劉建強(qiáng)+王銀+韋秀秀+李琦+黃大林

摘要：采用傳統(tǒng)的方法進(jìn)行分離、純化、篩選、檢測(cè)，得到氯苯類化合物的降解菌，對(duì)其降解率進(jìn)行研究，并通過(guò)16S rRNA進(jìn)行分離鑒定。結(jié)果表明，共篩選出4株具有降解活性的菌株，在18 ℃、pH 7.2時(shí)降解率較高。初步鑒定4株菌株分別為巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）、枯草芽孢桿菌（B. subtilis）、炭疽桿菌（B. anthraci）、同溫層芽孢桿菌（B. stratosphericus）。

關(guān)鍵詞：細(xì)菌；降解菌；降解率；氯苯類化合物

中圖分類號(hào)：X703；Q814 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）02-0245-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.02.011

隨著農(nóng)業(yè)科技的發(fā)展，出于對(duì)防治農(nóng)業(yè)害蟲的需要，農(nóng)藥的使用也愈加普遍，有機(jī)氯農(nóng)藥使用量也更大，其主要成分為氯苯類化合物，一些染料廠、制藥廠排放的污水中也含有氯苯類化合物。氯苯類化合物的殘?jiān)S著水土流失匯入河流湖泊，污染水源，由于它們中的大多數(shù)具有“三致”效應(yīng)和難降解性，危害環(huán)境，更危害人類健康，因此被美國(guó)環(huán)保局（EPA）列為優(yōu)先控制的污染物[1]。

氯苯類化合物化學(xué)性質(zhì)較為穩(wěn)定，在環(huán)境中普遍存在。目前針對(duì)污水中殘存的氯苯類化合物，一些地區(qū)仍采用比較傳統(tǒng)的方法處理污水，以及近年來(lái)采用氧化法、生物法以及活性污泥法等[2]，不僅成本高，而且處理流程繁瑣。本研究采用微生物降解氯苯類化合物的方法，將會(huì)為氯苯類化合物的高效處理提供理論基礎(chǔ)，現(xiàn)將報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試水樣 分別從桂林市制藥廠、染料廠、漓江、桃花江等水域采集水樣，采集樣品的深度為15～20 cm，樣品間相距至少2 cm。

1.1.2 試劑與儀器 主要試劑有鄰二氯苯、間二氯苯、石油醚等，均為分析純，通用引物和PCR試劑盒由上海生工公司提供。主要儀器有干熱滅菌器和高壓滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）、5424R低溫高速離心機(jī)和TG-20高速離心機(jī)（武漢中科科儀技術(shù)發(fā)展有限公司）、漩渦振蕩器（上海振榮科學(xué)有限公司）、OLYMPUS生物顯微鏡BX41-32FL和T100 PCR儀（Bio-Rad公司）、凝膠成像儀（上海培清科技有限公司）、旋轉(zhuǎn)式搖床ZHWY-211C（上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司）。

1.1.3 培養(yǎng)基 無(wú)機(jī)液體培養(yǎng)基：KNO3 0.1 g、微量元素液（KH2PO4 0.300 g、MgSO4·7H2O 0.300 g、FeSO4·7H2O 0.005 g、CaCl2 0.050 g溶于100 mL去離子水中）10 mL，加去離子水90 mL，pH 7.0～7.4，于121.3 ℃滅菌15 min。

有機(jī)液體培養(yǎng)基：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、去離子水1 000 mL，pH 7.2～7.4，于121.3 ℃滅菌15 min。

有機(jī)固體斜面培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中，加入瓊脂粉33 g/L，配制相應(yīng)的有機(jī)固體培養(yǎng)基，制成試管斜面。

1.2 方法

1.2.1 菌株篩選 ①初篩：用移液管移取1 mL水樣加入到盛有9 mL的無(wú)機(jī)液體培養(yǎng)基的試管中，同時(shí)加入鄰二氯苯、間二氯苯各6 μL，于25 ℃、160 r/min的搖床里培養(yǎng)48 h。②復(fù)篩：48 h后將基礎(chǔ)元素培養(yǎng)液移接到固體培養(yǎng)基中，恒溫箱37 ℃培養(yǎng)24～48 h直至長(zhǎng)出多個(gè)菌落，觀察細(xì)菌長(zhǎng)勢(shì)。

