3種對(duì)蝦精子超低溫冷凍保存技術(shù)研究

王文琪, 楊敬昆, 徐世宏, 劉清華, 李 軍

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3種對(duì)蝦精子超低溫冷凍保存技術(shù)研究

王文琪1, 楊敬昆1, 徐世宏2, 3, 劉清華2, 3, 李 軍2, 3

(1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 海洋科學(xué)與工程學(xué)院, 山東 青島 266109; 2. 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所 中科院實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071; 3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266237)

作者以日本囊對(duì)蝦()、中國(guó)明對(duì)蝦()和南美白對(duì)蝦()作為實(shí)驗(yàn)材料, 研究3種稀釋液(天然海水, 人工無(wú)鈣海水, Hank’s平衡鹽溶液)、3種抗凍劑(二甲基亞砜、丙二醇和丙三醇)、3種稀釋比例(5%、10%和15%)、3種不同的降溫程序?qū)?種對(duì)蝦精子超低溫冷凍保存效果的影響。凍精解凍后通過臺(tái)盼藍(lán)染色的方法計(jì)算其存活率。結(jié)果顯示, 對(duì)于3種對(duì)蝦, 以天然海水作為稀釋液, 10%PG作為抗凍劑, 4℃平衡20 min, 以–2℃/min降溫至–40℃, –40℃平衡10℃, 以–15℃/min降溫至–150℃, 然后投入液氮作為降溫程序進(jìn)行超低溫冷凍保存效果最好, 凍精解凍后存活率分別為75.33%±2.56%、69.00%±3.00%和 23.33%±8.55%。

日本囊對(duì)蝦(); 中國(guó)明對(duì)蝦(); 南美白對(duì)蝦(); 精子; 超低溫冷凍; 存活率

動(dòng)物種質(zhì)細(xì)胞的超低溫保存是指在超低溫條件下, 動(dòng)物種質(zhì)細(xì)胞內(nèi)一切新陳代謝過程中的化學(xué)變化被超低溫所抑制, 即隨著溫度的逐漸下降, 細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)能力也在逐漸降低, 當(dāng)溫度降到一定閾值時(shí), 細(xì)胞的生理活動(dòng)趨于停止; 低溫保存的細(xì)胞以一定的方式復(fù)蘇后, 又具有存活的能力[1]。細(xì)胞在冷凍和解凍過程中的損傷主要包括: 過冷休克、冰晶損傷、高滲休克、抗凍保護(hù)劑的毒性作用等[2]。精子冷凍過程中由于受到以上多方面因素的影響, 會(huì)使精子結(jié)構(gòu)受到損傷, 進(jìn)而使其功能受到影響。由于不同物種的精子對(duì)不同保存條件的承受能力不同, 因此, 應(yīng)該盡力優(yōu)化超低溫冷凍保存的各個(gè)條件, 盡量減少對(duì)精子的損傷, 增加精子冷凍保存效率。

