細(xì)菌生長曲線的測定Lm的生長曲線如圖3所示，NTSN和NTSNΔ0462的生長趨勢基本一致：37 ℃培養(yǎng)環(huán)境中，6 h內(nèi)細(xì)菌呈指數(shù)形式增長，6 h后，細(xì)菌增殖進(jìn)入平穩(wěn)期。這表明NTSN_0462基因的缺失未對細(xì)菌生長造成明顯的影響。

圖3 細(xì)菌生長曲線的測定Fig.3 The growth curve of Lm at 37 ℃

2.3 細(xì)胞侵襲實驗 本研究通過相對侵襲率直觀地顯示出野生株與缺失株對Caco-2以及HepG2細(xì)胞侵襲的差別。結(jié)果如圖4，圖5所示，NTSNΔ0462對Caco-2和HepG2的侵襲率低于野生株(P<0.001)，表明NTSN_0462基因在Lm對Caco-2和HepG2細(xì)胞侵襲過程中發(fā)揮重要作用。

圖4 Lm對Caco-2細(xì)胞系的侵襲Fig.4 Invasion of Lm into Caco-2 cell line

圖5 Lm對HepG2細(xì)胞系的侵襲Fig.5 Invasion of Lm into HepG2 cell line

2.4Lm對BALB/c小鼠的腹腔感染實驗 用NTSN和NTSNΔ0462分別腹腔感染BALB/c小鼠，感染劑量為0.1 LD50，即1×104CFU/只。感染72 h后分析野生株與缺失株在小鼠脾臟、肝臟中的細(xì)菌載量。結(jié)果如圖6所示，NTSNΔ0462缺失株在肝臟中的分離率低于野生株(P<0.01)，在脾臟中則沒有明顯變化，結(jié)果表明NTSN_0462基因的缺失導(dǎo)致Lm對小鼠致病力明顯下降。

圖6 Lm腹腔感染小鼠后組織中的載菌量Fig.6 Bacterial counts in organ homogenates of mice at 72 h i.p. Infected with Lm

3 討 論

單核細(xì)胞增生性李斯特菌為食源性兼性胞內(nèi)寄生菌，通過污染的食物進(jìn)入腸道，在其毒力因子作用下突破宿主的腸道屏障、胎盤屏障和血腦屏障進(jìn)行擴(kuò)散和傳播，從而引發(fā)人和40多種動物的感染，具有較高的死亡率[1]。在Lm的致病作用中，內(nèi)化素蛋白家族(Internalins)是介導(dǎo)該菌粘附與入侵宿主細(xì)胞的主要因子，在其致病力方面發(fā)揮著重要的作用。NTSN菌株中共有26個內(nèi)化素家族蛋白，本研究以LmNTSN_0462基因為研究對象，對其致病作用進(jìn)行了初步的探討。

InlB是內(nèi)化素家族中含有GW/WxL結(jié)構(gòu)的典型內(nèi)化素蛋白，目前對該蛋白的研究主要基于血清型1/2a的EGDe菌株開展的，NTSN與該模式菌株InlB蛋白的同源性雖然達(dá)到94%，但在該蛋白的多個LRR結(jié)構(gòu)域、B重復(fù)區(qū)和GW重復(fù)區(qū)共存在28個氨基酸的明顯差異，為此，本研究利用同源重組的方法成功構(gòu)建了NTSNΔ0462缺失株，在對缺失株和野生株體內(nèi)外感染特性進(jìn)行研究的基礎(chǔ)上，探究4b型菌株含有GW結(jié)構(gòu)的內(nèi)化素蛋白的功能。

