徐旺燁++樊琛++李一經(jīng)

摘要：采用流式細(xì)胞術(shù)法對大腸桿菌的血清抗性進(jìn)行檢測，并與傳統(tǒng)涂板法相比較，探討流式細(xì)胞術(shù)在血清抗性檢測方法中的應(yīng)用。結(jié)果表明，兩者呈正相關(guān)關(guān)系（P=0.034<0.05），流式細(xì)胞術(shù)法可以代替涂板法對大腸桿菌的血清抗性進(jìn)行檢測。該方法可以減少由于涂板不均勻、人工計數(shù)等造成的誤差，且易操作、計算少、耗時少，數(shù)據(jù)更準(zhǔn)確。

關(guān)鍵詞：血清抗性；涂板法；流式細(xì)胞術(shù)法

中圖分類號：S858.31 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）21-5571-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.21.033

Comparison and Analysis of Two Methods of Serum Resistance Tests

XU Wang-ye1，F(xiàn)AN Chen2，LI Yi-jing1

（1.College of Veterinary Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China；

2.Agricultural College of Liaocheng University， Liaocheng 252059，Shandong，China）

Abstract： Flow cytometry and plating method were used to detect serum resistance of Escherichia coli. The results showed that there was a positive correlation between flow cytometry and conventional plating method（P=0.034<0.05）. The flow cytometry method can replace plating to test the serum resistance of E. coli. The method can reduce the error beause of uneven plating and counting by eyes. In comparison with plating method， this flow cytometry had less calculation and takes less time，but accurater data.

Key words： serum resistance； plating method； method of flow cytometry

大腸桿菌是自然環(huán)境中的常在菌，處于溫血動物腸道下段[1]，一般不會致病，但當(dāng)飼養(yǎng)環(huán)境差，通風(fēng)不好，營養(yǎng)缺乏或應(yīng)激等情況出現(xiàn)會誘發(fā)雞大腸桿菌病[2]。雞大腸桿菌病的主要病型有腹瀉、心包炎、眼炎、腹膜炎和輸卵管炎、臍炎等[3]。雞大腸桿菌病是集約化養(yǎng)殖廠經(jīng)常發(fā)生的一類疾病，多危害雛雞，死亡率為5%～50%[4]，造成經(jīng)濟(jì)損失。大腸桿菌致病過程為：大腸桿菌在呼吸道上皮或腸黏膜上皮黏附聚集定殖，進(jìn)一步a侵染機(jī)體并增殖，再進(jìn)入血液循環(huán)，形成全身性感染。當(dāng)大腸桿菌進(jìn)入血液后，將面對來自于血液如溶菌素、補(bǔ)體等物質(zhì)的殺菌作用，此時大腸桿菌對血清的抵御能力將關(guān)系到其能否進(jìn)一步擴(kuò)大對宿主機(jī)體的感染程度。Iss基因（Increased serum survival gene，Iss）的作用是增強(qiáng)大腸桿菌在血清中的存活能力，是大腸桿菌的重要毒力基因之一[5]。此外，外膜蛋白也具有抵抗血清殺菌作用的能力[6]。有學(xué)者通過檢測吸光度的變化來衡量大腸桿菌的血清抗性[7]，此種方法相對粗糙。通常都使用涂板的方法對大腸桿菌的血清抗性進(jìn)行檢測[8，9]，本研究提供一種基于流式細(xì)胞術(shù)的方法來檢測大腸桿菌的血清抗性，與傳統(tǒng)的涂板法進(jìn)行比較來驗證其可靠程度及優(yōu)勢。

1 材料與方法

1.1 菌株

檢測的20株大腸桿菌均為東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院保存菌株。

1.2 血清

血清為SPF雞血清。

1.3 染料

LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits購自賽默飛世爾科技公司。

1.4 涂板法

用接種環(huán)挑取平板上的單菌落，在LB液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)至對數(shù)期。取500 μL菌液5 000 r/min離心2 min，棄掉上清液，用生理鹽水洗1～2次，重懸于0.9%的生理鹽水，倍比稀釋。再將100 μL細(xì)菌懸液與400 μL血清相混合，37 ℃溫育2 h，分別于0、2 h取樣平板計數(shù)。平行2次取平均值，計算2 h與0 h活菌數(shù)比值[10，11]。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)法

血清抗性檢測通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測，將大腸桿菌劃線培養(yǎng)，挑取單菌落于液體LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至約108 CFU/mL，然后離心，經(jīng)生理鹽水漂洗2次，并用PBS懸浮、倍比稀釋。將100 μL含有約107 CFU大腸桿菌的稀釋液加入含有SPF雞血清的生理鹽水溶液中（終濃度為10%），37 ℃水浴1 h， 12 000 r/min離心3 min，棄上清，加入500 μL生理鹽水，再加入預(yù)先混合好的染料（A液∶B液=1∶1）1.5 μL，混勻，避光染色15 min，再通過流式細(xì)胞儀檢測，檢測結(jié)果用活菌數(shù)與全菌體比值。