自20世紀(jì)80年代以來(lái), 對(duì)蝦養(yǎng)殖一直是中國(guó)海水經(jīng)濟(jì)作物的支柱型產(chǎn)業(yè), 尤其以南美白對(duì)蝦()、中國(guó)明對(duì)蝦()、日本囊對(duì)蝦()為主要的養(yǎng)殖物種, 但是, 由于近年來(lái)的養(yǎng)殖泛濫、種質(zhì)退化、品質(zhì)下降、病害增加等問題日益嚴(yán)重, 種質(zhì)資源保護(hù)問題一直是對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的一個(gè)亟待解決的大問題, 解決這一問題最成熟的辦法就是超低溫冷凍保存技術(shù)。近年來(lái), 超低溫冷凍保存技術(shù)對(duì)于哺乳動(dòng)物和魚類的精子中應(yīng)用廣泛, 而在幾種經(jīng)濟(jì)類對(duì)蝦品種的研究較少[3-5]?？聛喎虻萚4]對(duì)中國(guó)明對(duì)蝦精子的超低溫冷凍保存進(jìn)行初步的研究,以自然海水或人工海水作基礎(chǔ)液添加10%DMSO和少量甘油配成抗凍稀釋液, 經(jīng)液氮蒸氣兩段預(yù)冷結(jié)冰后投人液氮中進(jìn)行超低溫冷凍保存, 解凍后精子存活率達(dá)到60%; Vuthiphandchai等[6]對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦()的納精囊冷凍保存進(jìn)行了研究, 使用5%DMSO作為抗凍劑, 無(wú)鈣人工海水作為稀釋液時(shí)保存效果最佳, 解凍后存活率達(dá)71.6%~72.2%; 浦蘊(yùn)惠等[7]對(duì)脊尾白蝦()的精子體外保存進(jìn)行了研究, 并研究了存活率和頂體酶之間的相關(guān)性。目前, 中國(guó)對(duì)對(duì)蝦精子的超低溫冷凍保存研究較少, 因此, 本實(shí)驗(yàn)決定以日本囊對(duì)蝦、中國(guó)明對(duì)蝦、南美白對(duì)蝦為實(shí)驗(yàn)對(duì)象, 篩選以上3種對(duì)蝦精子超低溫冷凍保存的最適方法。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用中國(guó)明對(duì)蝦和日本對(duì)蝦均來(lái)自日照對(duì)蝦良種養(yǎng)殖場(chǎng), 中國(guó)明對(duì)蝦體長(zhǎng)15.96 cm±0.68 cm, 體質(zhì)量40.19 g±3.68 g, 養(yǎng)殖溫度18~20℃。日本囊對(duì)蝦體長(zhǎng)12.11 cm±0.33 cm, 體質(zhì)量35.36 g±4.02 g, 養(yǎng)殖溫度25~27℃。南美白對(duì)蝦來(lái)自煙臺(tái)對(duì)蝦良種養(yǎng)殖場(chǎng), 體長(zhǎng)12.22 cm±0.56 cm, 體質(zhì)量38.95 g±5.02 g, 養(yǎng)殖溫度27~28℃。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 精子的獲取

解剖對(duì)蝦, 切斷腹神經(jīng)索, 使雄蝦不能彈跳, 以便操作, 將頭胸部與腹部分開, 切斷貯精囊與生殖孔的聯(lián)系, 取出貯精囊, 輕輕擠壓使精莢露出, 用鑷子夾住精莢扇狀體與豆?fàn)铙w的聯(lián)結(jié)處, 將精莢取出[8]。將單個(gè)精莢放入500 μL天然海水, 將精莢剪碎后用研磨棒進(jìn)行研磨, 300目篩網(wǎng)進(jìn)行過濾, 濾出后精子懸液備用。

1.2.2 超低溫冷凍保存條件的篩選

選取3種不同的稀釋液(天然海水、無(wú)鈣人工海水和HBSS(Hank's平衡鹽溶液)), 3種不同的抗凍劑(二甲基亞砜(DMSO)、丙二醇(PG)和丙三醇(GLY), DMSO購(gòu)自SIGMA公司, 其他藥品均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)配成3個(gè)不同的濃度(5%, 10%, 15%), 提前1 d置于4℃冰箱預(yù)冷過夜。將過濾后的精子懸濁液與冷凍保護(hù)劑1︰1混合, 每個(gè)樣品取10 μL顯微鏡下觀察并計(jì)算活精子個(gè)數(shù), 放入500 μL的麥管(IMV, L’Aigle, France)中, 4℃放置30 min, 放入程序降溫儀(Kyro360-1.7)運(yùn)行表1(A-1、A-2和A-3)的程序進(jìn)行程序降溫, 之后將樣品投入液氮。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)平行, 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 冷凍降溫程序

冷凍保存30日后, 37℃解凍, 臺(tái)盼藍(lán)染色觀察其存活個(gè)數(shù)。每個(gè)樣品統(tǒng)計(jì)3個(gè)視野中存活個(gè)數(shù)總值, 統(tǒng)計(jì)活精子個(gè)數(shù)與冷凍前進(jìn)行比較計(jì)算其存活率, 3個(gè)平行樣品間取平均值對(duì)對(duì)蝦精子的超低溫冷凍保存不同條件進(jìn)行比較。

