馮學(xué)花，曹殿潔，謝偉，孟迪

(安徽新華學(xué)院藥學(xué)院，安徽 合肥 230088)

紅豆杉中紫杉烷類成分含量測(cè)定方法研究進(jìn)展

馮學(xué)花，曹殿潔，謝偉，孟迪

(安徽新華學(xué)院藥學(xué)院，安徽 合肥 230088)

紫杉醇是紅豆杉(Taxuschinensis(Pilger)Rehd.)中一種優(yōu)良的天然抗癌成分，但因其在紅豆杉中的含量極少而不能得到廣泛推廣應(yīng)用。紫杉烷類化合物作為合成紫杉醇的前體，近年來(lái)備受關(guān)注。對(duì)紫杉烷類化合物含量測(cè)定方法的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

紅豆杉(Taxuschinensis(Pilger)Rehd.)；紫杉烷類；含量測(cè)定方法；研究進(jìn)展

紅豆杉(Taxuschinensis(Pilger)Rehd.)是遠(yuǎn)古第四紀(jì)冰川遺留下來(lái)的古老植物，有著250萬(wàn)年的悠久歷史，為國(guó)家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)植物，自然分布極少。紅豆杉樹(shù)全身是寶，其莖、葉、枝、果實(shí)、心木、皮均可入藥，因此又被稱為“黃金樹(shù)”[1～3]。紅豆杉主要含有紫杉烷類、黃酮類、倍半萜等多種化學(xué)成分，其中紫杉烷類包括紫杉醇及2種重要前體巴卡亭Ⅲ(BⅢ)和10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DABⅢ)，紫杉醇是近40a來(lái)發(fā)現(xiàn)的存在于紅豆杉中的一種有效天然抗癌活性成分，臨床上已被成功應(yīng)用于乳腺癌、肺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤的治療。由于紫杉醇在紅豆杉中的含量甚微，因此作為紫杉醇的合成前體紫杉烷類化合物具有廣闊的研究前景[4]。為此，筆者對(duì)紫杉烷類化合物含量測(cè)定方法研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，以為紫杉烷類化合物的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用提供參考。

1 紅豆杉中紫杉醇含量的測(cè)定

1.1高效液相色譜法

何法霖等[5]建立了一種高效液相色譜法測(cè)定加拿大紅豆杉浸膏中紫杉醇含量的方法，實(shí)驗(yàn)條件選擇PFP柱(4.6mm×250mm，5μm)，甲醇-乙腈-水(10∶42∶48)為流動(dòng)相，流速為1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)227nm，室溫條件，進(jìn)樣5μL，圖譜采集時(shí)間45min。方法中考察了檢測(cè)波長(zhǎng)、流動(dòng)相組成和提取方法3個(gè)因素，選擇了多種不同配比的甲醇-水、甲醇-乙腈-水和乙腈-水等流動(dòng)相體系，結(jié)果以甲醇-乙腈-水(10∶42∶48)等效洗脫的分離效果最佳。通過(guò)在190～550nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)紫杉醇在227nm處有最大吸收，因此確定227nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。蔡玉梅等[6]采用HPLC法測(cè)定不同年齡曼地亞紅豆杉根中紫杉醇的含量，實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)條件設(shè)置為AngilentHypersilODS2柱(4.6mm×250mm，5μm)，甲醇-乙腈-水(20∶30∶50)為流動(dòng)相，柱溫為30℃，流速為1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為227nm，進(jìn)樣量10μL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明紫杉醇和三尖杉寧堿結(jié)構(gòu)比較相近，較難分離，對(duì)比發(fā)現(xiàn)以HypersilODS2柱效果為好，含量測(cè)定方法準(zhǔn)確可行，重復(fù)性好，可以測(cè)定不同年齡曼地亞紅豆杉根中紫杉醇的含量。

高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定紫杉醇及其他紫杉烷類化合物的含量，具有高效能、高速速的分離檢測(cè)特點(diǎn)，其分析過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是流動(dòng)相組成和比例、洗脫方式等，這種方法因具有靈敏度高、適用范圍廣、分析速度快且不破壞樣品等優(yōu)勢(shì)在含量分離分析方面得到廣泛應(yīng)用。

