盧順++高其雙++彭霞+劉武+陳潔++陶弼菲+陳志華+童偉文+周莉+華娟++王連芳

摘要：為研究鴨防御素的真核表達(dá)，人工合成了鴨防御素AvBD2、AvBD10和AvBD12基因，并將其插入到真核表達(dá)質(zhì)粒pDoubleEx-EGFP-flag-N中構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒；重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定正確后，分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，用RT-PCR和Westem-blot鑒定目的基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明，酶切鑒定證實(shí)目的基因成功插入到真核表達(dá)質(zhì)粒中；真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞24 h后，在熒光顯微鏡下可見(jiàn)綠熒光蛋白表達(dá)；RT-PCR能檢測(cè)到目的基因mRNA，但Western-blot沒(méi)有檢測(cè)到目的蛋白的表達(dá)條帶。

關(guān)鍵詞：鴨防御素；真核表達(dá)；HEK293細(xì)胞

中圖分類(lèi)號(hào)：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）24-6597-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.24.068

由于抗生素易導(dǎo)致藥物殘留、病原耐藥性等問(wèn)題，人們希望研發(fā)出安全有效的抗菌肽類(lèi)藥物，替代部分抗生素的使用。禽類(lèi)防御素（Avian beta defensin，AvBD）作為一類(lèi)重要的內(nèi)源性抗菌肽，具有廣譜的抗菌活性和免疫調(diào)節(jié)功能[1]，在禽類(lèi)先天性免疫和獲得性免疫中均發(fā)揮著重要作用。因此，禽類(lèi)防御素極具新藥開(kāi)發(fā)價(jià)值，有望用于畜禽疾病的防控。

目前，人們已在家禽及某些野禽中發(fā)現(xiàn)了數(shù)十種禽類(lèi)防御素，并且在大腸桿菌或酵母菌中成功表達(dá)了多種禽類(lèi)防御素。然而，關(guān)于禽類(lèi)防御素在動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的報(bào)道卻很少。理論上，動(dòng)物細(xì)胞能為表達(dá)蛋白提供更好地表達(dá)后加工和修飾，是表達(dá)具有天然活性蛋白的最佳宿主[2]。如果能用動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)禽類(lèi)防御素，將為禽類(lèi)防御素的研究和應(yīng)用提供幫助。本研究根據(jù)GenBank中已發(fā)布的鴨防御素基因序列，人工合成了3種鴨防御素AvBD2、AvBD10和AvBD12基因，并構(gòu)建其真核表達(dá)載體，在HEK293細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)研究，為鴨防御素在動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)提供了參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、菌株與質(zhì)粒

HEK293細(xì)胞及真核表達(dá)質(zhì)粒pDoubleEx-EGFP-flag-N由長(zhǎng)沙贏潤(rùn)生物技術(shù)有限公司提供；大腸桿菌DH5？琢感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；表達(dá)豬β防御素1（PBD1）的重組質(zhì)粒pDoubleEx-EGFP-flag-N-PBD1由武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所構(gòu)建。

1.2 主要試劑

限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker和蛋白質(zhì)Marker等分子生物學(xué)試劑購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；DNA凝膠回收試劑盒、RNA提取試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；flag標(biāo)簽抗體購(gòu)美國(guó)CMC公司；HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG二抗購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamin 2000購(gòu)自Invitrogen公司；PCR用試劑購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；牛血清和細(xì)胞培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品；其他常規(guī)試劑為分析純。

1.3 方法

1.3.1 鴨防御素基因的人工合成 根據(jù)GenBank上公布的序列信息，人工合成鴨防御素AvBD2（登錄號(hào)AY641439.1）、AvBD10（登錄號(hào)XM_005028240.1）

和AvBD12（登錄號(hào)KR018387.1）基因片段，并在基因片段兩端引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)。基因合成后連接大腸桿菌克隆載體pUC57-Simple，測(cè)序驗(yàn)證合成的序列是否正確。

1.3.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)將合成的基因片段進(jìn)行雙酶切，用DNA凝膠回收試劑盒回收酶切后的基因片段。同法回收酶切后的真核表達(dá)質(zhì)粒，按如下反應(yīng)體系和條件進(jìn)行連接反應(yīng)：10×T4 DNA Ligase Buffer 1.0 μL，T4 DNA Ligase 1.0 μL，回收的pDoubleEx-EGFP-flag-N質(zhì)粒0.7 μL，回收的AvBD基因片段7.3 μL，總反應(yīng)體積10.0 μL，16 ℃恒溫水浴中連接過(guò)夜。

