武華玉+程碧軍+喬木+劉貴生+吳俊靜+李良華+彭先文+梅書棋

摘要：分離克隆了豬MBF1基因第4外顯子的序列，測(cè)序發(fā)現(xiàn)在18 bp處存在T/C突變，引起TaqI酶切多態(tài)。利用PCR-RFLP方法對(duì)國(guó)內(nèi)外4個(gè)豬種MBF1基因第4外顯子的多態(tài)性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在國(guó)外豬種中等位基因T的的頻率占優(yōu)勢(shì)；在中國(guó)豬種中C等位基因的頻率占優(yōu)勢(shì)；在437頭大梅F2代資源家系中進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)該多態(tài)與瘦肉率、板油重、肩部背膘厚、眼肌高、眼肌寬、眼肌面積顯著相關(guān)（P<0.05）。

關(guān)鍵詞：豬MBF1基因；PCR-PFLP；多態(tài)性；性狀關(guān)聯(lián)分析

中圖分類號(hào)：S828.8+9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）23-6192-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.23.048

Abstract： Cloning and Sequencing of the 4th exon of porcine MBF1 gene indicated that a T18C substitution which can be detected by restriction endonuclease TaqI. This polymorphism was analyzed with PCR-RFLP among four foreign and Chinese pig breeds. Analysis result showed that allele T was predominant in foreign pig breeds；however allele C was predominant in Chinese pig breeds. Statistical analysis in 437 Large White×Meishan F2 progeny pigs showed that the TaqI polymorphism was associated with lean meat percentage，leaf fat weigh，shoulder fat thickness，loin eye height，loin eye width，loin eye area，significantly（P<0.05）.

Key words： porcine MBF1 gene； PCR-RFLP； polymorphism； association analysis

多蛋白橋梁因子（Multiprotein bridging factor 1， MBF1）是一種核受體輔激活因子，它通過(guò)橋連通用轉(zhuǎn)錄因子TBP增強(qiáng)特異性轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合活性，增強(qiáng)結(jié)合的靶基因的啟動(dòng)子活性，介導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)錄激活，調(diào)節(jié)生物體的各種生命活動(dòng)[1-3]。MBF1是一個(gè)高度保守的調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞分化、中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、脂類和組氨酸新陳代謝的轉(zhuǎn)錄輔激活蛋白[4，5]，同時(shí)可以調(diào)節(jié)類固醇激素的生成[6]。MBF1還可以增強(qiáng)一些與脂類代謝相關(guān)的核受體轉(zhuǎn)錄激活，調(diào)節(jié)脂質(zhì)的動(dòng)態(tài)代謝平衡[4]。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和組織樣品

基因克隆及SNP篩選的樣品：大白豬（湖北省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所原種豬場(chǎng)）、梅山豬（英山縣綠源養(yǎng)豬專業(yè)合作社）二月齡肌肉組織提取RNA。

用于基因頻率分析的樣品：大白豬（湖北省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所原種豬場(chǎng)）、長(zhǎng)白豬（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)豬場(chǎng)）、梅山豬（英山縣綠源養(yǎng)豬專業(yè)合作社）、通城豬（通城縣種豬場(chǎng)）共143頭，前腔靜脈采血，提取DNA。

用于性狀關(guān)聯(lián)分析的樣品：大白豬和梅山豬雜交產(chǎn)生的F2代群體（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)豬場(chǎng)）437頭，分別提取個(gè)體DNA并做好性狀記錄。

DNA的提?。翰捎脗鹘y(tǒng)的苯酚/氯仿提取法。

RNA的提?。喊凑誌nvitrogen公司的TRIzol試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行提取。

1.2 引物及主要試劑

根據(jù)大白豬MBF1基因序列，設(shè)計(jì)豬的第4外顯子的特異引物Primer pair，引物序列如下：

Forward primer：GAACAAACAGCACTCAATCAC

Reverse primer：TTCAGGAGCATGTGCCTA

引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，去離子水溶解，-20 ℃保存。pMD-18T vector system、DH5α購(gòu)自TaKaRa公司（大連）；Gel Extraction Kit購(gòu)自上海生工生物技術(shù)有限公司。

1.3 PCR擴(kuò)增與克隆、測(cè)序

PCR擴(kuò)增體積為25 μL，體系中各組分的濃度為50 ng模板DNA、1×PCRmix、0.5 mmol/L PCR primers，PCR的運(yùn)行程序如下：預(yù)變性94 ℃ 4 min； 94 ℃ 45 s，61 ℃ 45 s，72 ℃50 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；將目的帶用Gel Extraction Kit試劑盒純化回收，回收后的PCR產(chǎn)物片段與pMD-18T vector system連接并轉(zhuǎn)化DH5α，克隆子送北京奧科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.4 PCR-RFLP分析

選用TaqI對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行消化，酶切反應(yīng)總體系為10 μL，其中PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL，限制性內(nèi)切酶0.5 μL（10 U/μL），10×Buffer 1 μL，ddH2O 3.5 μL，65 ℃恒溫反應(yīng)4 h，后經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

