高全清，沙馬阿直

1.核工業(yè)416醫(yī)院心內(nèi)科 (成都610051),2.解放軍第5醫(yī)院心內(nèi)科(銀川750004)

紅景天苷改善血管內(nèi)皮舒縮功能實(shí)驗(yàn)研究

高全清1，沙馬阿直2

1.核工業(yè)416醫(yī)院心內(nèi)科 (成都610051),2.解放軍第5醫(yī)院心內(nèi)科(銀川750004)

目的：研究低氧環(huán)境下紅景天苷對血管內(nèi)皮細(xì)胞舒縮功能的影響及其機(jī)制。 方法：空白對照組內(nèi)皮細(xì)胞暴露正常氧環(huán)境，低氧組、低氧和紅景天苷干預(yù)組血管內(nèi)皮細(xì)胞暴露于低氧環(huán)境，檢測血管內(nèi)皮細(xì)胞HIF-1α、內(nèi)皮素-1、血管內(nèi)皮NO合成酶基因的表達(dá)變化。同時(shí)檢測采用siRNA干擾HIF-1α后內(nèi)皮舒縮因子表達(dá)變化。 結(jié)果：與空白對照組比較，低氧組血管內(nèi)皮細(xì)胞HIF-1α、內(nèi)皮素-1表達(dá)顯著增加(P<0.05)，而血管內(nèi)皮NO合成酶表達(dá)下降(P<0.05)；與低氧組比較，低氧及紅景天苷干預(yù)組血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞HIF-1α、內(nèi)皮素-1表達(dá)受抑制(P<0.05)，而血管內(nèi)皮NO合成酶表達(dá)增加(P<0.05)。siRNA干擾HIF-1α顯示，紅景天苷通過調(diào)控HIF-1α調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞舒縮功能(P<0.05)。結(jié)論：紅景天苷通過抑制HIF-1α基因表達(dá)，抑制血管內(nèi)皮收縮因子表達(dá)及促進(jìn)血管內(nèi)皮舒張因子表達(dá)，從而改善血管內(nèi)皮舒縮功能。

缺氧性肺動脈高壓的主要病理機(jī)制是缺氧性肺血管收縮及肺循環(huán)重塑。血管內(nèi)皮細(xì)胞對血管舒縮功能發(fā)揮著重要作用[1]。內(nèi)皮素(Endothelin,ET)是一種多效性內(nèi)皮依賴性縮血管因子，內(nèi)皮素有3個(gè)同分異構(gòu)體家族,即ET-1、ET-2、ET-3，其中對于心血管起主要作用的是ET-1。內(nèi)皮細(xì)胞受到腎上腺素、血栓素、血管加壓素、血管緊張素以及血管壁剪切力與壓力的變化及缺氧等物理化因素刺激后合成并釋放ET-1[2]。同時(shí)缺氧抑制血管內(nèi)皮舒張因子NO合成酶(Endothelial nitric oxide synthase,eNOS)表達(dá)[3]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)是具有轉(zhuǎn)錄活性的核蛋白,參與缺氧適應(yīng)、炎癥發(fā)展及腫瘤生長等相關(guān)基因的調(diào)控。HIF-1α與靶基因結(jié)合后,通過轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控使機(jī)體產(chǎn)生一系列反應(yīng), HIF-1α過度表達(dá)會給機(jī)體帶來病理性損害,如低氧性肺動脈高壓、腫瘤加速生長等[4]。

紅景天為多年生草本植物，主要生長在海拔1600～4000 m的高寒、干燥、缺氧、強(qiáng)紫外線照射、晝夜溫差大的地區(qū)，具有極強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力和生命力，紅景天被廣泛運(yùn)用于高原反應(yīng)的預(yù)防和治療。紅景天苷是從景天科植物大株紅景天的干燥根及根莖或干燥全草中提取的一種化合物，是紅景天的主要有效成分。研究顯示,紅景天苷有預(yù)防腫瘤、增強(qiáng)免疫功能、延緩衰老、抗疲勞、抗缺氧、防輻射、雙向調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)、修復(fù)保護(hù)機(jī)體等作用[5-6]。本研究觀察缺氧環(huán)境中紅景天苷對血管內(nèi)皮細(xì)胞舒縮功能相關(guān)因子的影響，探討紅景天苷治療高原性肺動脈高壓的具體機(jī)制。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)材料 內(nèi)皮細(xì)胞株HUVEC(購自于中國AllCells公司)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中。紅景天苷(購買于美國Sigma公司)用無血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液制成300 mmol/L試劑?？俁NA提取試劑、RNAiso Reagent、Prime Script RT試劑盒、SYBR-PCR試劑盒(Takara，日本)， Western blot試劑購自Beyotime生物技術(shù)研究所(中國)。