1.2.2 分離純化 ①在上述固體培養(yǎng)基中，挑選出不同菌落并作好標(biāo)記。②將含單個(gè)菌落的平板中的菌落接種到固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24～48 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，以此方法直至培養(yǎng)得到單個(gè)菌落的平板。將單個(gè)菌落的平板中一個(gè)菌落接種到固體斜面培養(yǎng)基上保存。③從斜面取菌接種到含有鄰二氯苯和間二氯苯各10 μL，濃度為20 μL/10 mL的無(wú)機(jī)液體培養(yǎng)基中，于25 ℃、160 r/min的搖床里培養(yǎng)48 h。

1.2.3 降解率的測(cè)定 ①制備菌懸液挑取一環(huán)菌株，接種于含有12 μL/10 mL氯苯（鄰二氯苯、間二氯苯各6 μL）有機(jī)液體培養(yǎng)基中，于25 ℃、160 r/min的搖床里培養(yǎng)24 h，3 500 r/min離心5 min，用無(wú)機(jī)液體培養(yǎng)基洗滌菌體3次，取部分菌體懸浮于無(wú)機(jī)液體養(yǎng)基中，配制一定濃度的菌懸液，備用。②從上述菌懸液中吸取1 mL接種在含氯苯化合物的無(wú)機(jī)液體培養(yǎng)基中，25 ℃分別培養(yǎng)24（第一次）、48、72 h（第二次）后分別用石油醚萃取，用紫外分光光度計(jì)（UV）（λ=221 nm）檢測(cè)上清液中氯苯的含量。對(duì)照組為不含菌株含氯苯化合物的同樣的無(wú)機(jī)液體培養(yǎng)基，采用與處理相同的方法檢測(cè)上清液中氯苯的含量（用吸光度表示）。降解率=（測(cè)定值-初始值）/初始值。篩選出具有降解活性的4株菌株，分別命名為GY1、GY2、GY3、GY4。

1.2.4 總DNA的提取 將5 μL的DNA提取液（5% Chelex 100 Resin）加入到1.5 mL的EP管中，從平板上取米粒大小的細(xì)菌菌落加入到EP管中，在100 ℃沸水浴中煮沸15 min。將煮沸后的EP管 12 000 r/min離心1 min，吸取上清液即得到菌株總DNA，作為PCR的模板。

1.2.5 PCR擴(kuò)增 通用引物采用16S rRNA，PCR擴(kuò)增：正向引物Pf：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物Pr：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′[3]。PCR反應(yīng)體系（50 μL）為：Taq SuperMix 25 μL，27F引物和1492R引物各2 μL，DNA模板（10～100 ng） 2 μL，去離子水19 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸 2 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.2.6 PCR產(chǎn)物電泳及測(cè)序 經(jīng)PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳、凝膠成像儀成像觀察后，將PCR產(chǎn)物送往上海英俊生物技術(shù)有限公司進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.7 序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 根據(jù)測(cè)序結(jié)果，利用Blast軟件對(duì)GenBank、EMBL等數(shù)據(jù)庫(kù)中相似目的菌的16S rRNA序列進(jìn)行搜索排序，使用ClustalW軟件對(duì)2種菌株的16S rRNA進(jìn)行序列比對(duì)，利用MEGA 6.2軟件，采用鄰接法（Neighbour-joining）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建及同源性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解率

分別于24、48、72 h測(cè)定菌株GY1、GY2、GY3、GY4殘留氯苯的吸光度，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，第一次為培養(yǎng)24 h氯苯殘留物的吸光度平均值，第二次為培養(yǎng)72 h氯苯殘留物的吸光度平均值，表明隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株的吸光度明顯降低。對(duì)比發(fā)現(xiàn)4株目的菌株間降解率相差不大，均超過(guò)60%，明顯高于對(duì)照組。