1.3.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的提取與酶切鑒定 取大腸桿菌DH5？琢感受態(tài)細(xì)胞100 μL，加入連接產(chǎn)物5 μL并混勻，置冰上10 min后，42 ℃水浴熱激90 s，隨即冰浴2 min；加入500 μL LB培養(yǎng)基，恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)30 min使其復(fù)蘇；復(fù)蘇后的菌液10 000 r/min離心2 min，棄去500 μL上清液，用剩余的100 μL重懸菌體，涂布于含有25 μg/mL卡那霉素的LB瓊脂平板上；37 ℃倒置培養(yǎng)12～16 h，直至長(zhǎng)出單菌落；挑取平板上長(zhǎng)出的單菌落，接種到含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)約8 h。取培養(yǎng)后的菌液，用質(zhì)粒小提試劑盒提取重組表達(dá)質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定。酶切鑒定的反應(yīng)體系：10×K Buffer 2.0 μL，NheⅠ 1.0 μL，EcoRⅠ 1.0 μL，重組表達(dá)質(zhì)粒12.0 μL，加ddH2O至20.0 μL。37 ℃酶切4 h后，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切結(jié)果。

1.3.4 細(xì)胞培養(yǎng)與重組表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HEK293細(xì)胞用胰酶消化，稀釋到1×105個(gè)/mL，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔2 mL。置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱（含5%的CO2）中培養(yǎng)18～24 h至80%細(xì)胞匯合。轉(zhuǎn)染前棄去培養(yǎng)液，用OPTI-MEM洗滌一次。按轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamin 2000說(shuō)明書(shū)中的步驟，將重組表達(dá)質(zhì)粒、Lipofectamin 2000試劑分別用OPTI-MEM稀釋?zhuān)缓蠡旌?，轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6 h后，更換含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（不含雙抗），置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3.5 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中目的基因mRNA的檢測(cè) 離心收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，用RNA提取試劑盒抽提細(xì)胞總RNA。用DU640型核酸/蛋白測(cè)定儀測(cè)定核酸濃度，稀釋RNA濃度至100 μg/mL。用一步法RT-PCR試劑檢測(cè)目的基因mRNA，反應(yīng)體系：2×One step Mix 12.5 μL，one step Enzyme Mix 1.25 μL，上游引物（10 μmol/L）1 μL，下游引物（10 μmol/L） 1 μL，RNA模板1 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)條件：50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min；94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。取PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并照像。PCR檢測(cè)所用引物及擴(kuò)增片段見(jiàn)表1。

1.3.6 表達(dá)蛋白的鏡檢和Western-blot鑒定 轉(zhuǎn)染24 h后，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于倒置熒光顯微鏡下，觀(guān)察細(xì)胞是否有綠色熒光。收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞和培養(yǎng)液，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上；封閉液封閉1 h后，與1∶1 000稀釋的抗flag標(biāo)簽單抗37 ℃溫育1 h；TBST室溫洗膜3次后，與1∶1 000稀釋的羊抗鼠IgG（HRP標(biāo)記）37 ℃孵育45 min；洗膜4次后，加入底物液顯色；用濾紙吸去多余的底物液，覆上保鮮膜，X光膠片壓片后依次放入顯影液顯影、定影液定影、照相。試驗(yàn)中設(shè)置轉(zhuǎn)染pDoubleEx-EGFP-flag-N-PBD1質(zhì)粒的細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照，設(shè)置β-actin抗體組作為內(nèi)參。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶酶切并回收人工合成優(yōu)化后的鴨防御素基因片段，將其插入到pDoubleEx-EGFP-flag-N質(zhì)粒中構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒分別用NheⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行酶切鑒定，均可得到約6 400 bp和800 bp兩條DNA片段，片段均與預(yù)期片段大小相符（圖1），表明基因片段已插入到真核表達(dá)質(zhì)粒中。

2.2 鴨防御素mRNA檢測(cè)

一步法RT-PCR結(jié)果表明，以轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞總RNA為模板，能擴(kuò)增出大小約200 bp的特異性片段，未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞不能擴(kuò)增到特異性片段（圖2），表明插入的鴨防御素基因在細(xì)胞中得到轉(zhuǎn)錄。

2.3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的鏡檢

轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒36 h后，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)良好，基本鋪滿(mǎn)孔底。在熒光顯微鏡下，轉(zhuǎn)染細(xì)胞發(fā)出綠色熒光（圖3）。未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞在熒光顯微鏡下無(wú)熒光。表明重組質(zhì)粒被成功轉(zhuǎn)入HEK293細(xì)胞，報(bào)告基因EGFP（增強(qiáng)型綠熒光蛋白）已表達(dá)。

