張保平+李娜

摘 要：為比較5組中藥復(fù)方制劑在體外抑菌作用的效果，篩選對(duì)常德地區(qū)桃源雞大腸桿菌抑菌作用較好的組方，按中醫(yī)藥配伍原則，選用15種單味中藥配伍出5組復(fù)方制劑。采用常規(guī)水煎煮法制備水提物，分別用平板打孔法、試管二倍梯度稀釋法及平板接種法對(duì)臨床分離的雞大腸桿菌進(jìn)行藥物敏感性和最小抑菌濃度測(cè)定。以對(duì)臨床分離的大腸桿菌株敏感性較高的頭孢曲松作對(duì)照，采用自擬中藥復(fù)方制劑對(duì)人工感染的桃源雞大腸桿菌病進(jìn)行治療試驗(yàn)和預(yù)防保護(hù)性試驗(yàn)，并對(duì)其療效進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，中藥復(fù)方制劑II（紫地榆、石榴皮、黃連）和復(fù)方制劑IV（五倍子、烏梅、黃芩）水提液對(duì)大腸桿菌體外抑菌作用較好，其最小抑菌濃度分別是0.016，0.008 mg·mL-1 ；中藥復(fù)方制劑III（黃柏、白芍、訶子）和復(fù)方制劑V（白頭翁、馬齒莧、茯苓）水提液抑菌作用次之，最小抑菌濃度均是0.063 mg·mL-1；復(fù)方制劑I（唐菖、大黃、金銀花）抑菌作用最小，其抑菌濃度為0.500 mg·mL-1，其菌落數(shù)隨藥物濃度升高呈降低趨勢(shì)。中藥復(fù)方制劑II和頭孢曲松都可以有效控制人工感染大腸桿菌后桃源雞的臨床癥狀，明顯降低雞只死亡率，中藥復(fù)方制劑II和頭孢曲松對(duì)大腸桿菌病治療率分別是80.0%和86.6%，都高于感染組；中藥復(fù)方制劑II預(yù)防大腸桿菌病的保護(hù)率是83.3%，與頭孢曲松一致。

關(guān)鍵詞：中藥復(fù)方制劑；桃源雞；大腸桿菌??；療效

中圖分類號(hào)：S858.31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.03.004

Experiment on Treating Tao-Yuan Chicken Colibacillosis by Compound Chinese Herbal Medicine

ZHANG Baoping1， LI Na2

（1. Department of Agriculture and Forestry Engineering， Changde Vocational Technical College， Changde， Hunan 415000， China； 2.Zoology Key Laboratory of Hunan Higher Education， Hunan University of Arts and Science， Changde， Hunan 415000， China）

Abstract： The fifteen Chinese herbal medicines were Gladiolus gandavensis， Radixet rhizome， Rhei palmati， Lonicera japonica， Geranium strictipes， Pericarpium punicae Granati， Rhizoma coptidis， Phellodendron amurense Rupr.， Paeonia sterniana Fletcher in Journ.， Fructus chebulae， Galla chinensis， Fructus mume， Radix scutellariae Baicalensis， Radix pulsatillae， Herba portulacae Oleraceae， Glabrous greenbrier Rhizome. The bacteriostatic activities of 5 groups compound chinese herbal medicine prescriptions against enterotoxigenic Escherichia coli were observed by Plate punching method and serial dilution test. Compound chinese herbal medicine prescription was selfmade according to Chinese veterinary theory. With ceftriaxone highly sensitive to the isolated strain of Escherichia colias control， the cure and preventing protective test were made on colibacillosis in chicken infected artificially to evaluate its curative effect on Tao-Yuan chicken Colibacillosis. Escherichia coli was highly sensitive to the compound chinese herbal medicine prescriptions II and IV， The minimal inhibitory concentration （MIC） were 0.016， 0.008 mg·mL-1. Moderately sensitive to the medicine prescriptions III and V， both MIC were 0.063 mg·mL-1. But prescriptions I was lowly sensitive effect， MIC was 0.500 mg·mL-1. The Chinese herbal medicine and its medicinal formula had better treatment effect， low residue and low drug resistance. Both Chinese herbal compound prescription and ceftriaxone could control the clinical symptoms of chicken infected artificially by Escherichia coli effectively and decrease the death rate significantly. The cure protective rate of Chinese herbal compound prescription and ceftriaxone to Escherichia coli were 80.0 % and 86.6 %， respectively， greatly higher than that in infection control group. Chinese herbal compound prescription had better protective effect on preventing colibacillosis in chicken with the protective rate of 83.3 %， which was the same with that of ceftriaxone.

