馮 杰 王振華 潘康成*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，成都 611130；2.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，成都 611130)

枯草芽孢桿菌芽孢表面展示外源功能蛋白的應(yīng)用

馮 杰1王振華2潘康成1*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，成都 611130；2.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，成都 611130)

枯草芽孢桿菌是一種好氧的可直接用于人和動(dòng)物的益生菌菌種，在不利條件下可以被誘導(dǎo)產(chǎn)生芽孢。芽孢具有特殊的構(gòu)造及獨(dú)特的生理特征，研究者們發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌芽孢是酶和免疫原等外源性功能蛋白的理想的錨定載體，以枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白作為分子載體，直接利用芽孢吸附作用和共價(jià)固定等方法使外源蛋白錨定在芽孢表面。目前已有多種酶蛋白、抗原蛋白和其他功能蛋白成功展示在枯草芽孢桿菌芽孢表面。本文主要對(duì)枯草芽孢桿菌芽孢結(jié)構(gòu)及芽孢表面展示外源蛋白技術(shù)的策略和應(yīng)用前景進(jìn)行闡述。

枯草芽孢桿菌；芽孢表面展示；共價(jià)固定；載體

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性菌，因其益生特性及芽孢良好的抗逆性而備受研究者青睞。芽孢表面展示技術(shù)是利用芽孢特殊的構(gòu)造，采用一定的策略將外源性功能蛋白錨定在芽孢表面，使該蛋白發(fā)揮更佳的功能及穩(wěn)定性。Isticato等[1]首次利用芽孢衣蛋白CotB作為錨定蛋白，將破傷風(fēng)毒素的C片段(TTFC)成功地展示在芽孢表面。芽孢表面展示技術(shù)憑借其操作簡(jiǎn)單、重組芽孢的穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，現(xiàn)已成功地應(yīng)用于黏膜疫苗、生物催化、生物降解和診斷工具等多個(gè)領(lǐng)域?？莶菅挎邨U菌芽孢表面展示技術(shù)現(xiàn)在逐漸發(fā)展為以基因重組和非基因重組2種錨定方式的表面展示策略[2]。基因重組方式是以芽孢衣蛋白如CotB、CotC、CotE、CotG、CotZ和OxdD等作為錨定蛋白，將外源蛋白與芽孢衣蛋白進(jìn)行融合表達(dá)展示在芽孢表面[1,3-7]；非基因重組方式是利用芽孢與外源蛋白的吸附作用或使用交聯(lián)劑如戊二醛等將外源蛋白錨定在芽孢表面[8-9]。

1 芽孢的形成及結(jié)構(gòu)

1.1芽孢形成

枯草芽孢桿菌在遭受不利條件下，經(jīng)過一系列時(shí)序性和空間性的基因表達(dá)，最后形成圓形或橢圓形的休眠體——芽孢，以抵御不良環(huán)境?？莶菅挎邨U菌營養(yǎng)性細(xì)胞形成芽孢與一系列反饋和前饋反應(yīng)密切相關(guān)[10]。外界環(huán)境通過激活內(nèi)部磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，影響關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄蛋白Spo0A的磷酸化水平來調(diào)控營養(yǎng)性細(xì)胞向芽孢化轉(zhuǎn)變。Spo0A蛋白低水平的磷酸化促進(jìn)生物膜形成；高水平的磷酸化啟動(dòng)芽孢化過程[11]。細(xì)菌一旦選擇啟動(dòng)進(jìn)入芽孢化，在經(jīng)過一個(gè)耗時(shí)、高耗能和不可逆的過程后，最后在子代水平形成芽孢。

芽孢化過程大致分為以下幾個(gè)階段[10]。首先，營養(yǎng)性細(xì)胞在環(huán)境壓力下選擇啟動(dòng)進(jìn)入芽孢化，復(fù)制后的染色質(zhì)分別通過RacA蛋白錨定在細(xì)胞兩極。然后，隔膜將細(xì)胞分裂為不對(duì)稱的前芽孢和母細(xì)胞，隨后σF和σE因子分別在前芽孢和母細(xì)胞中被激活；激活后的σF和σE因子調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，使前芽孢被母細(xì)胞“吞沒”，成為被2層膜——細(xì)菌細(xì)胞壁和薄層肽聚糖包裹的結(jié)構(gòu)，并且還激活前芽孢和母細(xì)胞中σG和σK因子。母細(xì)胞參與調(diào)控前芽孢皮層和芽孢衣各層的合成與組裝，最后，母細(xì)胞在自溶酶的作用下裂解并釋放出成熟的芽孢。

