程伊洛+邵華斌+羅青平+劉國(guó)平+張騰飛

摘要：以雞白痢沙門氏菌c79-3強(qiáng)毒株為親本，通過(guò)λ-red同源重組系統(tǒng)構(gòu)建雞白痢沙門菌aroA基因缺失株△aroA，并進(jìn)行了測(cè)序驗(yàn)證和毒力試驗(yàn)。結(jié)果表明，aroA基因缺失株的生長(zhǎng)速度較親本株緩慢，且該缺失株具有良好的遺傳穩(wěn)定性；相比野生菌株，aroA基因缺失株的毒力發(fā)生了下降，雛雞攻毒死亡率較親本株低。本研究獲得的減毒雞白痢沙門氏菌aroA基因缺失株△aroA，為進(jìn)一步研究雞白痢沙門氏菌aroA基因的功能和后續(xù)減毒活疫苗開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：雞白痢沙門氏菌；λ-red同源重組；aroA基因；生物學(xué)特性；活疫苗

中圖分類號(hào)：S852.65 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）23-6195-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.23.049

Abstract：The △aroA mutant was constructed by the λ-red recombinant based on c79-3 virulent strain and was confirmed by PCR and sequencing. The growth characteristics and genetic stability of the mutant strain was tested. The results showed that the growth rate of △aroA mutant was slow than the parent strain and was stable. The pathogenecity tests on one day-old chicks. The results showed that compared with wild strains， the virulence of aroA gene deletion mutant was decreased， and the attack rate of chicken was lower than that of the parent strain. In conclusion，we successfully obtained △aroA mutant strain and this study provided basic data for further study of the functions of the aroA gene and live attenuated vaccine.

Key words： Salmonella pullorum； λ-red recombinant system； aroA gene； biological characteristic； live vaccine vector

沙門氏菌屬包含2 500多種血清型，其中包括了腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌等人畜共患血清型以及具有宿主高度專一性的雞白痢沙門氏菌血清型。雞白?。╬ullorumdisease，PD）是由對(duì)家禽具有高度的適應(yīng)性的雞白痢沙門氏菌（Salmonella pullorum）引起的一種多發(fā)性傳染病[1]。雞白痢沙門氏菌可水平傳播，易感染三周齡以下的雛雞，且有較高的致死率[2]。此外，它還能持續(xù)感染脾臟和生殖道數(shù)月時(shí)間，引起產(chǎn)蛋和后代的垂直感染[3]。雞白痢在發(fā)達(dá)國(guó)家已經(jīng)被根除，但仍在世界范圍內(nèi)特別是發(fā)展中國(guó)家引起巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4，5]。雞群長(zhǎng)時(shí)間高水平感染和抗生素濫用導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性持續(xù)增加，導(dǎo)致雞白痢更加難以控制。一個(gè)好的控制雞白痢沙門氏菌感染的方法有巨大的應(yīng)用前景[6]。

疫苗的應(yīng)用也能很好的控制和預(yù)防沙門氏菌的感染[7]。目前在國(guó)際上得到應(yīng)用的沙門氏菌疫苗主要有雞傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、雞腸炎沙門氏菌苗等。在歐洲禽類養(yǎng)殖國(guó)家，沙門氏菌疫苗的應(yīng)用在防治沙門氏菌感染方面起到了非常重要的作用。許多研究表明減毒活疫苗的效果要優(yōu)于滅活苗，由于沙門氏菌是一種兼性胞內(nèi)寄生菌，特異性細(xì)胞免疫是控制它的關(guān)鍵。與滅活苗相比，減毒活疫苗能優(yōu)先刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫，具有更高的效率[8]。然而在中國(guó)，尚未有自主研發(fā)且匹配中國(guó)流行菌株的沙門氏菌疫苗產(chǎn)品。因此，研發(fā)針對(duì)雞白痢的減毒活疫苗對(duì)中國(guó)禽類養(yǎng)殖具有重大意義。本研究以野生強(qiáng)毒株C79-3為親本，通過(guò)λ-red同源重組系統(tǒng)[9，10]構(gòu)建芳香族氨基酸合成相關(guān)基因aroA缺失株△aroA，達(dá)到干擾細(xì)菌代謝，降低毒性的效果，從而為研發(fā)更加安全有效的減毒活疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒、試驗(yàn)動(dòng)物

雞白痢沙門氏菌強(qiáng)毒株c79-3；Red同源重組所需質(zhì)粒pKD3、pKD46、pcp20由揚(yáng)州大學(xué)彭大新教授饋贈(zèng)；1日齡白來(lái)航雛雞由購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司的SPF雞胚自孵。

