鄧文+熊雙偉+于翠+李勇+莫榮利+熊超+胡興明

摘要：采用Biolog微生態(tài)技術(shù)，研究長(zhǎng)期（4年-4Y，17年-17Y，32年-32Y）偏施氮肥桑樹(shù)根際土壤微生物碳源利用能力變化。結(jié)果表明，不同施肥年限及不同取樣時(shí)期桑樹(shù)根際土壤微生物利用單一碳源能力不同，4Y土壤微生物活性（AWCD）、Shannon多樣性指數(shù)及對(duì)糖類、氨基酸類、胺類碳源的利用能力均高于其他處理土壤，且與32Y土壤均達(dá)顯著差異水平（P<0.05）；主成分分析表明，4Y土壤和17Y土壤與32Y土壤間微生物碳代謝功能差異較大；逐步回歸分析表明，碳源利用Shannon多樣性指數(shù)與土壤有機(jī)質(zhì)含量、pH及速效氮含量有一定相關(guān)關(guān)系。

關(guān)鍵詞：桑樹(shù)；根際微生物；碳源利用能力

中圖分類號(hào)：S154.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）23-6108-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.23.025

Abstract： Changes in soil microbial carbon source utilization ability of mulberry rhizosphere in long-term partial application of nitrogen fertilizer were investigated by using Biolog micro ecological technology. The results showed that the carbon utilization ability in different fertilization years and sampling date was different. The AWCD， Shannon diversity index and the utilization ability of carbohydrates， amino acids， amines in 4Y soils were higher than in other treatment soils， and had significant difference compared with 32Y soils（P<0.05）. The principle components analysis indicated that there was significant difference between 4Y， 17Y soils and 32Y soils. Stepwise regression analysis indicated that there was certain（P<0.01） correlations among Shannon diversity index and organic matter content， pH， and available nitrogen content.

Key words： mulberry； rhizospheric microorganism； carbon source utilization ability

據(jù)研究，微生物在養(yǎng)分轉(zhuǎn)運(yùn)和土壤肥料維持方面具有重要作用[1，2]；施用氮肥影響土壤微生物種群結(jié)構(gòu)和碳代謝功能多樣性，但施用一定量的氮肥對(duì)土壤微生物種群結(jié)構(gòu)或多樣性無(wú)影響[3-8]；氮肥施用對(duì)土壤微生物種群結(jié)構(gòu)和碳代謝功能多樣性的影響比較復(fù)雜，可能與植物類型、氮肥用量、氮肥施用年限以及生物和非生物因素等有關(guān)[9-11]。

湖北省是中國(guó)中部地區(qū)重要的蠶桑生產(chǎn)基地，桑園大多分布在山坡地帶，桑園立地條件普遍較差，桑樹(shù)產(chǎn)葉量較低，為獲得桑葉高產(chǎn)，蠶農(nóng)長(zhǎng)期偏施氮肥（氮肥用量高達(dá)450 kg/hm2），降雨過(guò)后桑園土壤板結(jié)，土壤酸化現(xiàn)象嚴(yán)重[12]。過(guò)量施用氮肥不僅導(dǎo)致土壤對(duì)氮素的調(diào)控功能下降，還會(huì)污染漳河、沮河等長(zhǎng)江重要支流，對(duì)三峽庫(kù)區(qū)、丹江口庫(kù)區(qū)造成面源污染，影響丹江口水庫(kù)的水質(zhì)。目前對(duì)長(zhǎng)期過(guò)量施用氮肥對(duì)桑園土壤微生物多樣性的影響[13，14]的研究很少。本研究目的是明確長(zhǎng)期過(guò)量施用氮肥對(duì)桑園土壤微生物利用碳源的影響，為桑園科學(xué)施肥管理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)處理

試驗(yàn)在湖北省農(nóng)科院經(jīng)濟(jì)作物研究所桑樹(shù)資源圃進(jìn)行，以資源圃1982、1997和2010年栽植的育71-1（Morus alba L.）為試驗(yàn)材料，株行距為1.0 m×1.5 m，栽植后，根據(jù)當(dāng)?shù)匦Q農(nóng)的生產(chǎn)習(xí)慣，每年施450 kg/hm2氮素、120 kg/hm2過(guò)磷酸鈣、180 kg/hm2硫酸鉀鎂，春季溝施40%，夏伐后溝施60%。

1.2 土壤樣品采集

2014年和2015年，在大蠶用葉期（5月）、夏伐后新梢旺長(zhǎng)期（7月）、新梢緩慢生長(zhǎng)期（9月）、新梢停長(zhǎng)期（11月），采集施肥年限分別為4年（4Y）、17年（17Y）、32年（32Y）的土壤樣品，鏟去表土，深挖5～20 cm，將土壤連同桑樹(shù)根系一起裝入無(wú)菌袋、編號(hào)。土樣帶回實(shí)驗(yàn)室后，將同一處理的樣品混合，采用抖根法[15]取根際土壤與非根際土壤，并分成2份，一份土樣（約200 g）于4 ℃保存，供微生物分析，另一份土樣自然風(fēng)干，供土壤理化性質(zhì)分析[16]。土壤樣品的基本理化性質(zhì)見(jiàn)表1。

