李芬芳，馬艷弘，趙密珍，黃開紅，段云青

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 文理學(xué)院，山西 太谷 030801； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014;3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝學(xué)院，江蘇 南京 210014； 4.萬山紅遍生物科技有限公司，江蘇 句容 212403)

超聲波輔助提取草莓多酚的工藝優(yōu)化

李芬芳1,2，馬艷弘2，趙密珍3，黃開紅4，段云青1*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 文理學(xué)院，山西 太谷 030801； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014;3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝學(xué)院，江蘇 南京 210014； 4.萬山紅遍生物科技有限公司，江蘇 句容 212403)

[目的]采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化草莓多酚的超聲波輔助提取工藝參數(shù)，為草莓多酚的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供參考。[方法]考查了料液比、乙醇濃度、超聲功率及超聲時(shí)間對(duì)草莓中多酚得率的影響，在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上用Box-Benhnken法進(jìn)行3因素3水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì),以多酚得率為響應(yīng)值，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，并建立二次多項(xiàng)回歸數(shù)學(xué)模型，優(yōu)化草莓多酚的提取工藝。[結(jié)果]超聲波輔助乙醇提取草莓中總多酚最佳工藝為：當(dāng)料液比為1∶30 g·mL-1時(shí)，乙醇濃度60%，超聲功率585 W、超聲時(shí)間25 min，在此條件下草莓多酚得率為10.959 mg·g-1。[結(jié)論]與常規(guī)提取法相比，超聲波輔助提取工藝提取率具有提取時(shí)間短，提取溶劑用量少，提取效率高的優(yōu)點(diǎn)。

草莓； 多酚； 超聲波輔助提??； 響應(yīng)面法

草莓(FragariaananassaDuch)是世界七大水果之一[1]，別名紅莓、蛇莓等,屬薔薇科草莓屬多年生草本植物，其肉質(zhì)紅嫩、酸甜爽口，富含多酚、花色苷、維生素C、多糖以及其他次生代謝產(chǎn)物[2,3]，抗氧化活性強(qiáng)[4～6]，具有預(yù)防動(dòng)脈硬化、降血脂、降血壓以及增強(qiáng)免疫力等多種生理功能[7～9]，在國內(nèi)外市場(chǎng)極其暢銷。其中植物多酚作為草莓最主要的抗氧化物質(zhì)基礎(chǔ)，已成為眾多研究者關(guān)注的焦點(diǎn)。

目前，草莓多酚的提取主要采取有機(jī)溶劑萃取法，具有溶劑用量大、提取率低、對(duì)生物活性破壞大、容易造成環(huán)境污染等缺點(diǎn)，很難實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。而超聲提取法可利用超聲波所特有的空化效應(yīng)破壞植物細(xì)胞壁，使植物中的生理活性物質(zhì)在較低溫度下實(shí)現(xiàn)釋放、擴(kuò)散及溶解，具有常規(guī)提取法提取不可比擬的優(yōu)勢(shì)[10,11]。目前多酚的超聲提取僅在藍(lán)莓、茶葉、石榴等少數(shù)植物中研究報(bào)道，有關(guān)草莓多酚的超聲輔助提取法仍未見報(bào)道。鑒于此，本研究采用超聲波輔助提取法提取草莓多酚，并通過響應(yīng)面分析法中的Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)一步優(yōu)化其工藝參數(shù)，以期為草莓多酚的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

寧玉草莓：由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所提供，所有草莓從基地隨機(jī)采摘，挑選出無物理損傷成熟度一致的鮮草莓供試驗(yàn)使用；福林酚試劑(1N)：購自源葉生物技術(shù)有限公司；無水乙醇、沒食子酸、碳酸鈉：購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FDU-1200真空冷凍干燥機(jī)：南京載智自動(dòng)化設(shè)備有限公司；FW100高速萬能粉碎機(jī)：天津泰斯特儀器有限公司；DK-8D型電熱恒溫水槽：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；KH-500E型變頻超聲波儀，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；UV-1600型紫外可見分光光度計(jì)：上海奧析科學(xué)儀器有限公司；JJ-500電子天平：常熟市雙杰測(cè)試儀器廠；XO-1000D超聲波細(xì)胞破碎儀，南京先歐儀器制造有限公司；TGL-16B臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 草莓多酚得率測(cè)定[12]