2 結(jié)果與分析

涂板法計算使用血清處理前后平板上活菌數(shù)的比值。流式細(xì)胞術(shù)法計算活菌和全菌體的比值。通過統(tǒng)計軟件計算90%置信區(qū)間，流式細(xì)胞術(shù)法結(jié)果為（0.57，0.75），涂板法結(jié)果為（1.12，8.06）。在流式細(xì)胞術(shù)法中，血清敏感的菌株為1、7、8、14、16、17，中等敏感的菌株為11、15、18、19，血清抗性菌株為2、3、4、5、6、9、10、12、13、20。在涂板法中，血清敏感的菌株為1、7、8、10、11、13、14、15、16、17、18、19、20，中等敏感的菌株為2、3、9、12，血清抗性菌株為4、5、6。流式細(xì)胞術(shù)法95%置信區(qū)間為（0.58，0.78），血清敏感的菌株為1、7、8、14、16、17，中等敏感的菌株為3、11、13、15、18、19，血清抗性菌株為2、4、5、6、9、10、12、20。通過SPSS軟件分析，二者顯著正相關(guān)（P=0.034<0.05），說明流式細(xì)胞術(shù)檢測方法是可行的，結(jié)果如表1所示。

3 討論

流式細(xì)胞術(shù)使用的染料是基于PI和SYTO 9的原理對大腸桿菌進(jìn)行染色，然后通過流式細(xì)胞術(shù)的方法進(jìn)行檢測。由于血清黏性較大，使用流式細(xì)胞術(shù)的方法進(jìn)行檢測時，離心及檢測不易操作，故兩種方法使用的血清濃度不同。但從兩種方法的結(jié)果來看，使用涂板法檢測的菌，有5株在血清處理后存活者很少，這幾株菌相對的流式細(xì)胞術(shù)法檢測的數(shù)值也較低，但不接近0，這是因為涂板法使用的血清濃度較大、作用時間較長，故對大腸桿菌的殺傷程度也較大。通過統(tǒng)計軟件分別分析兩種方法得到的結(jié)果90%置信區(qū)間，結(jié)果顯示：流式細(xì)胞術(shù)的血清敏感菌株有6株，中等敏感的有4株，血清抗性的有10株；涂板法血清敏感的有13株，中等敏感的有4株，血清抗性的有3株。但是通過統(tǒng)計軟件分析，二者呈顯著正相關(guān)（P=0.034<0.05）。這說明，雖然使用的血清濃度不同，但血清對于大腸桿菌的殺傷作用趨勢還是一致的。故流式細(xì)胞術(shù)法可以代替涂板法來進(jìn)行血清抗性的檢測。計算流式細(xì)胞術(shù)法95%置信區(qū)間，得到結(jié)果為（0.58，0.78），血清敏感菌株有6株，中等敏感的有6株，血清抗性的有8株。結(jié)果顯示，置信區(qū)間的取值影響菌株血清抗性/敏感的判定。在實際應(yīng)用中可根據(jù)實驗需要，調(diào)整置信區(qū)間取值。

血清抗性是大腸桿菌毒力的重要組成部分，對于血清抗性的檢測，也是檢驗大腸桿菌毒力的重要指標(biāo)之一。對大腸桿菌使用涂板的方法檢測大腸桿菌對血清的抵抗能力的方法較為繁瑣，且涂板過程中容易受到涂得不均勻等因素的影響造成誤差，對于單菌落的計數(shù)也比較費時費力，但對實驗器材要求低，價格便宜。采用流式細(xì)胞術(shù)的方法來檢測大腸桿菌的血清抗性，避免了涂板的操作誤差、人工計數(shù)的誤差，計算簡單、準(zhǔn)確，操作簡便、省時省力。只是流式細(xì)胞術(shù)的方法需要特殊儀器及染料，價格相對昂貴。

參考文獻(xiàn)：

[1] 黃 熙，鄧小玲，黃 瓊，等.2011年德國O104∶H4腸出血性大腸桿菌感染暴發(fā)疫情報告[J].中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2011，45（12）：1133-1136.

[2] 錢 晨，顧 艷，楊建泉.揚州市郊區(qū)雞大腸桿菌病的流行病學(xué)調(diào)查及診治[J].中國家禽，2005，27（18）：27-28.

[3] 湯小敏，呂亞輝.雞大腸桿菌病防治[J].畜牧獸醫(yī)雜志，2012， 31（5）：125-127.

[4] 榮 祿，鄺.禽病學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1997.

[5] BINNS M M，DAVIES D L，HARDY K G.Cloned fragments of the plasmid ColV，I-K94 specifying virulence and serum resistance[J].Nature，1979，279（5716）：778-781.

[6] NOLAN L K，WOOLEY R E，GIDDINGS C W，et al. Characterization of an avirulent mutant of a virulent avian Escherichia coli isolate[J].Avian Diseases，1994，38（1）：146-150.

[7] SALARI S，SALEHI T Z，F(xiàn)ASAEI B N，et al. Construction of an iss deleted mutant strain from a native avian pathogenic Escherichia coli O78∶K80 and in vitro serum resistance evaluation of mutant[J].Iranian Journal of Veterinary Medicine，2014， 8（1）：1-8.

[8] DISSANAYAKE D R A，WIJEWARDANA T G，GUNAWARDENA G A，et al. Distribution of lipopolysaccharide core types among avian pathogenic Escherichia coli in relation to the major phylogenetic group[J].Veterinary Microbiology，2008， 132（s3-4）：355-363.

[9] CHUBA P J，LEON M A，BANERJEE A，et al. Cloning and DNA sequence of plasmid determinant iss，coding for increased serum survival and surface exclusion，which has homology with lambda DNA[J].Molecular & General Genetics Mgg，1989， 216（2-3）：287-292.

[10] 樊 琛，劉桂芹，王 宇，等.雞源致病性大腸桿菌iss基因原核表達(dá)產(chǎn)物的免疫保護(hù)作用[J].畜牧與獸醫(yī)，2010，42（11）：84-86.

[11] 李貴蕭，朱宗濤，康燕青，等.雞大腸桿菌的血清抗性與致病性檢驗[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015（11）：301-303.