1.3 日本囊對(duì)蝦和中國(guó)明對(duì)蝦的超微結(jié)構(gòu)觀察

透射電鏡(transmission electron microscopy, TEM)觀察: 取機(jī)械勻漿法得到的對(duì)蝦精子, 用2.5%戊二醛(0.2mol/L, pH=7.4, 磷酸緩沖液配制)進(jìn)行前固定, 然后用1%鋨酸(4℃)固定2h, 梯度酒精脫水, 然后用Epon-812滲透包埋, 超薄切片機(jī)切片, 經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色后透射電鏡(日立H-7000)下觀察、拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用 SPSS17.0 軟件進(jìn)行單因素方差(One-Way ANOVA)分析, 結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異顯著性采用Duncan法進(jìn)行多重比較(=0.05)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 精莢及凍存前后精子形態(tài)結(jié)構(gòu)的比較

圖1為對(duì)蝦形態(tài)圖, 3種對(duì)蝦精子大小形狀相似, 南美白對(duì)蝦精子(圖1-1)略大于中國(guó)明對(duì)蝦(圖1-2), 直徑約為4 μm, 中國(guó)明對(duì)蝦精子略小, 直徑約3 μm, 日本囊對(duì)蝦(圖1-3)精子大小與南美白對(duì)蝦精子大小相當(dāng), 直徑約為4 μm。所得的游離成熟精子在10×100倍油鏡下觀察主體部呈圓球狀, 帶有明顯的棘突, 無(wú)鞭毛, 不運(yùn)動(dòng)。圖2為日本囊對(duì)蝦(圖2-1)和中國(guó)明對(duì)蝦(圖2-2)投射電鏡圖, 由圖2可見日本囊對(duì)蝦和中國(guó)明對(duì)蝦精子整體形態(tài)相似, 呈橢圓形, 都有單一棘突, 并與頂體相連。

2.2 冷凍降溫程序的確定

以10%DMSO為抗凍劑, 天然海水為稀釋液, 運(yùn)行3種降溫程序, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2, 運(yùn)行A-1降溫程序進(jìn)行冷凍保存, 解凍后存活率最高, 3種對(duì)蝦凍精存活率分別為: 43.11%±6.88%(日本囊對(duì)蝦)、33.35%± 6.51%(中國(guó)明對(duì)蝦)、11.02%±1.12%(南美白對(duì)蝦)。

圖1 冷凍保存前后對(duì)蝦精子形態(tài)

1-1. 南美白對(duì)蝦活精子; 1-2. 中國(guó)明對(duì)蝦活精子; 1-3. 日本囊對(duì)蝦活精子; 1-4. 日本囊對(duì)蝦凍精解凍后形態(tài); a. 活精子; b. 死精子

1-1. live sperm of; 1-2. live sperm of; 1-3. live sperm of; 1-4. frozen sperm of; a. live sperm; b. a dead sperm

圖2 日本囊對(duì)蝦和中國(guó)明對(duì)蝦透射電鏡結(jié)果

2-1. 日本囊對(duì)蝦精子; 2-2. 中國(guó)明對(duì)蝦精子; s. 棘突; ac. 頂體; sr. 亞頂體; n. 細(xì)胞核; ct. 細(xì)胞質(zhì)

2-1.sperm; 2-2.sperm; s. spike; ac. acrosomal cap; sr. subacrosomal region; n. nucleus; ct. cytoplasm

表2 各個(gè)降溫程序下存活率

同行數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(<0.05)

2.3 稀釋液和抗凍劑對(duì)日本囊對(duì)蝦精子冷凍保存影響

以10%DMSO作為抗凍劑, 不同稀釋液下運(yùn)行A-1降溫程序冷凍后日本囊對(duì)蝦精子存活率見圖3。由圖3可知, 以10%DMSO作為抗凍劑、稀釋液為天然海水時(shí)凍精解凍存活率最高, 顯著高于其他處理組(<0.05), 存活率為61.56%±4.23%, 無(wú)鈣人工海水次之, 存活率為54.67%±5.22%, HBSS的效果最差, 存活率為15.00%±3.00%。

圖3 不同稀釋液對(duì)日本囊對(duì)蝦精子冷凍后存活率的影響

數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(<0.05), 圖4-圖8同

Different lowercase letters indicate significant difference (<0.05), the same as fig.4-fig.8