多酚含量的測(cè)定采用Folin-Ciocalteu法測(cè)定。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 g·L-1的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液分別取1 mL，加5 mL蒸餾水，1 mL Folin-Ciocalteu顯色劑，3 mL 7.5%碳酸鈉溶液，混勻，45 ℃水浴1.5 h后，于760 nm處測(cè)定吸光度。以沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得回歸方程為：y=0.0113x+0.002，相關(guān)系數(shù)R2=0.9998。

1.3.3 多酚提取得率的測(cè)定

取1 mL草莓多酚提取液，依次加入5 mL蒸餾水，1 mL Folin-Ciocalteu顯色劑，3 mL 7.5%碳酸鈉溶液，混勻，45 ℃水浴1.5 h，在760 nm處測(cè)吸光度。按照所得標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算草莓多酚含量，再按照如下公式計(jì)算多酚提取得率：

多酚得率(按沒食子酸計(jì))/mg·g-1=(C×v/m)×100%，

式中，C為多酚質(zhì)量濃度/g·L-1；v為多酚提取液總體積/mL；m為草莓粉總質(zhì)量/g。

1.3.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以凍干的寧玉草莓粉為提取原料，提取液為一定質(zhì)量濃度的乙醇溶液，分別考察料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g·mL-1)、乙醇濃度(30%、40%、50%、60%、70%、80%)、超聲功率(200、300、400、500、600、700 W)、超聲時(shí)間(5、10、15、20、25、30 min)對(duì)草莓多酚提取率的影響，確定草莓多酚提取的最適提取條件。

1.3.5 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在草莓多酚提取單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取乙醇濃度、超聲功率、超聲時(shí)間3因素為自變量，以多酚得率為響應(yīng)值，采用Box-Benhnken中心組合法設(shè)計(jì)3因素3水平的優(yōu)化試驗(yàn)，通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化草莓中多酚的最佳提取工藝條件。試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 草莓多酚超聲波輔助乙醇提取工藝響應(yīng)面分析試驗(yàn)的因素與水平

Table 1 Variables and their coded levels in response surface analysis

水平Level因素FactorsA:乙醇濃度/%EthanolconcentrationB:超聲功率/WUltrasounicpowerC:超聲時(shí)間/minUltrasounictime-140400150505002016060025

2 結(jié)果與分析

2.1 草莓多酚提取單因素試驗(yàn)

2.1.1 料液比對(duì)草莓多酚得率的影響

固定乙醇濃度為50%，超聲波功率為500 W，超聲時(shí)間為20 min，考察料液比對(duì)草莓多酚得率的影響，結(jié)果見圖1。如圖1所示，在料液比小于1∶30(g∶mL)范圍內(nèi)，多酚得率隨著溶劑量逐漸增大逐漸提高；當(dāng)達(dá)料液比達(dá)1∶30(g∶mL)時(shí)，多酚得率可高達(dá)17.52 mg·g-1。繼續(xù)增大料液量，提取率不發(fā)生顯著變化，故可確定草莓多酚提取的最適料液比1∶30(g∶mL)。

圖1 料液比對(duì)草莓多酚提取率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of polyphenolic from strawberry