1.2 主要試劑和培養(yǎng)基

甘油、氨芐青霉素（Ampicillin）、氯霉素（chloramphenicol）購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；普通Taq DNA聚合酶、PrimerSTAR Max DNA高保真聚合酶、DNA片段回收試劑盒、DNA Marker均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；LB肉湯/瓊脂培養(yǎng)基為美國(guó)BD公司產(chǎn)品。

1.3 雞白痢沙門氏菌aroA基因缺失株構(gòu)建

1.3.1 引物設(shè)計(jì) 參考Genebank中的雞白痢沙門氏菌（NC_011274）aroA基因序列，用Primer 5設(shè)計(jì)一對(duì)敲除引物Aro1和Aro2（表1）。其中，Aro1由 56 bp的aroA基因上游同源序列A1和擴(kuò)增質(zhì)粒pKD3氯霉素抗性基因的上游引物C1（下劃線所示）組成，Aro2由57 bp的與aroA基因下游同源的序列A2和擴(kuò)增質(zhì)粒pKD3氯霉素抗性基因的下游引物C2（下劃線所示）序列組成。另外，從aroA基因兩側(cè)設(shè)計(jì)引物P1、P2；aroA基因中間設(shè)計(jì)上游引物P3和下游引物P4，如表1所示，用于aroA基因缺失構(gòu)建過(guò)程中的PCR驗(yàn)證。

1.3.2 同源打靶片段的制備 以質(zhì)粒pKD3為模板，Aro1和Aro2為引物，用PrimerSTAR Max DNA高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：98 ℃變性10 s，55 ℃退火5 s，72 ℃延伸20 s（35個(gè)循環(huán)）。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增并測(cè)序成功后，將擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物用雙蒸水稀釋100倍當(dāng)做模板進(jìn)行2次PCR擴(kuò)增（確保PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后無(wú)質(zhì)粒殘留），利用DNA片段回收試劑盒回收打靶片段，回收后的DNA片段溶于滅菌后的純水中。

1.3.3 重組酶的誘導(dǎo)表達(dá)與感受態(tài)細(xì)胞的制備 將轉(zhuǎn)化了pKD46的c79-3菌株接種氨芐抗性LB培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)過(guò)夜；次日按1∶100轉(zhuǎn)接到50 mL含氨芐青霉素濃度為50 μg/mL LB培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)至DD600=0.2左右時(shí)，加入終濃度為30 mmol/L的L-阿拉伯糖繼續(xù)培養(yǎng)1 h，誘導(dǎo)使質(zhì)粒pKD46上Exo、Bet和Gam三個(gè)發(fā)揮重組作用的蛋白得到充分表達(dá)。取出培養(yǎng)基冰上預(yù)冷10 min，5 000 r/min 4 ℃離心10 min棄培養(yǎng)基；用預(yù)冷的10%甘油離心洗滌3次，最后重懸細(xì)胞于500 μL預(yù)冷的10%甘油中，分裝每管100 μL備用，命名為c79-3/pKD46。

1.3.4 打靶片段電轉(zhuǎn)化 將約800 ng同源臂引物擴(kuò)增純化得到的氯霉素抗性基因片段加入制備好的感受態(tài)細(xì)胞c79-3/pKD46中，輕彈混勻后加入 1 mm電轉(zhuǎn)杯，靜置30 min后，選擇200 Ω，25 μF， 1 800 V電擊條件用伯樂(lè)電轉(zhuǎn)儀作電轉(zhuǎn)化，電擊時(shí)間為（5.0±0.5） ms。電擊后迅速加入800 μL預(yù)冷的LB肉湯培養(yǎng)基，200 r/min 37 ℃培養(yǎng)2 h后3 000 r/min離心5 min收集菌體，涂布于含氯霉素濃度為50 μg/mL的LB平板，30 ℃倒置培養(yǎng)，18 h后挑選氯霉素抗性克隆，并進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

1.3.5 質(zhì)粒pKD46去除 用接種環(huán)沾取經(jīng)PCR鑒定重組成功的菌株，在不含任何抗生素的LB平板上劃線后倒置于43 ℃溫箱中培養(yǎng)過(guò)夜。次日用10 μL槍頭挑取單克隆，先在含氨芐青霉素的平板上輕點(diǎn)后再以同一槍頭的同一部位于含氯霉素平板上輕點(diǎn)，37 ℃條件下倒置過(guò)夜培養(yǎng)，挑選對(duì)氨芐青霉素敏感而對(duì)氯霉素具有抗性的克隆，命名為△aroA∶∶Cm。