1.2芽孢結(jié)構(gòu)

芽孢是一種抗逆性極強(qiáng)的休眠體，在抵抗輻射、高溫和化學(xué)物質(zhì)等方面十分突出?？莶輻U菌芽孢從內(nèi)向外依次由核心、皮層和芽孢衣組成。核心包含細(xì)菌基因組DNA及相關(guān)蛋白，含水量極低，脫去的水分由2,6-吡啶二羧酸(pyridine-2,6-dicarboxylic acid，DPA)替代，基因組DNA與α/β型的小型的酸溶性孢子蛋白(small, acid soluble spore proteins，SASP)結(jié)合。SASP對(duì)休眠期芽孢抵抗外界刺激(如濕熱、干燥和過氧化氫等對(duì)基因組DNA的損傷)和避免芽孢死亡具有重要作用[12]。DPA在芽孢抵抗紫外線、維持核心脫水狀態(tài)、芽孢的休眠狀態(tài)和萌發(fā)過程都具有重要作用[13-14]。皮層是由前芽孢內(nèi)外孢子膜間特殊的肽聚糖組成，使芽孢能夠抵抗高溫和干燥。芽孢衣由里到外依次為基層、內(nèi)衣殼蛋白、外衣殼蛋白和皮質(zhì)4層蛋白層，由70多種蛋白組成，是芽孢的第1道屏障。芽孢衣的組裝被認(rèn)為是從SpoⅤM蛋白與前芽孢外孢子膜表面相互作用開始的。SpoⅤM蛋白是一種由26個(gè)氨基酸組成的α螺旋的兩親性蛋白，長(zhǎng)度不超過4 nm，SpoⅤM蛋白通過與SpoIⅤA蛋白和前芽孢外孢子膜的相互作用，然后將SpoIⅤA蛋白錨定在前芽孢外孢子膜表面[15]。Ramamurthi等[16-17]研究認(rèn)為，SpoⅤM蛋白的長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)與前芽孢外孢子膜的凸面結(jié)構(gòu)對(duì)引導(dǎo)SpoIⅤA蛋白正確錨定在外孢子膜表面具有重要作用。

芽孢形態(tài)發(fā)生蛋白是一類與芽孢在各層組裝過程中發(fā)揮主要功能但不影響母細(xì)胞中基因表達(dá)的蛋白，芽孢衣能正確組裝很大程度上依賴于各層芽孢形態(tài)發(fā)生蛋白的正確表達(dá)，如SpoIⅤA突變株雖然能在前芽孢外組裝衣殼蛋白層，但是蛋白層只能以游離的形式存在，而不能錨定在前芽孢外孢子膜表面；SpoⅤM突變株的衣殼只能部分并且混亂的錨定在前芽孢表面；safA、cotE分別是內(nèi)、外衣殼衣殼蛋白層組裝所必需的[18]。

2 芽孢表面展示技術(shù)策略

2.1基因重組

基因重組的芽孢表面展示外源蛋白的策略主要基于外源DNA與衣殼蛋白DNA的基因融合。工程菌在形成芽孢時(shí)，外源蛋白隨著衣殼蛋白的表達(dá)而表達(dá)，最后融合蛋白通過衣殼蛋白錨定在芽孢表面，并且不會(huì)影響芽孢結(jié)構(gòu)和功能[19]。芽孢表面展示策略根據(jù)融合基因重組方式可分為游離型和整合型。游離型是將載有融合基因的重組質(zhì)粒導(dǎo)入宿主，進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)；整合型是在融合基因的兩端加上同源臂，線性化的質(zhì)粒載體將融合基因以雙交換的方式整合到宿主基因組上，進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)。游離型重組方式操作簡(jiǎn)便，但是具有重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性特點(diǎn)，而整合型重組方式具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

用于芽孢表面展示的游離型重組方式的質(zhì)粒載體大多是由來自于桿菌屬的質(zhì)粒與大腸桿菌pBR322或其衍生質(zhì)粒構(gòu)成的嵌合質(zhì)粒載體，如pHP13、pHPS9、pCSK1和pLJ7等[20-21]。大多數(shù)游離型質(zhì)粒載體都是以衣殼蛋白啟動(dòng)子作為穿梭質(zhì)粒中融合蛋白的啟動(dòng)子，在芽孢形成時(shí)被激活，表達(dá)融合蛋白，最后通過衣殼蛋白錨定在芽孢表面。Nguyen等[22]報(bào)道，使用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的穿梭質(zhì)粒pQAS34和pQAS32，在芽孢化的t2期加入誘導(dǎo)劑IPTG，相對(duì)于依靠衣殼蛋白自身啟動(dòng)子的工程菌，能夠在芽孢表面檢測(cè)到更多的目的蛋白表達(dá)。