1.2固相萃取-反相高效液相色譜法

李儉等[7]采用HPLC內(nèi)標(biāo)法測(cè)定了南方紅豆杉不同部位中紫杉醇的含量。實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)條件設(shè)置為：甲醇-乙腈-水(22∶36∶42)為流動(dòng)相，流量為1.0mL/min，230nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，進(jìn)樣10μL，圖譜采集時(shí)間為10min。實(shí)驗(yàn)采取一次性固相萃取柱純化，配合使用標(biāo)準(zhǔn)溶液過(guò)C18小柱,進(jìn)樣量1mL，分別用10mL水、2mL50%甲醇溶液連續(xù)洗脫5次，繼續(xù)用1.5mL的80%甲醇溶液連續(xù)洗脫5次，分別收集各次洗脫液進(jìn)行色譜分析。結(jié)果表明，固相萃取相對(duì)于液-液萃取法、硅膠柱層析法或硅膠薄板層析法等方法效果較好，能在不洗脫紫杉醇的前提下最大限度地洗脫雜質(zhì)而后將紫杉醇完全洗脫。

2 紅豆杉中10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DABⅢ)含量的測(cè)定

紫杉烷類化合物為合成紫杉醇或其類似物的前體，能合成比自身抗癌活性更高的物質(zhì)。紫杉烷萜類化合物主要存在于紅豆杉樹(shù)枝、葉等部位中，其含量可達(dá)紫杉醇的數(shù)十倍之多，其中，10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DABⅢ)就是一種常見(jiàn)的紫杉烷類化合物，可用于合成比紫杉醇等具有更高抗癌活性的紫杉醇類似物[7]。因此，對(duì)紅豆杉資源中紫杉烷類物質(zhì)含量測(cè)定方法進(jìn)行研究具有重要意義。

2.1高效液相色譜法

胡杰等[8]采用HPLC法測(cè)定了東北紅豆杉枝葉提取物中10-DABⅢ的含量。色譜條件為：以C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)為色譜柱，甲醇-乙腈-水(20∶30∶50)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)選擇234nm，檢測(cè)溫度32℃，流速為0.8mL/min，進(jìn)樣量為10μL。實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)了多種流動(dòng)相體系，通過(guò)對(duì)比不同配比的甲醇-水、甲醇-乙腈-水、乙腈-水等效洗脫及梯度洗脫的流動(dòng)體系條件下的檢測(cè)結(jié)果，確定了甲醇-乙腈-水(20∶30∶50)作為流動(dòng)相，因其分離效果和重現(xiàn)性相對(duì)較高。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明用該法測(cè)定10-DABⅢ的含量結(jié)果準(zhǔn)確，可以用于監(jiān)控質(zhì)量或?yàn)樾滤幍难芯块_(kāi)發(fā)提供依據(jù)。安春志等[9]應(yīng)用HPLC內(nèi)標(biāo)法測(cè)定了云南紅豆杉枝葉提取物中10-DABⅢ的含量。色譜條件選擇C18(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱，甲醇-乙腈-水(5∶35∶60)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)227nm。實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)多種流動(dòng)相體系如不同配比的甲醇-水、甲醇-乙腈-水、乙腈-水等效洗脫及梯度洗脫進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)大多液相條件在4min出峰，而甲醇-乙腈-水(5∶35∶60)在13min左右出峰。另外，為降低成本和減少毒性，采用乙醇代替甲醇，效果良好。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高效液相色譜法可靠簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好、靈敏度高、專屬性強(qiáng)，具有較高實(shí)用價(jià)值，對(duì)建立紅豆杉提取物中紫杉烷萜類10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ的指紋圖譜和質(zhì)量控制較為實(shí)用。

2.2固相萃取-高效液相色譜(SPE-HPLC)法

孔繁晟[10]采用固相萃取-高效液相色譜(SPE-HPLC)法測(cè)定云南紅豆杉枝葉中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的含量。實(shí)驗(yàn)及色譜條件為：固相萃取柱為Agilent ODS C18500mg/3mL，色譜柱為Agilentzorbax SB-C18(250mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相為甲醇-水-乙腈( 35∶55∶10)，流速設(shè)置為1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)227nm，柱溫30℃。固相柱的洗脫溶液分別是0.01mol/L的乙酸銨、40%的甲醇乙酸銨溶液、80%的甲醇乙酸銨溶液40mL淋洗，最后用甲醇溶液淋洗固相柱。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在1.6～8.0μg/mL范圍內(nèi)，10-DABⅢ的線性關(guān)系良好，此法可用于紅豆杉枝葉中10-DABⅢ的含量測(cè)定。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)用固相柱對(duì)樣品進(jìn)行處理后再進(jìn)行含量測(cè)定，既可以去除雜質(zhì)又能有效保護(hù)色譜柱，方法穩(wěn)定，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.3反相高效液相色譜法(RP-HPLC)