以天然海水作為稀釋液, 不同抗凍劑下運(yùn)行A-1降溫程序冷凍后日本囊對(duì)蝦精子存活率見由圖4。由圖4可知, 稀釋液為天然海水時(shí), 使用10%PG作為抗凍劑時(shí)凍精解凍存活率最高, 為75.33%± 2.56%, 顯著高于其他處理組(<0.05), 使用GLY和DMSO時(shí)抗凍劑時(shí)次之, 兩者之間差異不顯著(>0.05), 15%PG、5%GLY、10%GLY和5%DMSO組解凍后精子存活率不足20%, 顯著低于其他處理組(<0.05)。

圖4 不同抗凍劑對(duì)日本囊對(duì)蝦精子冷凍后存活率的影響

2.4 稀釋液和抗凍劑對(duì)中國(guó)明對(duì)蝦冷凍保存的影響

以10%DMSO作為抗凍劑, 不同稀釋液下運(yùn)行A-1降溫程序冷凍后中國(guó)明對(duì)蝦精子存活率見圖5。由圖5可知, 在用10%DMSO作為抗凍劑, 稀釋液為天然海水時(shí)凍精解凍存活率最高, 顯著高于其他組(<0.05), 解凍后存活率為61.56%±3.67%, 無(wú)鈣人工海水次之, 存活率為39.67%±1.33%, HBSS的效果最差, 存活率為14.67%±5.00%。

圖5 不同稀釋液對(duì)中國(guó)明對(duì)蝦精子冷凍后存活率的影響

以天然海水作為稀釋液, 不同抗凍劑下運(yùn)行A-1降溫程序冷凍后中國(guó)明對(duì)蝦精子存活率見圖6。由圖6可知, 在使用天然海水作為稀釋液, 10%PG和10%DMSO組作為抗凍劑時(shí)凍精解凍存活率顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組(<0.05), 其中, 10%PG組凍精解凍后存活率最高, 為69.00%±3.00%, 其次為10%DMSO, 3種不同濃度DMSO差異不顯著, 5%GLY組作為抗凍劑凍精解凍存活率最低, 顯著低于其他處理組(<0.05)。

圖6 不同抗凍劑對(duì)中國(guó)明對(duì)蝦精子冷凍后存活率的影響

2.5 南美白對(duì)蝦冷凍保存稀釋液和抗凍劑的確定

以10%DMSO作為抗凍劑, 不同稀釋液下運(yùn)行A-1降溫程序冷凍后南美白對(duì)蝦精子存活率見圖7。由圖7可知, 在使用10%DMSO作為抗凍劑時(shí), 稀釋液為天然海水時(shí)凍精解凍存活率最高, 顯著高于其他處理組(<0.05), 為12.33%±3.67%, 無(wú)鈣人工海水次之, 為10.20%±3.00%, HBSS的效果最差, 存活率僅為3.60%±2.33%。

圖7 不同稀釋液對(duì)南美白對(duì)蝦精子冷凍后存活率的影響

以天然海水作為稀釋液, 不同抗凍劑下運(yùn)行A-1降溫程序冷凍后南美白對(duì)蝦精子存活率見圖8。由圖8可知, 在使用天然作為稀釋液, 10%PG作為抗凍劑的凍精解凍存活率最高, 顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組(<0.05), 為23.33%±8.55%, 5%PG、10%GLY、15%GLY、5%DMSO和10%DMSO作為抗凍劑時(shí)差異不顯著(>0.05), 凍精解凍存活率低于20%, 15%PG組凍精解凍后存活率顯著低于其他處理組(<0.05), 僅不足5%。