2 方 法

2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：將內(nèi)皮細(xì)胞分為空白對照組、低氧組、低氧及紅景天組，空白對照組內(nèi)皮細(xì)胞于常氧狀態(tài)(氧含量21%)下培養(yǎng)，低氧干預(yù)組、低氧和紅景天苷共同干預(yù)組內(nèi)皮細(xì)胞置于低氧環(huán)境(氧含量10%)下培養(yǎng)，其中低氧和紅景天苷共同干預(yù)組內(nèi)皮細(xì)胞中加入終濃度為300μmol/L的紅景天苷。

2.2 內(nèi)皮細(xì)胞舒縮功能相關(guān)基因mRNA表達(dá)變化：空白對照組、低氧干預(yù)組、低氧和紅景天苷共同干預(yù)組內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)24h后，采用熒光定量PCR檢測HIF-1α、ET-1、eNOS基因mRNA表達(dá)變化。

2.3 Western blotting檢測內(nèi)皮細(xì)胞舒縮功能相關(guān)基因蛋白表達(dá)變化：空白對照組、低氧干預(yù)組、低氧和紅景天苷共同干預(yù)組內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，分別提取內(nèi)皮細(xì)胞總蛋白。使用兔抗HIF-1α、ET-1、eNOS的特異性抗體(Abcam公司，美國) ，羊抗兔二抗(Abcam公司，美國)對提取蛋白樣品進(jìn)行Western免疫印跡分析(12%SDS-PAGE；每泳道30μg蛋白)。應(yīng)用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白質(zhì)條帶灰度值變化。

2.4 siRNA干擾HIF-1α實(shí)驗(yàn)：低氧干預(yù)組、低氧和紅景天苷共同干預(yù)組、低氧和siRNA HIF-1α 共同干預(yù)組置于低氧環(huán)境中培養(yǎng)96h。之后分別提取總蛋白，Western blotting法檢測HIF-1α、ET-1、eNOS基因蛋白表達(dá)變化。

結(jié) 果

1 紅景天苷對內(nèi)皮細(xì)胞舒縮功能相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響 與空白對照組比較，低氧組內(nèi)皮細(xì)胞HIF-1α、ET-1基因mRNA表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05)，而縮血管相關(guān)因子eNOS基因mRNA表達(dá)下降(P<0.05)；與低氧組比較，低氧及紅景天苷干預(yù)組內(nèi)皮細(xì)胞HIF-1α、ET-1基因mRNA表達(dá)受抑制(P<0.05)，而縮血管相關(guān)因子eNOS基因mRNA表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05)(圖1)。

圖1 紅景天苷對內(nèi)皮細(xì)胞舒縮功能相關(guān)基因mRNA表達(dá)影響

2 紅景天苷對內(nèi)皮細(xì)胞舒縮功能相關(guān)基因蛋白表達(dá)的影響 與空白對照組比較，低氧組內(nèi)皮細(xì)胞HIF-1α、ET-1基因蛋白表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05)，而縮血管相關(guān)因子eNOS基因蛋白表達(dá)下降(P<0.05)；與低氧組比較，低氧及紅景天苷干預(yù)組內(nèi)皮細(xì)胞HIF-1α、ET-1基因蛋白表達(dá)受抑制(P<0.05)，而縮血管相關(guān)因子eNOS基因蛋白表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05)(圖2)。

圖2 紅景天苷對內(nèi)皮細(xì)胞舒縮功能相關(guān)基因蛋白表達(dá)影響

3 缺氧誘導(dǎo)因子-1α參與紅景天苷對內(nèi)皮細(xì)胞舒縮功能的調(diào)控 與低氧組比較，低氧及紅景天苷干預(yù)組和低氧及siRNA HIF-1α干擾組的內(nèi)皮細(xì)胞HIF-1α、ET-1基因蛋白表達(dá)均受到抑制(P<0.05)，而縮血管相關(guān)因子eNOS基因mRNA表達(dá)均增強(qiáng)(P<0.05)(圖3)。

圖3 缺氧誘導(dǎo)因子-1α與紅景天苷對內(nèi)皮細(xì)胞舒縮功能調(diào)控

缺氧性肺動脈高壓(HPH)是一種慢性缺氧所致疾病，最終會導(dǎo)致右心衰竭。缺氧性肺動脈高壓是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過程，包括一系列相互關(guān)聯(lián)的事件，與血管平滑肌細(xì)胞增殖引起肺動脈血管重塑，肺部炎癥致白細(xì)胞粘附和聚集，血管內(nèi)皮細(xì)胞舒縮功能障礙等有關(guān)[7]。