Key words： Chinese herbal medicine； Tao-Yuan chicken； colibacillosis； curative effect

大腸桿菌病是嚴(yán)重威脅養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展的常見病，目前尚無有效疫苗可以預(yù)防，臨床治療多用抗生素，而抗生素的不合理使用，造成大腸桿菌的耐藥性不斷提高[1]。中藥以其資源豐富、低毒高效、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，在治療疾病和動(dòng)物保健等方面都有一定優(yōu)勢(shì)[2-6]。近年來，用中藥防治畜禽疾病已成為健康養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展趨勢(shì)[7]。

本試驗(yàn)選用15 種單味中藥，按中醫(yī)藥配伍原則組出5組復(fù)方制劑，按常規(guī)方法制備中藥水提物，對(duì)分離的致病大腸桿菌進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，測(cè)定最小抑菌濃度（MIC），比較中藥復(fù)方制劑的抑菌作用以及比較中藥復(fù)方制劑對(duì)人工感染的雞大腸桿菌病治療效果，旨在為中藥復(fù)方制劑的臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料與試劑

供試細(xì)菌是2006—2012 年實(shí)驗(yàn)室自行分離、鑒定并保存的[8]；常規(guī)試劑均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。白芍、唐菖蒲、大黃、紫地榆、石榴皮、黃柏、訶子、烏梅、黃芩、白頭翁、五倍子、馬齒莧、黃連、土茯苓、金銀花15種中藥均購(gòu)于常德市某中藥店。

1.2 儀器設(shè)備

麥?zhǔn)媳葷峁埽ū本┲形鬟h(yuǎn)大科技有限公司）；電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；水浴鍋（永興昌醫(yī)療器械廠）；烘箱（上?？茖W(xué)儀器有限公司）；電爐（北京科偉永興儀器有限公司）；生化培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；超凈臺(tái)（上海浦東物理光學(xué)儀器廠）；粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；冰箱（青島海爾股份有限公司）。

1.3 方 法

1.3.1 藥液制備 將15 種單味中藥按比例混合配制成5 組復(fù)方制劑。復(fù)方制劑I：唐菖蒲、大黃、金銀花；復(fù)方制劑II：紫地榆、石榴皮、黃連；復(fù)方制劑III：黃柏、訶子、白芍；復(fù)方制劑IV：五倍子、烏梅、黃芩；復(fù)方制劑V：白頭翁、土茯苓、馬齒莧。水提物按常規(guī)水煎煮法制成。4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 大腸桿菌活化及濃度測(cè)定 將分離的大腸桿菌先接種于瓊脂斜面活化，再接種于2 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37 ℃培養(yǎng)24 h，取100 μL菌液加于2 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯中擴(kuò)增培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)18 h后進(jìn)行比濁和活菌計(jì)數(shù)。最后配制成濃度1×109 cfu·mL-1菌液，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 體外抑菌試驗(yàn) 參照CLSI（臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所）抗菌藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，采用平板打孔法[9]進(jìn)行藥物體外抑菌試驗(yàn)。抑菌作用判定按《中藥藥理學(xué)》[10]介紹的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.3.4 MIC測(cè)定 采用試管二倍梯度稀釋法測(cè)定各組中藥復(fù)方制劑對(duì)大腸桿菌體外的MIC[11]。以渾濁度作指標(biāo)檢測(cè)試管中有無細(xì)菌生長(zhǎng)。陽(yáng)性對(duì)照試管里細(xì)菌生長(zhǎng)呈渾濁狀，陰性對(duì)照試管里細(xì)菌無生長(zhǎng)呈透明狀，對(duì)照觀察其他試管中細(xì)菌生長(zhǎng)的渾濁狀態(tài)。因受藥物本身顏色影響，試驗(yàn)中無法用肉眼準(zhǔn)確判斷藥物MIC，故改進(jìn)檢測(cè)方法，即結(jié)合平板接種結(jié)果進(jìn)行判斷，瓊脂板上如無細(xì)菌生長(zhǎng)，且是含藥液濃度為最低者即為該組中藥復(fù)方制劑對(duì)該細(xì)菌的MIC。

（1）臨床試驗(yàn)。30 日齡桃源雞，健康，隨機(jī)分6 組，每組30只，其中，3組作治療試驗(yàn)，另外3組作預(yù)防保護(hù)試驗(yàn)。

（2）治療試驗(yàn)。除對(duì)照組外，其余2組每只雞胸肌注射菌液0.25 mL，攻菌后中藥治療組每只雞灌服1.5 mL中藥復(fù)方制劑水提液，連續(xù)5 d。對(duì)照組每只注射生理鹽水1 mL，統(tǒng)計(jì)雞只存活數(shù)和保護(hù)率。

（3）預(yù)防保護(hù)試驗(yàn)。每只雞每次灌服0.75 mL中藥復(fù)方制劑水提液，連續(xù)9 d；對(duì)照組每只注射生理鹽水1 mL。灌服中藥復(fù)方制劑水提液后第4天和感染組同時(shí)每只雞胸肌注射菌液0.25 mL，對(duì)照組不攻菌，不喂藥，觀察10 d。統(tǒng)計(jì)雞的存活數(shù)和保護(hù)率。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)差異顯著性檢驗(yàn)采用T檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外抑菌試驗(yàn)