1.3.6 FLP位點(diǎn)專一性重組 將上述消除質(zhì)粒pKD46的陽(yáng)性克隆用“1.3.3”中方法制成感受態(tài)細(xì)胞，選擇“1.3.4”中相同電擊條件電轉(zhuǎn)質(zhì)粒pcp20， 30 ℃培養(yǎng)6 h后，升溫到43℃培養(yǎng)過(guò)夜，熱誘導(dǎo)質(zhì)粒pcp20上FLP專一性重組酶表達(dá)，消除△aroA∶∶Cm上的氯霉素片段，pcp20為溫敏質(zhì)粒，升溫后也逐漸丟失。用接種環(huán)蘸菌液在無(wú)抗性LB瓊脂培養(yǎng)基上劃板，用槍頭沾取單菌落點(diǎn)到氯霉素抗性LB平板和無(wú)抗LB平板上，過(guò)夜培養(yǎng)后無(wú)抗LB平板上長(zhǎng)出菌落而氯霉素平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)的表示氯霉素抗性基因已被FLP重組酶成功消除。用鑒定引物做PCR對(duì)氯霉素抗性消失的克隆進(jìn)行鑒定，最終獲得aroA基因缺失株△aroA。

1.4 △aroA遺傳穩(wěn)定性的鑒定

用LB瓊脂平板對(duì)雞白痢沙門菌株c79-3和△aroA進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)至20代，分別選取第5、10、15、20代菌落為模板，用aroA基因內(nèi)部特異性引物P1、P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用野生c79-3作陽(yáng)性對(duì)照，通過(guò)擴(kuò)增條帶的有無(wú)鑒定△aroA菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1.5 △aroA的生長(zhǎng)特性研究

以無(wú)抗LB瓊脂平板同時(shí)劃線培養(yǎng)c79-3、aroA基因缺失株△aroA，同時(shí)挑取雞白痢沙門氏菌c79-3、△aroA分別接種于LB肉湯培養(yǎng)基中震搖過(guò)夜，次日分別轉(zhuǎn)接于40 ml的LB肉湯培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)初始OD600 nm均為0.05，37 ℃、180 r/min連續(xù)振蕩培養(yǎng)14 h，每隔1 h取出100 μL菌液測(cè)定OD600 nm的值，通過(guò)生長(zhǎng)曲線繪制與平板上c79-3和△aroA的菌落大小同時(shí)判斷兩種菌株生長(zhǎng)速度。

1.6 △aroA對(duì)雛雞的毒力試驗(yàn)

將20只1日齡白來(lái)航雛雞隨機(jī)分為A、B兩組，分別接種雞白痢沙門菌株c79-3和△aroA菌株。A組10只，以3.4×107CFU的劑量口服接種c79-3；B組10只，以3.2×107CFU的劑量口服接種△aroA（兩組的活菌數(shù)由攻毒的菌液作活菌計(jì)數(shù)得到）。連續(xù)觀察2周，觀察小雞癥狀并統(tǒng)計(jì)死亡情況，從而評(píng)價(jià)菌株對(duì)雛雞的毒力。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞白痢沙門氏菌aroA基因缺失株△aroA的鑒定

以質(zhì)粒pKD3為模板，通過(guò)Aro1和Aro2引物，擴(kuò)增出中間為氯霉素抗性基因，兩翼與aroA基因上下游序列同源的1 284 bp長(zhǎng)同源臂DNA片段（圖1）。用aroA基因兩側(cè)特異性引物P1，P2擴(kuò)增交換后的△aroA∶∶Cm基因組，以野生株c79-3基因組為對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)圖2。以野生株c79-3為模板的擴(kuò)增出了1 458 bp的條帶，而以△aroA∶∶Cm基因組為模板擴(kuò)增出了1 302 bp的aroA基因同源臂和Cm抗性基因替換片段。用aroA基因內(nèi)部特異性引物P3，P4擴(kuò)增抗性片段消除后的△aroA基因組，以野生株c79-3基因組為對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)圖3，以c79-3基因組為模板擴(kuò)增出了大小為461 bp的部分aroA基因特異性條帶，而以△aroA基因組為模板未擴(kuò)增出aroA基因特異性條帶。且以aroA基因兩側(cè)引物P1、P2擴(kuò)增測(cè)序結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)雞白痢沙門菌aroA基因缺失株△aroA構(gòu)建成功。

2.2 △aroA的遺傳穩(wěn)定性

分別以平板代傳代培養(yǎng)到第5、10、15、20的△aroA和c79-3的基因組為模板，通過(guò)aroA基因內(nèi)部特異性引物P3、P4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)定△aroA的遺傳穩(wěn)定性。由圖4可知，野生株c79-3的PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣顯示出大小為461 bp的特異性條帶，而在傳代的△aroA菌株P(guān)CR產(chǎn)物中均沒(méi)有特異性條帶擴(kuò)出。說(shuō)明在傳至第20代時(shí)，aroA基因沒(méi)有回復(fù)，證明△aroA具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