2.2 PCR產(chǎn)物

以16S rRNA為參比模板（M），對(duì)4株目的菌株進(jìn)行電泳分析。結(jié)果（圖2）表明，4株菌DNA都在1 500 bp左右。

2.3 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

根據(jù)測(cè)序結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。初步鑒定GY1菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），GY2菌株為巨大芽孢桿菌（B. megaterium），GY3菌株為炭疽桿菌（B. anthraci），GY4菌株為同溫層芽孢桿菌（B. stratosphericus）。

3 小結(jié)與討論

國(guó)內(nèi)對(duì)于篩選污水中氯苯化合物的研究已取得部分成果。楊洪江等[4]通過(guò)富集馴化的方法，從化工廠排污口的污泥中分離篩選了多株降解氯苯的菌屬如鏈球菌屬、伯克霍爾德菌屬、假單胞菌屬等；王芳等[5]采用同位素示蹤法從氯苯污染土壤中篩選到能將1，2，4-三氯苯高效降解為CO2的細(xì)菌E3和F2，并且E3和F2能在含1，2，4-三氯苯的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中徹底降解1，2，4-三氯苯生成CO2，30 d降解率達(dá)到90%以上，其中58%和46%礦化為CO2，同時(shí)形成一定量的微生物生物量；王玉芬等[6]用球形紅細(xì)菌降解鄰二氯苯，在厭氧光照條件下球形紅細(xì)菌的最佳生長(zhǎng)和鄰二氯苯的最佳降解條件為pH 7.0，溫度為30 ℃，接種量10%，在該條件下，鄰二氯苯的去除率可達(dá)90%以上；何耀武等[7]在好氧和厭氧兩種條件下研究了1，2，4-三氯苯的降解，表明1，2，4-三氯苯的好氧降解和厭氧降解均遵循一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，在同樣水分、溫度及初始濃度條件下，1，2，4-三氯苯的好氧降解比厭氧降解迅速，其半衰期分別為1.89～5.86、5.07～19.08 d；宋蕾等[8]將能夠以1，2，4-三氯苯（1，2，4-TCB）為惟一碳源的混合物固著在活性炭上，考察其對(duì)土壤中1，2，4-TCB的降解效果以及活性炭對(duì)土壤中1，2，4-TCB的吸附特性，發(fā)現(xiàn)活性炭-微生物系統(tǒng)對(duì)土壤中1，2，4-TCB的降解效果優(yōu)于活性炭和游離微生物；宋蕾等[9]采用批量平衡法，研究顆?；钚蕴浚℅AB）對(duì)1，2，4-三氯苯（1，2， 4-TCB）的吸附特性，表明溫度為25 ℃、pH 7.0時(shí)吸附效果最好。如今又出現(xiàn)新興的細(xì)胞固定化技術(shù)，即通過(guò)化學(xué)或物理的手段將游離細(xì)胞固定在載體上來(lái)處理污水[1]。目前含有氯苯類化合物的污水降解可分為生物降解技術(shù)的探索及生物降解前預(yù)處理技術(shù)的探索。實(shí)際上這類污水的處理必須以生物降解聯(lián)合一種或多種有效的預(yù)處理方法，而這項(xiàng)處理技術(shù)的關(guān)鍵問(wèn)題是生物與非生物降解技術(shù)如何高效聯(lián)合[10]。

本次研究主要是從桂林水系中采取水樣，結(jié)果表明，桂林的水系中存在能夠降解氯苯類化合物的微生物，即GY1枯草芽孢桿菌、GY2巨大芽孢桿菌、GY3炭疽桿菌、GY4同溫層芽孢桿菌。利用微生物降解氯苯類化合物可以更好地減少治理污染水系的人力投入，也能夠減少一些副作用，符合當(dāng)今可持續(xù)發(fā)展的時(shí)代主題。相信在今后的環(huán)境污染水域的治理中，微生物將會(huì)起到越來(lái)越重要的作用。當(dāng)然，值得注意的是，氯苯類化合物的濃度對(duì)微生物降解率的影響較大，若濃度過(guò)高，超過(guò)生物降解和生物修復(fù)的范圍，則意味著無(wú)法從根本上解決水污染的問(wèn)題[11]，這也是未來(lái)污水降解研究的又一重要方向。

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