整合載體的基本構(gòu)成是由大腸桿菌pBR322或其衍生質(zhì)粒的非自主復(fù)制的質(zhì)粒骨架、可以篩選枯草芽孢桿菌的抗性基因和與枯草芽孢桿菌染色體DNA同源的一段DNA片段組成。同源的DNA片段大多是以amyE、thrC、lacA、pyrD、gltA和scaA等非必需基因作為整合位點(diǎn)[21]，抗性基因插入在同源片段中間，并且在同源片段中間包含一個(gè)或多個(gè)酶切位點(diǎn)以引入外源片段。這類質(zhì)粒因?yàn)闆]有枯草芽孢桿菌的復(fù)制起點(diǎn)，在整合質(zhì)粒導(dǎo)入枯草芽孢桿菌后不能自主復(fù)制，只能通過整合到宿主染色體上，隨著細(xì)胞復(fù)制而復(fù)制。整合在染色體上的融合基因隨著芽孢衣蛋白啟動(dòng)子啟動(dòng)而表達(dá)，最后錨定在芽孢表面上。

2.2非基因重組

非基因重組的芽孢表面展示策略是將芽孢與已純化的外源蛋白一起孵育，由于芽孢和外源蛋白之間靜電和疏水作用力的相互作用，使得外源蛋白吸附在芽孢表面[23]。Donadio等[24]認(rèn)為，外源蛋白可能在孵育過程中發(fā)生滲透作用，通過了芽孢皮質(zhì)和外衣蛋白層，與內(nèi)衣蛋白發(fā)生相互作用，從而達(dá)到比較牢固錨定外源蛋白的效果。近年來又出現(xiàn)了使用戊二醛等作為交聯(lián)劑的方法，利用戊二醛與芽孢和外源蛋白反應(yīng)產(chǎn)生的共價(jià)鍵，將外源蛋白固定在芽孢表面[9]。這種非基因重組的方法不僅不依靠特定的芽孢衣蛋白，相對(duì)于基因重組方法而言，能在芽孢表面錨定更多的目的蛋白，并且非基因重組芽孢不會(huì)向環(huán)境引入抗性基因。

3 芽孢表面展示技術(shù)的應(yīng)用

枯草芽孢桿菌具有良好的發(fā)酵基礎(chǔ)和生產(chǎn)技術(shù)，且芽孢擁有極強(qiáng)的抗逆性，使得芽孢表面展示技術(shù)的應(yīng)用范圍極為廣泛。目前，枯草芽孢桿菌芽孢表面展示技術(shù)已廣泛用于黏膜疫苗、疫苗佐劑、多聚蛋白、生物治理和飼料用酶制劑等的生產(chǎn)。

3.1在生產(chǎn)黏膜疫苗方面的應(yīng)用

枯草芽孢桿菌是公認(rèn)的優(yōu)良益生菌菌種，其芽孢有極強(qiáng)的抗逆性，能夠順利通過胃到達(dá)腸道，被M細(xì)胞攝入，與派伊爾氏結(jié)中的抗原提呈細(xì)胞發(fā)生相互作用[25-26]，刺激機(jī)體發(fā)生黏膜和體液免疫應(yīng)答，這些特性賦予了枯草桿菌作為黏膜疫苗遞呈載體或佐劑的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，重組芽孢還具備對(duì)儲(chǔ)存和運(yùn)輸條件要求相對(duì)較低、使用重組芽孢免疫動(dòng)物的免疫方式簡(jiǎn)單、可減少免疫過程對(duì)動(dòng)物造成的應(yīng)激等優(yōu)勢(shì)。