由表1可知，當(dāng)中藥復(fù)方制劑濃度是1 g·mL-1時(shí)，大腸桿菌對(duì)復(fù)方制劑II和IV呈現(xiàn)高度敏感，抑菌圈直徑分別為（18.73±1.66）mm和（17.47±1.37）mm；大腸桿菌對(duì)復(fù)方制劑III和V呈現(xiàn)中度敏感，抑菌圈直徑分別為（12.10±0.75）mm和（13.43±0.25） mm；大腸桿菌對(duì)復(fù)方制劑I呈現(xiàn)低度敏感，抑菌圈直徑為（8.32±0.45）mm。

2.2 MIC測(cè)定結(jié)果

5 組復(fù)方制劑對(duì)供試菌MIC呈現(xiàn)出不同程度的抑菌作用。其中，紫地榆、石榴皮和黃連組成的復(fù)方制劑II和五倍子、烏梅、黃芩組成的復(fù)方制劑IV的抑菌作用明顯優(yōu)于其他組，對(duì)大腸桿菌體外抑菌作用較好，MIC分別達(dá)0.016，0.008 mg·mL-1；復(fù)方制劑III和V對(duì)大腸桿菌抑菌作用次之，MIC為0.063 mg·mL-1；復(fù)方制劑I抑菌作用最小，MIC為0.500 mg·mL-1，其菌落數(shù)隨藥物濃度升高呈降低趨勢(shì)。

2.3 治療試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，中藥復(fù)方制劑II治療組保護(hù)率為80.0%，頭孢曲松組為86.6%，對(duì)照組自然保護(hù)率為26.6%。表明中藥復(fù)方制劑II能有效控制人工感染致病大腸桿菌的雞發(fā)病，明顯降低了死亡率。

2.4 預(yù)防保護(hù)試驗(yàn)

由表4可知，中藥復(fù)方制劑II對(duì)人工感染的雞大腸桿菌病預(yù)防保護(hù)作用較好，其保護(hù)率為83.3%，與頭孢曲松的保護(hù)率大小一致。

2.5 人工感染病雞臨床變化

除健康組外，感染后20～24 h，試驗(yàn)組雞均出現(xiàn)不同程度的臨床癥狀：精神沉郁，食欲減退，呼吸困難，下痢，嚴(yán)重者出現(xiàn)死亡。剖檢可見心包膜炎，心包積液；肝臟表面有纖維素性滲出物；氣囊渾濁增厚。藥物治療組則癥狀輕微，剖檢病變不明顯。

3 討 論

本試驗(yàn)使用中藥水提液測(cè)定生藥MIC值。由于中藥成分復(fù)雜，因此其發(fā)揮抑菌作用可能是單一成分，也可能是幾種成分共同作用的結(jié)果[12]。

中藥復(fù)方經(jīng)配伍后，具有調(diào)節(jié)生理活性、調(diào)整畜禽機(jī)體內(nèi)環(huán)境平衡、促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)的功能[13]。本研究配制5 組中藥復(fù)方制劑水提物，其對(duì)大腸桿菌均有較好抑菌作用，且中藥復(fù)方制劑的抑菌作用均優(yōu)于單味中藥。試驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)方制劑II與復(fù)方制劑IV對(duì)大腸桿菌體外抑菌作用最好，MIC分別是0.016，0.008 mg·mL-1；復(fù)方制劑III與復(fù)方制劑V對(duì)大腸桿菌抑菌作用次之，MIC均為0.063 mg·mL-1；復(fù)方制劑I抑菌作用最低，MIC為0.500 mg·mL-1。且菌落數(shù)隨藥物濃度升高呈降低趨勢(shì)。

無論是人工感染還是自然感染的大腸桿菌病，都有發(fā)病急、死亡率高的特點(diǎn)，若不能及時(shí)治療，雞只常很快死亡[14-20]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，中藥復(fù)方制劑II與頭孢曲松均可有效控制人工感染大腸桿菌后桃源雞的臨床癥狀，明顯降低其死亡率。中藥復(fù)方制劑II與頭孢曲松對(duì)大腸桿菌病的治療率分別為80.0%和86.6%，二者均高于對(duì)照組。中藥復(fù)方制劑II對(duì)大腸桿菌病有較好的預(yù)防作用，保護(hù)率為83.3%，與頭孢曲松大小一致。

利用試管二倍梯度稀釋法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，僅能測(cè)定中藥制劑中是否具有直接抗菌的活性成分或含該抗菌成分活性的大小。因此，中藥復(fù)方制劑MIC值往往比西藥MIC值大。本試驗(yàn)測(cè)定的僅是中藥復(fù)方制劑在體外抑菌作用，當(dāng)藥物進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后能否達(dá)到有效抑菌作用，抑菌效果是加強(qiáng)或減弱，仍需進(jìn)一步研究。

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