用Qiao等[7]介紹的單標(biāo)記回歸統(tǒng)計(jì)模型，使用SAS統(tǒng)計(jì)軟件（SAS Institute Inc，Version 8.0）的GLM程序進(jìn)行單標(biāo)記方差分析，同時(shí)用REG程序計(jì)算基因的顯性效應(yīng)和加性效應(yīng)，并進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。加性效應(yīng)用-1，0和1分別代表TT、TC和CC基因型，顯性效應(yīng)用1，-1和1分別代表TT、TC和CC基因型。所采用模型為：Yijk=μ+Si+Yj+Gk+bijkXijk+eijk，其中Yijk為性狀表型值，μ為群體均值，Si為性別效應(yīng)，Yj 是年份效應(yīng)，Gk為基因型效應(yīng)，bijk為屠宰體重的回歸系數(shù)，Xijk是協(xié)變量屠宰體重，eijk為殘差效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

Primer pair分別在大白豬、梅山中擴(kuò)增，取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL在1%的瓊脂糖上電泳，其大小為760 bp，與GenBank上公布的豬MBF1基因的序列大小相一致（圖1）。PCR產(chǎn)物測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在第4外顯子18 bp處有1個(gè)T-C突變（圖2），引起TaqI酶切（T，CGA）多態(tài)。

2.2 擴(kuò)增產(chǎn)物的PCR-RFLP分析

該位點(diǎn)經(jīng)限制性內(nèi)切酶TaqI酶切分析發(fā)現(xiàn)：當(dāng)?shù)?外顯子18 bp處的堿基為C時(shí)TaqI酶切該位點(diǎn)，記為CC型（354 bp+325 bp+81 bp），當(dāng)該位點(diǎn)堿基都為T時(shí)TaqI不識(shí)別該位點(diǎn)，記為TT型（679 bp+81 bp），當(dāng)C和T都存在時(shí)記為CT型（679 bp+354 bp+325 bp+81 bp）。豬MBF1基因的PCR- TaqI-RFLP的酶切分型結(jié)果如圖3。

2.3 豬MBF1基因TaqI位點(diǎn)在不同豬種中的基因頻率和基因型頻率

在中外4個(gè)品種豬中檢測(cè)MBF1基因第4外顯子PCR-TaqI-RFLP多態(tài)性基因頻率分布，檢測(cè)結(jié)果如表1所示。在國(guó)外豬種中等位基因T的的頻率占優(yōu)勢(shì)，大白、長(zhǎng)白豬T等位基因的頻率分別為0.81和0.86；而在中國(guó)豬種中C等位基因的頻率占優(yōu)勢(shì)，在梅山和通城豬中C等位基因的頻率分別為0.94和0.71。

2.4 豬MBF1基因TaqI位點(diǎn)基因型與生產(chǎn)性狀的關(guān)聯(lián)分析

應(yīng)用SAS軟件運(yùn)行GLM和REG程序，進(jìn)行豬MBF1基因PCR-TaqI-RFLP不同基因型與豬生產(chǎn)性狀的關(guān)聯(lián)分析和遺傳效應(yīng)估計(jì)，基因型檢測(cè)結(jié)果表明：在所檢測(cè)的437頭大白×梅山F2代個(gè)體中，TT基因型134頭，CT基因型204頭，CC基因型99頭。不同基因型與生產(chǎn)性狀間的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2。

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，MBF1基因第4外顯子PCR-TaqI-RFLP多態(tài)性與瘦肉率、板油重、肩部背膘厚、眼肌高、眼肌寬、眼肌面積顯著相關(guān)（P<0.05）；眼肌高、眼肌面積加性效應(yīng)顯著（P<0.05），瘦肉率、肩部背膘厚加性效應(yīng)極顯著（P<0.01）。板油重、眼肌寬顯性效應(yīng)顯著（P<0.05）。TT基因型有較高的瘦肉率、眼肌高、眼肌寬和眼肌面積。

3 討論

本研究中，TT基因型有較高的瘦肉率、眼肌高、眼肌寬和眼肌面積；瘦肉豬品種大白豬、長(zhǎng)白豬群體中T基因頻率占優(yōu)勢(shì)，在中國(guó)本地品種梅山豬、通城豬中C等位基因占優(yōu)勢(shì)，說(shuō)明T基因可能具有提高瘦肉率，降低背膘厚的效應(yīng)；而C基因可能具有促進(jìn)脂肪沉積降低瘦肉率的效應(yīng)。

瘦肉率、肩部背膘厚、眼肌面積、眼肌高加性效應(yīng)顯著，加性效應(yīng)是可以遺傳的，因此可以采用分子標(biāo)記輔助選擇和常規(guī)選擇項(xiàng)結(jié)合的方法對(duì)豬屠宰率、背膘厚、眼肌面積等性狀進(jìn)行固定。顯性效應(yīng)主要基因互作的結(jié)果，顯性效應(yīng)性狀可通過(guò)雜交獲得較好選擇效果[8]。

MBF1是調(diào)節(jié)脂類和組氨酸等代謝的轉(zhuǎn)錄激活蛋白，可以調(diào)節(jié)類固醇激素的生成，調(diào)控脂肪代謝動(dòng)態(tài)平衡[4-6]，為MBF1基因作為調(diào)節(jié)脂肪沉積性狀的候選基因提供了生理功能依據(jù)。本研究證實(shí)了MBF1基因第4外顯子T/C突變與瘦肉率、背膘厚等脂肪沉積相關(guān)性狀存在顯著的相關(guān)性，為該因作為調(diào)節(jié)脂肪沉積性狀的候選基因提供了統(tǒng)計(jì)學(xué)依據(jù)，綜上所述，MBF1基因可以作為豬脂肪沉積性狀的候選基因。

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