2.3 △aroA的生長(zhǎng)特性

LB劃線培養(yǎng)的c79-3和△aroA生長(zhǎng)速度有差異，同時(shí)劃線培養(yǎng)的野生株在LB平板上菌落明顯大于aroA基因缺失株（圖5），生長(zhǎng)曲線顯示，在初始的8 h內(nèi)野生株和aroA基因缺失株生長(zhǎng)速度基本一致，在8 h之后野生株生長(zhǎng)速度大于缺失株，說(shuō)明aroA基因的缺失影響雞白痢沙門菌c79-3的生長(zhǎng)（圖6）。

2.4 △aroA對(duì)雛雞的毒力試驗(yàn)

A組攻毒c79-3的10只雛雞在第四天死亡4只，死亡率為40%，雛雞出現(xiàn)萎靡，下痢等癥狀；B組攻毒△aroA的10只雛雞未發(fā)生死亡（圖7），癥狀較A組輕，說(shuō)明aroA基因缺失后，其毒性發(fā)生下降。

3 討論

本試驗(yàn)利用λ-red同源重組技術(shù)構(gòu)建了雞白痢沙門氏菌株c79-3的aroA基因缺失株△aroA。生長(zhǎng)特性鑒定結(jié)果表明，aroA基因缺失后在LB平板上生長(zhǎng)速度變慢，同時(shí)接種的aroA缺失株菌落明顯小于野生株，需20 h方可見(jiàn)明顯單菌落。在LB肉湯里生長(zhǎng)測(cè)定生長(zhǎng)曲線時(shí)，前8 h通過(guò)OD600 nm判斷野生株和缺失株生長(zhǎng)速度沒(méi)有差異，在8 h后野生株生長(zhǎng)速度超過(guò)aroA基因缺失株。推測(cè)平板劃線結(jié)果與生長(zhǎng)曲線測(cè)定前期有差異可能是在平板上生長(zhǎng)時(shí)初期菌落較小，肉眼無(wú)法辨別出差異有關(guān)，后期隨著菌落繼續(xù)生長(zhǎng)，出現(xiàn)了野生株菌落大于缺失株，與生長(zhǎng)曲線結(jié)果相一致。aroA編碼5-烯醇丙酮酞莽草酸-3-磷酸合成酶，該酶催化芳香族氨基酸的合成，參與代謝途徑過(guò)程[11-12]，其生長(zhǎng)特性變慢可能是由于aroA基因的缺失導(dǎo)致芳香族氨基酸合成受阻，影響了細(xì)菌的生長(zhǎng)。毒力試驗(yàn)結(jié)果表明，aroA基因缺失后，雞白痢沙門菌對(duì)雛雞的的致病性顯著下降，推測(cè)由于aroA基因的缺失，雞白痢沙門氏菌的生長(zhǎng)與環(huán)境適應(yīng)能力受限，從而使得菌株的毒力下降。

隨著分子克隆技術(shù)越來(lái)越成熟，由aroA缺失導(dǎo)致的芳香族氨基酸營(yíng)養(yǎng)缺陷得到越來(lái)越多的關(guān)注。Malcova[13]在腸炎沙門氏菌、Sebkova[14]在腸炎、鼠傷寒沙門氏菌上構(gòu)建aro基因的缺失弱毒苗，結(jié)果表明芳香族氨基酸合成相關(guān)基因的阻斷獲得的減毒菌株在雞、小鼠等動(dòng)物體上使用能獲得較好的免疫保護(hù)效果。本試驗(yàn)以強(qiáng)毒株C79-3為親本，通過(guò)λ-red同源重組系統(tǒng)成功構(gòu)建了雞白痢沙門氏菌aroA基因缺失株，致病性相比親本株有明顯下降，然而后期試驗(yàn)顯示高劑量感染突變菌株仍能造成少量雛雞死亡。楊林等[15]的研究顯示不同親本菌株缺失aroA基因后致病性的下降程度具有一定的差異，本試驗(yàn)構(gòu)建的aroA缺失株并未完全喪失致病性，可能與本試驗(yàn)所用的親本株毒力較強(qiáng)有關(guān)?？梢?jiàn)單獨(dú)缺失雞白痢沙門氏菌強(qiáng)毒菌株c79-3的aroA基因，其致弱效果還未達(dá)到弱毒疫苗的要求，可以在保持較好免疫原性的前提上，嘗試在△aroA基礎(chǔ)上繼續(xù)缺失其它營(yíng)養(yǎng)性基因或毒力基因，獲得具有更高免疫原性的減毒活疫苗候選株。本試驗(yàn)為下一步研究雞白痢沙門氏菌aroA基因缺失株的功能和基于aroA基因缺失的雞白痢沙門氏菌減毒活疫苗奠定了基礎(chǔ)。

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