Duc等[27]通過口服和滴鼻重組TTFC的工程菌芽孢RH103免疫小鼠，均能誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性分泌型免疫球蛋白A(sIgA)、免疫球蛋白M(IgM)和以免疫球蛋白G(IgG)1、IgG2b為主的Th2型免疫反應(yīng)，說明以重組芽孢免疫動(dòng)物，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生局部黏膜免疫和全身的體液免疫應(yīng)答，攻毒試驗(yàn)結(jié)果顯示，口服和滴鼻重組芽孢小鼠能經(jīng)受皮下注射20倍劑量半數(shù)致死量(LD50)破傷風(fēng)毒素攻擊。Zhou等[3]利用游離型質(zhì)粒pUS186作為載體，使用CotC作為錨定蛋白，將幽門螺旋桿菌脲酶成功的展示在芽孢表面，口服重組芽孢，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生黏膜和體液免疫應(yīng)答，三免后攻毒試驗(yàn)表明能夠顯著減少(84%)胃內(nèi)幽門螺旋桿菌附著數(shù)量。本實(shí)驗(yàn)室劉明剛等[28]以CotB作為錨定蛋白展示雞白痢沙門氏菌外膜蛋白C基因(OmpC)，可分別為2倍和10倍劑量LD50攻毒的鼠傷寒沙門氏菌感染的小鼠提供100%和50%的保護(hù)力，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)采用微生態(tài)制劑常用劑量即1×106CFU/g飼糧拌料給予小鼠，產(chǎn)生的腸黏膜抗體和血清抗體效果更優(yōu)。Huang等[8]采用吸附的方法將GST-Cpa247-370融合蛋白錨定在芽孢表面，口服和滴鼻2種免疫方式均能產(chǎn)生相當(dāng)?shù)目贵w水平，抵抗6倍劑量LD50毒素攻擊。Manki等[29]用吸附有滅活H5N1病毒粒子的滅活芽孢，通過滴鼻的方式免疫小鼠，能夠更早檢測(cè)到特異性抗體的產(chǎn)生和更高的抗體水平。Aps等[30-31]研究發(fā)現(xiàn)，芽孢還可以作為DNA疫苗佐劑，用吸附有質(zhì)粒DNA疫苗的芽孢免疫小鼠，能提高特異性抗體水平和CD8+T細(xì)胞的活化水平。

3.2在生產(chǎn)多聚蛋白方面的應(yīng)用

由于芽孢特殊的形成過程，賦予外源蛋白在重組芽孢中的獨(dú)特的展示過程。外源蛋白在母細(xì)胞中合成后無需跨膜直接組裝在芽孢表面。這對(duì)于生產(chǎn)多聚體形態(tài)下才有活性的蛋白具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。通過芽孢表面展示技術(shù)將酶固定在芽孢表面，不僅使酶純化和回收方式簡(jiǎn)單化，還能提高酶的活性和穩(wěn)定性。Kim等[32]在枯草芽孢桿菌芽孢表面成功展示了具有良好生物活性的鏈霉親和素，證明多聚蛋白可以在芽孢表面正確組裝。Richter等[33]發(fā)現(xiàn)，展示在芽孢表面的堿性磷酸酶的二硫鍵也能正確形成。Sirec等[34]采用吸附的方法將β-半乳糖苷酶成功展示在芽孢表面，使得吸附在芽孢表面的酶對(duì)酸性環(huán)境(pH=4)和高溫(75、80 ℃)條件下的耐受能力增加。通過芽孢表面展示技術(shù)將有活性的多聚蛋白錨定在芽孢表面，證明該技術(shù)適用于生產(chǎn)多聚蛋白，為生產(chǎn)多聚蛋白提供了新的選擇。

3.3在生物治理環(huán)境污染領(lǐng)域的應(yīng)用

隨著環(huán)境污染微生物治理領(lǐng)域的研究，生物酶憑借其環(huán)保性和催化效率高等優(yōu)點(diǎn)，生物酶催化技術(shù)也運(yùn)用到環(huán)境污染的治理上來。Chen等[4]將一種重要的工業(yè)酶——腈水解酶錨定在芽孢表面，簡(jiǎn)化了酶的純化和回收過程，提高了酶對(duì)溫度、pH和化學(xué)試劑的耐受能力。酶耐受力的提高對(duì)處理工業(yè)廢水的復(fù)雜條件時(shí)保持高效催化效率有很重要的意義。Falahati-Pour等[35]使用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(EDC-NHS)作為交聯(lián)劑，將有機(jī)磷水解酶共價(jià)錨定在芽孢表面。這種固定方法使得酶在不同pH和溫度條件下的活性都顯著提高，并且在6次循環(huán)使用后，酶活性幾乎沒有降低，循環(huán)使用10次后，仍能保持80%的酶活。這對(duì)解決環(huán)境中有機(jī)磷農(nóng)藥環(huán)境殘留問題提供了生物修復(fù)新方法。