圖8 不同抗凍劑對(duì)南美白對(duì)蝦精子冷凍后存活率的影響

3 討論

3.1 對(duì)蝦精子的獲取

對(duì)蝦的精子與魚類、貝類等不同, 它的精子儲(chǔ)存在精莢中, 而魚類、貝類精子在性腺中成熟, 可以通過擠壓、解剖等方法較為方便地獲得成熟的性腺。精莢是十足類動(dòng)物所具有的一種特殊結(jié)構(gòu), 成對(duì)存在并貯存在精囊中, 每側(cè)各1個(gè), 其發(fā)育程度直接影響卵子的受精率和人工育苗的產(chǎn)量, 在對(duì)蝦受精前, 精莢具有傳輸和保護(hù)精子的雙重作用。一般由精子、精莢基質(zhì)、精莢壁3部分構(gòu)成[9]。形態(tài)各異, 主要有3種類型: 柄狀(異尾類)、管狀 (長(zhǎng)尾類)、球形或圓形(短尾類)。而中國(guó)明對(duì)蝦和日本囊對(duì)蝦的精莢形態(tài)都為柄狀。在之前的研究中, 對(duì)蝦精子的獲取有用胰蛋白酶進(jìn)行消化, 但是, 在實(shí)際的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)用胰蛋白酶進(jìn)行消化不能很好地控制消化的時(shí)間, 因此采用機(jī)械勻漿法進(jìn)行研磨來(lái)獲取精子。

甲殼動(dòng)物精子多種多樣, 其中須蝦亞綱(Mysta-cocaride)、蔓足亞綱(Cirripedia)、鰓尾亞綱(Branchiura) 等3個(gè)亞綱的精子具鞭毛, 能運(yùn)動(dòng), 其他5個(gè)亞綱的精子形狀各異, 沒有中間體和鞭毛[10]。十足類動(dòng)物的精子與其他較高等動(dòng)物的精子比較有很大的不同, 缺少鞭毛, 核松散, 不運(yùn)動(dòng), 依據(jù)形態(tài)分兩類: (1) 從中央體部散發(fā)出若干棘突的精子, 如爬行目的蟹(Brachyura)、龍蝦(Palinuridae)和螯蝦(); (2)具有單一棘突的精子, 如游泳亞目的各種蝦類。而所有種類的對(duì)蝦都屬于游泳亞目, 據(jù)有單一棘突, 其內(nèi)部結(jié)構(gòu)分為棘突、中間部和主體部, 沒有鞭毛, 不主動(dòng)運(yùn)動(dòng)。

3.2 對(duì)蝦精子活力的評(píng)價(jià)方法研究

十足目(Decapoda)精子的棘突對(duì)于精子在卵的定位和刺穿次序是必需的。而其他魚類和貝類精子由于有鞭毛, 可以通過精子運(yùn)動(dòng)情況直接觀察精子活力狀況。由于對(duì)蝦精子沒有鞭毛, 不能自由地游動(dòng)[11]。因此, 對(duì)蝦精子的質(zhì)量評(píng)價(jià)主要通過生物染色劑染色和精卵相互作用這兩種方法進(jìn)行, 由于對(duì)蝦同一時(shí)期的未受精卵難以大量獲得, 因此, 生物染色的方法是主要對(duì)對(duì)蝦精子活力評(píng)價(jià)的方法[12-13]。生物染色主要使用的染色劑有臺(tái)盼藍(lán)、伊紅-苯胺黑, 實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)用臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)行染色效果要比其他的要好, 但是在染色過程中, 有些精子的棘突消失但是仍能不被臺(tái)盼藍(lán)染色, 但實(shí)際由于精子的棘突消失, 精子本身已經(jīng)沒有了受精能力。因此, 染料排斥實(shí)驗(yàn)只能作為一種粗略的估計(jì)精子活力的方法, 但是作為篩選對(duì)蝦超低溫冷凍保存方法的技術(shù), 生物染色方法確實(shí)可行。但現(xiàn)在對(duì)于對(duì)蝦精子活力的準(zhǔn)確測(cè)定只能通過精卵相互作用這一方法, 由于對(duì)蝦相同發(fā)育時(shí)期的卵獲取難度大, 因此此方法難以實(shí)現(xiàn)。