1.3 桑園土壤微生物功能多樣性測(cè)定與計(jì)算方法

利用Biolog（Biolog Eco PlateTM）技術(shù)，采用Garland等[17]的方法并稍加變動(dòng)，研究土壤微生物碳代謝多樣性。在5 g土壤樣品中加入45 mL滅菌8.5 g/L NaCl溶液，在搖床上振蕩15 min，靜置片刻，然后將土壤樣品稀釋（稀釋度10-3），用排槍吸取稀釋液至96孔Biolog Eco板中，150 μL/孔，將接種好的板置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24 h在590 nm處讀取數(shù)據(jù)。培養(yǎng)時(shí)間共168 h。

微平板中溶液吸光值平均單孔顏色變化率（AWCD）用于描述土壤微生物代謝活性。計(jì)算方法如下：AWC（Ci-Ri）/n，式中Ci為每個(gè)有培養(yǎng)基孔的光密度值，Ri為對(duì)照孔的光密度值，n為培養(yǎng)基孔數(shù)，Biolog Eco板n值為31。參照郭正剛等[18]的方法，用Shannom-Wiener多樣性指數(shù)（H）描述土壤微生物多樣性豐度，用96 h的平均單孔顏色變化率AWCD值計(jì)算H。多樣性指數(shù)H=-ΣPilnPi，式中，Pi為第i孔的相對(duì)光密度值與整個(gè)微平板的相對(duì)光密度值總和的比值，Pi=（Ci-Ri）/Σ（Ci-Ri）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

土壤理化測(cè)試數(shù)據(jù)和微生物多樣性指數(shù)的顯著性分析采用單因素方差分析，選取120 h的平均顏色變化率AWCD對(duì)微生物碳源利用進(jìn)行分析，方差分析和主成分分析采用SPSS19.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑樹(shù)根際土壤微生物AWCD變化

平均單孔顏色變化率（AWCD）反映了土壤微生物群落對(duì)單一碳源整體利用情況，代表土壤微生物活性。從圖1可以看出，在168 h的培養(yǎng)期間，各處理土壤AWCD從24 h開(kāi)始迅速提高，144 h左右達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，因此，本研究選擇光密度增加時(shí)期即120 h的光密度用于統(tǒng)計(jì)分析。不同施肥年限及不同取樣時(shí)期桑樹(shù)根際土壤微生物利用單一碳源能力不同，4Y和17Y土壤微生物利用單一碳源的能力AWCD高于32Y土壤；不同取樣期間比較，11月份取樣4Y和17Y土壤AWCD顯著高于其他取樣日期。逐步回歸分析表明，土壤有機(jī)質(zhì)含量與AWCD顯著相關(guān)（表2）。

2.2 桑樹(shù)根際土壤微生物群落對(duì)Biolog Eco板6類碳源的利用

微生物對(duì)不同碳源的利用可以反映微生物的代謝功能類群?？傮w而言，4Y土壤微生物對(duì)不同碳源的利用能力較強(qiáng)，而32Y土壤微生物碳源利用能力較弱（圖2）。4Y土壤微生物對(duì)糖類、氨基酸類及胺類碳源的利用高于其他年限土壤，且與32Y土壤在4次取樣時(shí)期均達(dá)差異顯著水平（P<0.05）。從多樣性指數(shù)看，各取樣時(shí)期4Y土壤Shannon多樣性指數(shù)顯著高于32Y土壤（P<0.05，圖3）。逐步回歸分析表明，Shannon多樣性指數(shù)與土壤有機(jī)質(zhì)含量、pH及速效氮含量有一定相關(guān)關(guān)系（表2）。

2.3 桑樹(shù)根際土壤微生物對(duì)碳源利用的主成分分析

碳源利用能力主成分分析見(jiàn)圖4。不同施肥年限土壤及不同取樣日期之間有較大的分離，表明土壤微生物代謝特征表現(xiàn)出較大差異。第1主成分和第2主成分分別解釋土壤微生物代謝31種基質(zhì)的62.46%和15.21%（2014年）及66.45%和14.50%（2015年）的變異。4Y土壤和17Y土壤間離散距離較小，而與32Y土壤間的離散距離較大，表明不同施肥年限顯著影響土壤微生物碳代謝功能群結(jié)構(gòu)。

3 小結(jié)與討論

前人研究表明，不合理的肥料種類及數(shù)量可能導(dǎo)致土壤環(huán)境的惡化，并破壞土壤微生態(tài)系統(tǒng)的平衡[19，20]。本研究結(jié)果表明，與4Y和17Y相比，32Y土壤微生物碳源利用能力顯著降低（圖1、圖2）；土壤微生物對(duì)氮肥的反應(yīng)取決于許多因素，包括肥料類型、肥料數(shù)量、應(yīng)用時(shí)間、土壤特性及作物類型等，對(duì)于桑樹(shù)，長(zhǎng)期施用氮肥每年施450 kg/hm2，確實(shí)減少了土壤微生物碳源利用能力及多樣性。

前人對(duì)茶、番茄、棉花、煙草等的研究表明，土壤微生物的活性和功能多樣性隨栽植時(shí)間的增加而減少[21-23]。Fu等[23]報(bào)道，蘆筍土壤微生物種群結(jié)構(gòu)隨栽培時(shí)間的延長(zhǎng)而減少。本研究中17Y和32Y土壤微生物多樣性的減少不僅取決于栽培時(shí)間，而且與施肥管理關(guān)系更密切。因此，不同植物類型對(duì)栽培時(shí)間及不同肥料的反應(yīng)需要進(jìn)一步深入研究。

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