3.4在篩選特定功效微生態(tài)制劑方面的應(yīng)用

通過芽孢表面展示技術(shù)構(gòu)建特定功效的菌株，克服了傳統(tǒng)益生菌存在篩選過程復(fù)雜、效果單一、針對(duì)性不強(qiáng)等缺點(diǎn)，為篩選出特定功效的菌株提供了便利。芽孢表面展示技術(shù)已經(jīng)嘗試應(yīng)用到飼料用酶制劑的生產(chǎn)上。Potot等[7]將微生物來源的植酸酶展示在芽孢表面，由于芽孢的穩(wěn)定性，使得表面展示的酶獲得更好的穩(wěn)定性，有望解決傳統(tǒng)飼料用酶制劑生產(chǎn)中固態(tài)發(fā)酵質(zhì)量不穩(wěn)定、酶產(chǎn)量低及在飼料制粒和儲(chǔ)存過程中酶活性損耗等問題。馮凡[36]還在人胰島素原和錨定蛋白的融合蛋白基因之間加入一段腸激酶作用位點(diǎn)，以重組芽孢飼喂家蠶，能夠在家蠶血淋巴內(nèi)檢測(cè)到人胰島素原，證明芽孢展示的重組蛋白能夠被腸激酶消化，吸收進(jìn)入家蠶血淋巴。

4 小 結(jié)

枯草芽孢桿菌芽孢表面展示技術(shù)憑借其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)已被開發(fā)出多種展示策略，使芽孢成為一個(gè)多用途載體。芽孢擁有極強(qiáng)的抗逆性，儲(chǔ)存方式簡(jiǎn)單，能順利通過胃腸道屏障，還可以和抗原遞呈細(xì)胞發(fā)生相互作用；同時(shí)枯草芽孢桿菌還是一種益生菌，具有調(diào)節(jié)腸道菌群、提高機(jī)體免疫力等益生特征，這些都賦予了枯草芽孢桿菌芽孢作為極佳的黏膜疫苗遞呈載體和免疫佐劑的特性。最近發(fā)現(xiàn)芽孢還可以作為DNA疫苗的載體，相信今后芽孢表面展示技術(shù)還會(huì)為設(shè)計(jì)新型疫苗提供新思路。枯草芽孢桿菌除了對(duì)增強(qiáng)疫苗免疫效果、提高外源活性蛋白的功能起著重要作用外，還可發(fā)揮其微生態(tài)學(xué)效應(yīng)的功能，也為研究和開發(fā)特定功效的微生態(tài)制劑提供新的方向。芽孢表面展示技術(shù)可以直接將酶固定在芽孢表面，展示在芽孢表面的酶擁有更好的穩(wěn)定性，且純化和回收方法簡(jiǎn)單，這對(duì)生物催化行業(yè)固定載體提供了新選擇。使用2種錨定蛋白或不同的芽孢表面展示策略構(gòu)建多功能重組芽孢，將會(huì)使芽孢成為了一個(gè)多功能的載體。相信隨著對(duì)枯草芽孢桿菌芽孢表面展示技術(shù)研究的深入，今后枯草芽孢桿菌芽孢表面展示技術(shù)將會(huì)在更多的領(lǐng)域發(fā)揮重要的作用。

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*Corresponding author, professor, E-mail: pankangcheng71@126.com

ApplicationofBacillussubtilisSporeSurfaceDisplayofFunctionalHeterologousProtein

FENG Jie1WANG Zhenhua2PAN Kangcheng1*

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu611130,China; 2.BranchCollegeofAnimalHusbandryandVeterinar,ChengduVocationalCollegeofAgriculturalScienceandTechnology,Chengdu611130,China)

Bacillussubtilisis an aerobic positive bacteria which is used as a probiotic for both human and animal. It can be induced to differentiate into the spore by unfavorable condition of circumstances. Because of the special structure and physiological characteristics ofBacillussubtilisspore, researchers found that the spore was the ideal vector of enzymes and antigens, and had been used the coat protein as a carrier, adsorption or covalent methods to display foreign proteins on the surface of the spore. Now, some enzymes, antigens and other functional proteins have successes to be displayed on the spore. The paper introduced the structure ofBacillussubtilisspore, the technology of spore surface display and its application.[ChineseJournalofAnimalNutrition,2017,29(11)：3893-3898]

Bacillussubtilis; spore surface display; covalent immobilization; vector

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.11.008

S811.6

A

1006-267X(2017)11-3893-06

2017-04-19

“四川省高等學(xué)?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)”資助項(xiàng)目(KM406183.1)

馮 杰(1992—)，男，四川自貢人，碩士研究生，從事動(dòng)物微生態(tài)學(xué)研究。E-mail： fengjie9201@163.com

*通信作者：潘康成，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail： pankangcheng71@126.com

(責(zé)任編輯 武海龍)