甄鏵[11]采用反相高效液相色譜(RP-HPLC)法測(cè)定了歐洲紅豆杉中10-DABⅢ的含量。色譜條件為：色譜柱為Shim-Pack VP-ODS(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相為乙腈-水，梯度洗脫(0→27min，乙腈的體積分?jǐn)?shù)為20%→50%)；流速1.0mL/min；柱溫40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)232nm；進(jìn)樣量20μL。理論塔板數(shù)按10-DABⅢ峰計(jì)算不低于10000。實(shí)驗(yàn)中10-DABⅢ在乙腈-水中易溶，進(jìn)行HPLC分析時(shí)，10-DABⅢ保留時(shí)間隨乙腈的比例升高而縮短，因此實(shí)驗(yàn)通過(guò)調(diào)整乙腈的比例來(lái)改變10-DABⅢ的分離度。實(shí)驗(yàn)在制樣方法和用硅膠柱層析中有針對(duì)性地對(duì)10-DABⅢ粗分離進(jìn)行了研究，該方法具有過(guò)程簡(jiǎn)單、續(xù)制樣、效率高、重現(xiàn)性好、成本低、低檢出等優(yōu)點(diǎn)，簡(jiǎn)化HPLC分析的前處理，能得到滿意的效果。甄樺等[12]采用反相高效液相色譜法測(cè)定曼地亞紅豆杉中10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ含量，色譜條件為：色譜柱為Shim-Pack VP-ODS(150mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相為甲醇-水(45∶55)；流速1.0mL/min；柱溫40℃；進(jìn)樣量20μL；檢測(cè)波長(zhǎng)232nm；靈敏度0.16AUFS。在該色譜條件下，10-DABⅢ對(duì)照品保留時(shí)間為10min，理論塔板數(shù)12918。10-DABⅢ的色譜峰與鄰近峰的分離度大于1.5，分離度良好。實(shí)驗(yàn)過(guò)程簡(jiǎn)單，所需條件容易實(shí)現(xiàn)，所以是測(cè)定10-DABⅢ含量的方法之一。

2.4超高液相色譜法(UPLC)

張靜等[13]采用UPLC法同時(shí)測(cè)定曼地亞紅豆杉中10-DABⅢ、三尖杉寧堿和紫杉醇的含量，并對(duì)不同采收期、不同部位曼地亞紅豆杉中這3種有效成分的含量變化規(guī)律進(jìn)行了研究分析。色譜條件為：色譜柱為AC-QUITY UPLC BEH Shield RP 18(2.1mm×100mm，1.7μm)；流動(dòng)相為水(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～8min，78%A；8～11min，78%A→65%A；11～44min，65%A)；流速0.2mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)227nm，柱溫25℃；進(jìn)樣量1μL。該色譜條件下，各相鄰色譜峰之間的分離度均大于1.5，分離度良好，拖尾因子在0.95～1.05之間，理論塔板數(shù)均大于30000，能夠滿足分析需求。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該法可以用來(lái)測(cè)定紫杉烷類含量。

3 結(jié)語(yǔ)

SPE-HPLC法、RP-HPLC法、UPLC法等是近年來(lái)紫杉烷類化合物含量測(cè)定的常用方法，這些方法各有特點(diǎn)。不難發(fā)現(xiàn)，紫杉烷類化合物的測(cè)定方法以高效液相色譜法為多，高效液相色譜法具有高效能、高速度、高靈敏度、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。所用流動(dòng)相中多含有乙腈和水，分離效果較好，采用乙腈系統(tǒng)流動(dòng)相時(shí)，柱壓較低，洗脫能力較強(qiáng)，保留時(shí)間適中，峰形對(duì)稱性好。由于紫杉醇藥材的昂貴性以及特殊的生物活性，在醫(yī)藥領(lǐng)域越來(lái)越多地受到重視，而發(fā)展快速、簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確的活性物質(zhì)含量測(cè)定方法則是研究開(kāi)發(fā)和應(yīng)用紫杉醇的基礎(chǔ)。

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2017-05-16

安徽省教育廳自然科學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2015A313)；安徽省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目(201612216094)；安徽新華學(xué)院校級(jí)自然科學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目(2016zr008)。

馮學(xué)花(1979-)，女，碩士，副教授，主要從事藥物分析研究，fxh77@126.com。

[引著格式]馮學(xué)花，曹殿潔，謝偉，等.紅豆杉中紫杉烷類成分含量測(cè)定方法研究進(jìn)展J.長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版) ，2017，14(18)：51～53.

Q949.66;R927.2

A

1673-1409(2017)18-0051-03

[編輯] 余文斌