在造成宿主食源性感染過程中，Lm可依賴其表面蛋白入侵宿主的巨噬細(xì)胞及多種非吞噬細(xì)胞，并在胞內(nèi)存活和增殖[6-9]。內(nèi)化素蛋白作為細(xì)菌表面蛋白，與Lm粘附侵襲非吞噬細(xì)胞的過程密切相關(guān)[10-13]。本研究中以人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系Caco-2和人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞系為研究材料，對NTSNΔ0462的粘附侵襲特性進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，與親本株相比，NTSNΔ0462缺失突變株對Caco-2細(xì)胞系的侵襲率降低了78%，對HepG2細(xì)胞系的侵襲率則降低了98%。缺失突變株對兩株細(xì)胞系的侵襲率均低于野生株，表明NTSN_0462編碼蛋白在LmNTSN侵入上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞時均發(fā)揮內(nèi)化作用，但在入侵肝細(xì)胞時的內(nèi)化作用更為明顯。

內(nèi)化素蛋白InlA、InlB的作用受體具有種屬特異性，InlA蛋白不能識別小鼠的細(xì)胞表面受體E-鈣粘蛋白(E-cad)，卻可以作用于人、豚鼠和兔子的E-cad；而InlB蛋白與肝細(xì)胞生長因子受體(Met)的相互作用則正好與之相反[14-15]。本研究選用BALB/c小鼠作為研究模型，選擇腹腔注射途徑，對NTSNΔ0462缺失突變株和親本株體內(nèi)感染特性進(jìn)行了測定，結(jié)果顯示缺失突變株在小鼠肝臟中的細(xì)菌載量低于野生株，提示NTSN_0462基因在NTSN侵入肝臟進(jìn)行定植中發(fā)揮重要作用，與體外侵襲試驗的結(jié)果一致，表明該基因參與了NTSN的體內(nèi)致病作用。

本研究成功構(gòu)建了單核細(xì)胞增生李斯特菌NTSN_0462基因缺失突變株，并對缺失株的生長、代謝、對細(xì)胞的侵襲以及對小鼠的毒力進(jìn)行了研究，表明該內(nèi)化素基因在Lm侵襲Caco-2和HepG2細(xì)胞系及小鼠肝臟定植中發(fā)揮重要作用，是NTSN菌株的重要致病因子，也為揭示NTSN_0462編碼蛋白在Lm感染過程中作用機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。

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Function of an internalin geneNTSN_0462 inListeriamonocytognesserotype 4b

ZHAO Dan, YAO Hao, CAI Xue-xue, KONG Su-wei, YUN-Xi, TAN Wei-jun, PAN Zhi-ming, YIN Yue-lan, JIAO Xin-an

(JiangsuCo-InnovationCenterforPreventionandControlofImportantAnimalInfectiousDiseaseandZoonoses,JiangsuKeyLaboratoryofZoonosis,YangzhouUniversity,JointInternationalResearchLaboratoryofAgricultureAgri-ProductSafety,Yangzhou225009,China)

Internalins play a key role in the adhesion and invasion ofL.monocytogenesinto host cells. In this study, the function of internalin geneNTSN_0462 in serotype 4bLmNTSN was probed into. Firstly,NTSN_0462 was knocked out by homology recombination, then the pathogenic characterization of mutant strainLmNTSNΔ0462 was investigatedinvivoandinvitro. The growth curve showed that the deletion ofNTSN_0462 gene didn't affect growth and metabolism ofLmin BHI medium. The invasion of the mutant strain into human intestinal epithelial cell line Caco-2 and human hepatocyte cell line HepG2 significantly reduced comparing with the WT strains (P<0.001). Furthermore, the infection ability to BALB/c mouse was analyzedinvivo, compared with the WT strains, the colonization ofLmNTSNΔ0462 in liver decreased significantly (P<0.001), wheareas there was no significant difference in the spleen, indicating thatNTSN_0462 plays an important role in the invasion and multiplication in host livers, heretofore it is an invasion-related virulent factor ofL.monocytogenes.

Listeriamonocytogenes;NTSN_0462; serotype 4; internalin

Yin Yue-lan, Email: yylan@yzu.edu.cn

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.02.005

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R378

A

1002-2694(2017)02-0115-05

2016-09-26 編輯：劉岱偉

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