2.4 重組蛋白的Western-blot鑒定

轉(zhuǎn)染重組表達(dá)質(zhì)粒的293細(xì)胞經(jīng)Western-blot鑒定，結(jié)果表明，3種鴨AvBDs重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞均無(wú)明顯的表達(dá)帶，PBD1表達(dá)帶和β-actin表達(dá)帶明顯，結(jié)果見(jiàn)圖4，這表明3種鴨防御素未能在293細(xì)胞中表達(dá)或其表達(dá)量極低。

3 討論

禽類(lèi)防御素是禽類(lèi)天然免疫系統(tǒng)的一部分，在抵御病原微生物的侵襲中發(fā)揮著重要作用[3]。研究表明，禽類(lèi)防御素對(duì)大腸桿菌、葡萄球菌、沙門(mén)氏菌和某些病毒具有抑制作用[4]。人們對(duì)禽類(lèi)防御素的分子結(jié)構(gòu)、生物學(xué)特性、抗微生物機(jī)理和應(yīng)用正進(jìn)行著越來(lái)越深入的研究。由于禽類(lèi)防御素天然產(chǎn)量低，從機(jī)體中提取天然產(chǎn)物的過(guò)程復(fù)雜且產(chǎn)量低，這使得從人工表達(dá)及轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)等方面對(duì)禽類(lèi)防御素進(jìn)行研究成為重點(diǎn)。目前，已報(bào)道有雞防御素[5]、鴨防御素[6]、鵝防御素[7]、鵪鶉防御素[8]等禽類(lèi)防御素獲得了表達(dá)。然而，這些研究多是利用大腸桿菌或酵母菌等為表達(dá)系統(tǒng)。關(guān)于禽類(lèi)防御素在動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)很少報(bào)道。動(dòng)物細(xì)胞是否適合表達(dá)禽類(lèi)防御素還有待研究。2010年，侯淑倩[9]報(bào)道了雞β-防御素-5在COS7細(xì)胞中的表達(dá)，但僅從mRNA水平檢測(cè)了防御素的表達(dá)情況；2011年，單艷菊等[10]利用Flp-In-293細(xì)胞表達(dá)雞β-防御素-1，也未從蛋白質(zhì)水平對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。本研究構(gòu)建了表達(dá)鴨防御素AvBD2、AvBD10和AvBD12的真核表達(dá)載體，并在動(dòng)物細(xì)胞HEK293中對(duì)這3種防御素進(jìn)行了表達(dá)。通過(guò)檢測(cè)這3種防御素的mRNA，證實(shí)外源防御素基因成功轉(zhuǎn)錄，然而用Western-blot并沒(méi)有檢測(cè)到相應(yīng)的蛋白質(zhì)。這可能暗示用動(dòng)物細(xì)胞大量表達(dá)禽類(lèi)防御素存在一些尚待解決的技術(shù)問(wèn)題。

本研究中的禽類(lèi)防御素未能大量表達(dá)的原因可能有3方面：①禽類(lèi)防御素分子為堿性小肽，易被蛋白酶降解[11]。目前，大部分研究采用融合表達(dá)或串聯(lián)表達(dá)的方法來(lái)表達(dá)防御素。這些表達(dá)方法可以人為增大表達(dá)蛋白的分子質(zhì)量，并使其更容易形成包涵體，從而達(dá)到保護(hù)表達(dá)蛋白不被蛋白酶降解的目的。本研究為了保證防御素分子的高仿真性，只在目的蛋白的末端融合了flag標(biāo)簽（共8個(gè)氨基酸），對(duì)分子量的改變較小。②外源基因在轉(zhuǎn)錄后可能發(fā)生基因沉默[12]，這是外源基因在表達(dá)過(guò)程中時(shí)常發(fā)生的現(xiàn)象。由于本研究中檢測(cè)到了3種禽類(lèi)防御素的mRNA，但未檢出目的蛋白，因此推測(cè)可能發(fā)生了轉(zhuǎn)錄后基因沉默。宿主細(xì)胞中的一些RNA分子，比如細(xì)胞自身轉(zhuǎn)錄的某些防御素mRNA，可能對(duì)鴨防御素的mRNA造成了干擾，導(dǎo)致無(wú)法正常翻譯。③外源的禽類(lèi)防御素可能對(duì)宿主細(xì)胞HEK293產(chǎn)生毒性作用，導(dǎo)致無(wú)法正常表達(dá)。已證實(shí)防御素對(duì)某些動(dòng)物細(xì)胞具有一定的毒性作用，例如人β-防御素2對(duì)口腔癌KB細(xì)胞具有抑制作用[13]。

本研究構(gòu)建了3種鴨防御素的真核表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞行表達(dá)，并從RNA水平和蛋白質(zhì)水平對(duì)目的基因的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)。雖然表達(dá)未能成功，但為今后禽類(lèi)防御素的表達(dá)研究提供了參考。

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