紅景天是目前預(yù)防高原慢性缺氧所致高原反應(yīng)的常用藥物，研究表明紅景天能有效降低低氧對機(jī)體心血管系統(tǒng)功能的影響[8]。紅景天苷是紅景天的主要有效成分。本研究發(fā)現(xiàn)，紅景天苷能明顯改善低氧誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞舒縮功能障礙。與常氧環(huán)境比較，暴露于低氧環(huán)境時(shí)，低氧組內(nèi)皮細(xì)胞HIF-1α、ET-1基因mRNA表達(dá)增強(qiáng)，而縮血管相關(guān)因子eNOS基因mRNA表達(dá)下降；與低氧組比較，低氧及紅景天苷干預(yù)組內(nèi)皮細(xì)胞HIF-1α、ET-1基因mRNA表達(dá)受抑制，而縮血管相關(guān)因子eNOS基因mRNA表達(dá)增強(qiáng)。我們進(jìn)一步檢測了血管內(nèi)皮細(xì)胞舒縮功能相關(guān)基因蛋白表達(dá)變化。研究顯示，與常氧環(huán)境比較，暴露于低氧環(huán)境時(shí)，低氧組內(nèi)皮細(xì)胞HIF-1α、ET-1基因蛋白表達(dá)增強(qiáng)，而縮血管相關(guān)因子eNOS基因蛋白表達(dá)下降；與低氧組比較，低氧及紅景天苷干預(yù)組內(nèi)皮細(xì)胞HIF-1α、ET-1基因蛋白表達(dá)受抑制，而縮血管相關(guān)因子eNOS基因蛋白表達(dá)增強(qiáng)。這提示缺氧會導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞舒張相關(guān)基因表達(dá)受抑制，血管內(nèi)皮細(xì)胞收縮相關(guān)基因表達(dá)增強(qiáng)；而紅景天苷可明顯改善缺氧所致血管內(nèi)皮細(xì)胞舒縮功能。

HIF-1α 的表達(dá)依賴O2水平，在常氧狀態(tài)下HIF-1α 表達(dá)水平降低，在缺氧條件下，HIF-1α蛋白表達(dá)顯著增加，并調(diào)控缺氧適應(yīng)相關(guān)下游靶基因[4]。我們進(jìn)一步檢測了HIF-1α基因在紅景天苷改善缺氧所致血管內(nèi)皮細(xì)胞舒縮功能中的作用。與低氧組比較，低氧及紅景天苷干預(yù)組和低氧及siRNA HIF-1α干擾組的內(nèi)皮細(xì)胞HIF-1α、ET-1基因蛋白表達(dá)均受到抑制，而縮血管相關(guān)因子eNOS基因mRNA表達(dá)均增強(qiáng)。 這提示紅景天苷通過抑制HIF-1α基因表達(dá)，從而改善缺氧所致血管內(nèi)皮細(xì)胞舒縮功能障礙。

綜上所述，紅景天苷通過抑制HIF-1α基因表達(dá)，抑制血管內(nèi)皮收縮因子表達(dá)及促進(jìn)血管內(nèi)皮舒張因子表達(dá)，從而改善血管內(nèi)皮舒縮功能。

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(收稿：2015-12-05)

Salidroside improve the contraction and dilatation function of vascular endotheliocyte

Gao Quanqing,Sha Maazhi

Department of Cardiology, 416 Hospital of Nuclear Industry (Chengdu 610051)

Objective: To evaluate the effect of the hypoxia environment and salidroside on the function of vascular endothelial cells. Methods: The blank control group exposed to the normal oxygen environment, hypoxia group, hypoxia and the intervention group vascular endothelial cells exposed to hypoxia environment, detection the gene expression changes of HIF-1α, endothelin -1, vascular endothelial NO synthase in vascular endothelial cells . The expression of HIF-1α, endothelin -1, vascular endothelial NO synthase was detected by siRNA interference. Results:Compared with the blank control group, the expression of HIF-1α and endothelin -1 were significantly increased in vascular endothelial cells in hypoxia group, while vascular endothelial NO synthase expression was decreased. SiRNA interference HIF-1α experiments showed that salidroside improve the function of endothelial cell by regulating HIF-1α. Conclusion: These findings imply that salidroside improvs the function of endothelial cell by regulating, through regulation the expression of ET-1 , eNOS via a HIF-1α-dependent pathway.

Pulmonary hypertension/physiopathology Rhodioloside/pharmacology Hypoxia-inducible Factor- 1α/analysis Endothelin -1/analysis eNOS

肺動脈高壓/病理生理學(xué) 紅景天苷/藥理學(xué) 缺氧誘導(dǎo)因子1，α亞單位/分析 內(nèi)皮縮血管因子/分析 血管內(nèi)皮縮張因子NO合成酶

R392.5

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.03.009