3.3 稀釋液和抗凍劑的篩選

稀釋的天然或人工海水已被廣泛地用于十足目甲殼動(dòng)物精子冷凍的研究中?？聛喎虻萚4]研究表明, 中國(guó)明對(duì)蝦精子冷凍稀釋液中, Ca2+、Mg2+、K+為必需, 其中Ca2+不能超過0.7 mol/dm3; Bhabvanishankar[13]發(fā)現(xiàn)海水和無(wú)鈣人工海水均可作為精子冷凍稀釋液; 陳東華等[14]研究證實(shí), Na+、K+是魚類血漿、精漿的重要組分和構(gòu)成滲透壓的主要離子, Na+有促進(jìn)精子活動(dòng)的作用, 而適當(dāng)?shù)腒+濃度可延長(zhǎng)精子壽命?？聛喎虻萚4]對(duì)中國(guó)明對(duì)蝦精子冷凍保存進(jìn)行研究, 發(fā)現(xiàn)稀釋液為天然海水時(shí)效果最好; 而廖馨等[15]、浦蘊(yùn)惠等[7]實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)使用壬氏液作為稀釋液對(duì)青蝦, 脊尾白蝦精子冷凍保存效果最好, 使用DMSO作為抗凍劑時(shí)凍精解凍存活率最高, 本研究結(jié)果對(duì)于3種不同的對(duì)蝦而言, 10%PG作為抗凍劑、天然海水作為稀釋液, 運(yùn)行A-1程序進(jìn)行冷凍保存, 解凍后存活率最高。

雖然本實(shí)驗(yàn)成功篩選出了3種對(duì)蝦精子超低溫冷凍保存的最適方法, 但是對(duì)于對(duì)蝦精子解凍后的存活率統(tǒng)計(jì)上還是略有不足。對(duì)于對(duì)蝦精子存活率的統(tǒng)計(jì), 通過人工授精的方法更為可靠, 而且本實(shí)驗(yàn)只是對(duì)對(duì)蝦精子冷凍保存的方法進(jìn)行了一個(gè)初步的篩選, 并沒有進(jìn)行有關(guān)添加劑對(duì)于冷凍保存效果的討論, 希望在以后的研究中能夠進(jìn)一步進(jìn)行探討。

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(本文編輯: 譚雪靜)

Cryopreservation of spermatozoa of three prawn species

WANG Wen-qi1, YANG Jing-kun1, XU Shi-hong2, 3, LIU Qing-hua2, 3, LI Jun2, 3

(1.Marine Science and Engineer College, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China; 2. Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 3 Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266237, China)

This study was conducted to examine the cryoprotective effects of three extenders (natural seawater, calcium-free saline, and Hank’s balanced salt solution), three cryoprotectants (DMSO, propylene glycol, and glycerol) at different concentrations and three dilution ratios (5%, 10%, and 15%), and three cooling procedures on the cryopreservation of sperms of three types of shrimp, Kuruma prawn,, and. The survival rates of post-thawed sperms were calculated by trypan blue staining, and the cryopreservation procedures of the three shrimps were screened. Successful cryopreservation of sperms of these three shrimps in liquid nitrogen was achieved using sterilized natural seawater containing 10% propylene glycol with A-1 procedure, with the survival rates being 75.33% ± 2.56%, 69.00% ± 3.00%, and 23.33% ± 8.55%, respectively.

;;; cryopreservation; spermatozoa; survival rate

Oct. 24, 2016

王文琪(1969-), 女, 山東萊陽(yáng)人, 博士, 教授, 主要從事海洋生物養(yǎng)殖生態(tài)方面的研究, 電話: 13730901370, E-mail: wenqi31@163.com; 李軍,

, 電話: 13506482136, E-mail: junli@qdio.ac.cn

S917.4

A

1000-3096(2017)09-0081-06

10.11759//hykx20161024003

2016-10-24;

2017-05-24

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系蝦蟹創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(SDAIT-13); 農(nóng)業(yè)部948項(xiàng)目(2015-Z59); 鰲山科技創(chuàng)新計(jì)劃資助項(xiàng)目(2015ASKJ02, 2015ASKJ02-03-033); 海洋藥源生物種質(zhì)資源庫(kù)建設(shè)項(xiàng)目(12PYY001SF08)

[Shandong Province’s Innovation Team of Modern Agricultural Technology System, No. SDAIT-13; Ministry of Agriculture 948 Project, No.2015-Z59; Aoshan Science and Technology Innovation Plan, No.2015ASKJ02, 2015ASKJ0203-033; Marine Economy Innovative Development Project, No. 12PYY001SF08]