楊積鵬，朱艷，曹春梅，李寶軍，孫振紅，趙新民,李生娥，葛向珍

甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070

1 前沿

硫色鐮刀菌（Fusarium sulphureum)是引起馬鈴薯干腐病的重要病原物，可通過塊莖表皮的傷口、種薯帶菌或土壤傳播的方式侵入塊莖，導(dǎo)致貯藏期塊莖發(fā)病腐爛，整個(gè)塊莖僵縮或干腐 [1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，馬鈴薯貯藏病害平均病薯率約30%，其中由鐮刀菌引起的干腐型病薯約占90%，該菌還具有較強(qiáng)的分泌真菌毒素的能力，主要包括單端孢霉烯族毒素、玉米赤霉烯酮、串珠鐮刀菌素等，具有潛在的致癌性，容易引發(fā)食品安全隱患問題[2]。因此，F(xiàn). sulphureum引起的干腐病是限制馬鈴薯產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的重要采后病害之一[1]。

雖然化學(xué)殺菌劑處理能有效地控制馬鈴薯干腐病，但是，化學(xué)藥物的使用存在環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留、病原物易于產(chǎn)生抗藥性等危害[3]，因此，尋找新的有效控制F. sulphureum的方法尤為重要。綠原酸是果實(shí)是植物代謝中的重要次生代謝產(chǎn)物，具有清除自由基、抗氧化等作用[4]，對(duì)絲狀真菌也有一定的抑制作用，是安全無污染的植物源抗菌物質(zhì)[5]。但是有關(guān)綠原酸處理對(duì)F. sulphureum的抑制及對(duì)干腐病的控制研究還較少。

本試驗(yàn)以菌絲生長和孢子的萌發(fā)為指標(biāo)，研究了不同濃度綠原酸處理對(duì)F. sulphureum的抑制影響和對(duì)馬鈴薯干腐病的控制作用，以期為綠原酸在控制F. sulphureum引起的馬鈴薯貯藏病害提供部分理論依據(jù)。

2 材料和方法

2.1 材料與試劑

試供菌株F. sulphureum，為本實(shí)驗(yàn)室保存。綠原酸為分析純，購自Sigma-Aldrich上海貿(mào)易有限公司。馬鈴薯為隴薯3號(hào)（Solanum tuberosum Longshu No.3），購于甘肅省農(nóng)科院馬鈴薯研究所。

2.2 方法

2.2.1 病原菌的分離、純化和培養(yǎng)

參照方中達(dá)方法[6]，將菌株在PDA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)7d后用打孔器打直徑為0.5cm的小菌餅，于新鮮的PDA平板中28℃恒溫培養(yǎng)7d待用。2.2.2孢子懸浮液的配制

參照Bi等[7]方法。取培養(yǎng)好的菌體，加含0.05%Tween80的無菌水約10mL，用玻璃棒刮下平板上的孢子轉(zhuǎn)入三角瓶中，充分振蕩后，用雙層紗布過濾，濾液用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并稀釋至1×106個(gè)/mL。

2.2.3 MTT比色法確定綠原酸的抑菌濃度

采用Eloff等人的方法[8]并略做修改，96孔培養(yǎng)板在紫外線下照射10min后每孔加入無菌的PDB培養(yǎng)基、綠原酸的溶液、菌懸液及噻唑藍(lán)(MTT)指示劑，使指示劑的終濃度為0.5mg/mL，綠原酸的終濃度梯度依次為0、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10 mM，各濃度設(shè)3個(gè)平行。培養(yǎng)物在無菌條件下28℃保溫24h后，用全波長酶標(biāo)儀（Multiskan TM GO）在490nm波長處測(cè)定光吸收值，確定綠原酸的抑菌濃度，試驗(yàn)重復(fù)3次 。

2.2.4 綠原酸對(duì)F. sulphureum生長的影響

參照葛永紅方法[9]并改進(jìn)。將培養(yǎng)7d的F. sulphureum打成5mm的菌餅接種到添加濃度分別為2.5、5、10mM綠原酸的PDA上，以不添加綠原酸的PDA為對(duì)照，分別在3d、5d、7d后測(cè)量菌落直徑(十字交叉法)確定綠原酸對(duì)F. sulphureum 對(duì)菌落生長速度的影響。5mm的菌餅接種在PDB培養(yǎng)基中培養(yǎng)7d后過濾烘干菌絲，以菌絲干重測(cè)定綠原酸對(duì)菌絲生物量的影響。每個(gè)處理重復(fù)3次。

2.2.5 綠原酸對(duì)F. sulphureum孢子萌發(fā)的影響

參照葛永紅方法[9]并修改，將綠原酸分別加入含5mLPDB培養(yǎng)基的試管中，使其終濃度分別為0、2.5、5、10 mM，同時(shí)接種100μL的孢子懸浮液，28℃搖床（200 r/min）培養(yǎng)24h后，用載玻片在光學(xué)顯微鏡觀察孢子萌發(fā)情況，每個(gè)處理計(jì)數(shù)100個(gè)孢子，重復(fù)3次。