2.1.2 乙醇濃度對(duì)草莓多酚得率影響

固定草莓多酚提取的料液比為1∶20 g·mL-1，超聲波功率為500 W，超聲時(shí)間為20 min，考察乙醇濃度對(duì)草莓多酚得率的影響，結(jié)果見圖2。如圖2所示，當(dāng)乙醇濃度小于50%時(shí)，草莓多酚得率隨著乙醇濃度的增大而逐漸提高，當(dāng)乙醇濃度為 50%時(shí)，草莓多酚的得率為11.54 mg·g-1；反之，乙醇濃度大于50%后，草莓多酚得率隨著乙醇濃度的增大而逐漸降低。這可能是由于過高濃度的乙醇溶液會(huì)引起細(xì)胞蛋白質(zhì)的變性，或是導(dǎo)致了溶劑與多酚極性差異逐漸增大，致使多酚得不到充分的溶解，從而導(dǎo)致了得率的降低[13]。由此確定草莓多酚提取的最佳乙醇濃度為50%。

圖2 乙醇濃度對(duì)草莓多酚得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction rate of polyphenolic from strawberry

圖3 超聲波功率對(duì)草莓多酚得率的影響Fig.3 Effects of ultrasounic power on extraction rate of polyphenolic from strawberry

2.1.3 超聲功率對(duì)草莓多酚的率影響

固定料液比為1∶20 g·mL-1，50%的乙醇溶液，超聲時(shí)間20 min，考察超聲功率對(duì)草莓多酚得率的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可以看出，隨著超聲功率的提高，草莓多酚得率逐漸提高，到超聲波功率達(dá)到500 W時(shí)，草莓多酚得率達(dá)到最大；之后隨著超聲波功率的增加，多酚得率呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。這主要是由于較高超聲功率的空化作用致使提取體系高溫升高，從而導(dǎo)致了多酚的降解。據(jù)此可確定草莓多酚的最佳提取超聲功率為500 W。

2.1.4 超聲時(shí)間對(duì)草莓多酚提取影響

圖4 超聲時(shí)間對(duì)草莓多酚得率的影響Fig.4 Effects of ultrasounic time on extraction rate of polyphenolic from strawberry

固定料液比1∶20 g·mL-1，乙醇濃度為50%，超聲波功率為500 W，考察不同超聲時(shí)間對(duì)草莓多酚得率的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，當(dāng)超聲時(shí)間為20 min 時(shí)，多酚得率最高；當(dāng)超聲時(shí)間大于20 min 時(shí)，多酚得率呈下降趨勢(shì)。這是由于長時(shí)間的超聲波作用積累了較多熱量，從而導(dǎo)致了多酚類降解。因而可確定草莓多酚提取的最佳超聲時(shí)間為20 min。

2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化工藝條件

2.2.1 響應(yīng)面法設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取乙醇濃度(A)、超聲功率(B)、超聲時(shí)間(C)為因素，草莓多酚得率為響應(yīng)值，按照Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化草莓多酚的提取工藝條件。其試驗(yàn)結(jié)果見表2。

應(yīng)用Design Expert8.0.6.1軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析，得到的回歸方程為：

Y=10.26+0.38A+0.43B+0.28C+0.16AB+0.054AC+0.22BC-0.35A2-0.46B2-0.30C2

(1)

表2 草莓多酚超聲波輔助乙醇提取工藝響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

序號(hào)NumberA:乙醇濃度/%EthanolconcentrationB:超聲功率/WUltrasounicpowerC:超聲時(shí)間/minUltrasounictimeY:多酚得率/mg/gYieldoftotalpolyphenols100010.25420-119.1443-1-108.858410-19.708501110.4856-10-19.0137-1019.401811010.356901-19.4241000010.4021110110.311120-1-18.9471300010.11214-109.332151-109.236

表3 方差分析結(jié)果

注：**，影響極顯著，P<0.01；*，影響顯著，P<0.05；N，影響不顯著，P>0.05。

Note: **, the effect is very significant,P<0.01; *, the effect is significant,P<0.05; N, the effect is not significant,P>0.05.