2.2.6 綠原酸處理后對(duì)F. sulphureum接種馬鈴薯切片病斑的抑制

參照Ray和Hammerschmidt的方法[10] ，選擇外觀整齊、無損傷的隴薯3號(hào)塊莖，經(jīng)次氯酸鈉擦洗后將塊莖切成一定厚度的切片，用打孔器打成切片，再經(jīng)酒精消毒后，置于已滅菌的濕濾紙上，在黑暗的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中25℃放置4h后，分別取500μL濃度為2.5、5、10 mM 的綠原酸溶液，用滅菌接種環(huán)均勻涂布后在25 ± 2℃的溫度下孵育24h后，接種7d菌齡直徑為4mm的F. sulphureum菌餅，每個(gè)處理共10個(gè)切片，以無菌水處理為對(duì)照。切片于黑暗的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中25℃放置3d，用十字交叉法測(cè)量病斑直徑，試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

全部試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2007計(jì)標(biāo)準(zhǔn)誤差并作圖，SPSS19.0進(jìn)行差異顯著性分析。圖中豎線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差（±SE），字母表示在P<0.05水平下具有統(tǒng)計(jì)學(xué)水平上的顯著差異性。

3 結(jié)果與分析

3.1 MTT比色法分析綠原酸對(duì)F. sulphureum的抑菌濃度

MTT比色法測(cè)定最小抑菌濃度的原理是基于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臢（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，使活細(xì)胞呈現(xiàn)藍(lán)色，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲臢，在490nm波長有特定的光吸收值，在一定細(xì)胞數(shù)量范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的甲臢與活細(xì)胞數(shù)成正比，因此，酶標(biāo)儀測(cè)得的吸光度值（OD490）可以判斷活細(xì)胞數(shù)量，OD值越大，細(xì)胞活性越強(qiáng)，藥物的抑制作用越小。由圖1可知，在490nm波長處，不加綠原酸的對(duì)照處理吸光值約為0.278±0.01。隨著綠原酸濃度的增大，吸光值逐漸降低，說明死細(xì)胞數(shù)逐漸增高。與對(duì)照相比，2.5 mM綠原酸處理后，死亡的細(xì)胞數(shù)表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著差異，5 mM綠原酸可極顯著抑制F. sulphureum，使其死亡。

圖1：不同濃度綠原酸處理對(duì)F. sulphureum吸光值的影響

3.2 綠原酸處理對(duì)F. sulphureum菌絲生長的影響

菌落直徑代表了一定時(shí)間F. sulphureum在PDA培養(yǎng)基上的徑向生長速度。如圖2A所示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，F(xiàn). sulphureum在PDA培養(yǎng)基上的菌落逐漸增大，但綠原酸均可抑制F. sulphureum的徑向擴(kuò)展速度，并呈現(xiàn)濃度效應(yīng)。F. sulphureum的菌絲生物量也能夠被檸檬酸有效抑制(圖2B)。與對(duì)照相比，2.5 mM的綠原酸處理菌絲干重減少了24.1%，10mM和15mM處理組中，菌絲生物量分別比對(duì)照組降低了55.6%和60.2%，在p<0.05的水平下均表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)水平的差異性。

圖2：不同濃度綠原酸處理對(duì)F. sulphureum菌絲生長的影響。A為菌落直徑，B為菌絲生長量

3.3 綠原酸處理對(duì)F. sulphureum孢子萌發(fā)的影響

不同濃度的綠原酸孵育培養(yǎng)24 h后，F(xiàn). sulphureum的孢子萌發(fā)率表現(xiàn)不同。對(duì)照組、2.5mM 、5mM和10mM處理組孢子萌發(fā)率分別為39.72%、22.79%、12%和10.05%。與對(duì)照相比，2.5mM綠原酸使孢子的萌發(fā)率降低了42.62%，5mM綠原酸處理后，孢子萌發(fā)被顯著抑制，降低了69.79%（圖3）。這些結(jié)果說明不同濃度的綠原酸在孢子啟動(dòng)萌發(fā)過程中，具有一定的調(diào)節(jié)作用，抑制了孢子的萌發(fā)，且隨著濃度的增高，這種抑制作用越明顯。

圖3：不同濃度綠原酸處理對(duì)F. sulphureum孢子萌發(fā)的影響

3.4 綠原酸處理對(duì)接種馬鈴薯切片病斑直徑的影響

隴薯3號(hào)馬鈴薯是甘肅省主栽的重要高淀粉品種，但存在易感病不耐貯藏的特點(diǎn)，因此，試驗(yàn)選擇隴薯3號(hào)研究綠原酸處理對(duì)干腐病發(fā)生的影響。由圖4可知，綠原酸孵育后接種F. sulphureum菌餅，3d后切片均發(fā)病。對(duì)照組、2.5mM 、5mM和10mM處理組病斑直徑（未去除菌餅的直徑）分別為18mm、10mm、7mm和6.8mm。與對(duì)照相比，2.5mM綠原酸使隴薯3號(hào)馬鈴薯干腐病病斑直徑的擴(kuò)展降低了44.44%，在P<0.05水平上具有顯著差異。

圖4：不同濃度綠原酸處理對(duì)F. sulphureum馬鈴薯切片在不同培養(yǎng)時(shí)間下的病斑直徑

4 結(jié)論

綠原酸能有效抑制F. sulphureum孢子萌發(fā)、菌落直徑和菌絲生物量，同時(shí)可顯著抑制感病馬鈴薯隴薯3號(hào)的干腐病的發(fā)生，抑制效果與濃度呈正相關(guān)。

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