圖5 乙醇濃度、超聲功率及超聲時(shí)間單的交互作用對(duì)草莓多酚得率的影響Fig.5 Response surface plot for the effect of cross-interaction between ethanol concentration , ultrasound power, ultrasound time on the extraction rate of polyphenols from strawberry

2.2.2 響應(yīng)面圖分析與優(yōu)化

繪制乙醇濃度、超聲功率、超聲時(shí)間等3個(gè)變量之間交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖，由圖5a可見，乙醇濃度與超聲功率交互作用的響應(yīng)面坡度較陡，二者交互作用顯著[15,16]；同一超聲功率下，隨著乙醇濃度的增加，提取率增加；與之相比，在同一乙醇濃度的水平下，隨著超聲功率的增加，提取率達(dá)到最高后隨即下降。由5b可見，乙醇濃度與超聲時(shí)間交互作用的響應(yīng)面坡度較平緩，等高線呈圓形，說明二者交互作用不顯著，隨著乙醇濃度和超聲時(shí)間的增加，提取率增加幅度均較為緩慢。由圖5c可見，超聲功率與超聲時(shí)間交互作用的響應(yīng)面坡度較陡，等高線呈橢圓狀，二者交互作用較顯著；在同一超聲時(shí)間下，隨著超聲功率的增大多酚得率增加較快；與之相比，在同一超聲功率的水平下，隨著超聲時(shí)間的增加，多酚得率增加幅度緩慢。通過以上分析可得出，乙醇濃度、超聲功率對(duì)多酚提取量影響比較大，超聲時(shí)間對(duì)多酚提取量影響最小，與方差分析結(jié)果一致。

2.2.3 響應(yīng)面最優(yōu)提取工藝條件及驗(yàn)證試驗(yàn)

通過軟件分析得到草莓多酚超聲波輔助乙醇最佳提取工藝：乙醇濃度為60%，超聲功率為584.54 W，超聲時(shí)間為24.36 min。在此條件下，草莓多酚得率為10.675 mg·g-1。為了操作方便，修正最佳提取工藝條件為：在超聲功率為585 W，料液比為1∶30 g·mL-1的條件下，選擇乙醇濃度為60%，超聲時(shí)間為25 min進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，多酚得率平均值為10.959 mg·g-1，實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值接近，表明此回歸模型科學(xué)可靠，可以用來預(yù)測(cè)超聲波輔助乙醇提取草莓多酚。

3 結(jié)論

草莓是國內(nèi)外市場(chǎng)上深受消費(fèi)者喜愛的特色保健漿果，但草莓的易腐特性常常會(huì)導(dǎo)致草莓豐產(chǎn)不豐收。因此，采用深加工技術(shù)開發(fā)各類草莓多酚營養(yǎng)保健品是草莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必然途徑。

本研究在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取乙醇濃度、超聲功率及超聲時(shí)間三個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面分析，通過Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過響應(yīng)面分析法發(fā)現(xiàn)乙醇濃度、超聲功率、超聲時(shí)間3個(gè)因素對(duì)草莓多酚得率的影響程度大小依次為：超聲功率>乙醇濃度>超聲時(shí)間；草莓多酚的最佳提取工藝條件為：乙醇濃度60%，超聲功率585 W、超聲時(shí)間25 min，在此條件下試驗(yàn)得到的多酚提取率(按沒食子酸計(jì))為10.959 mg·g-1。驗(yàn)證試驗(yàn)表明該數(shù)據(jù)與模型預(yù)測(cè)值極其接近，表明了響應(yīng)面法分析獲得的回歸模型能夠可靠地對(duì)草莓多酚得率進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。該工藝節(jié)能環(huán)保，可以為草莓多酚的工業(yè)化生產(chǎn)起到很好的指導(dǎo)作用，為草莓產(chǎn)品的深加工提供進(jìn)一步的工藝參數(shù)。

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(編輯：馬榮博)

Optimization on polyphenols ethanol extraction from strawberry by ultrasonic-assisted

Li Fenfang1,2, Ma Yanhong2, Zhao Mizhen3, Huang Kaihong4, Duan Yunqing1*

(1.CollegeofArtsandSciences,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China; 2.InstituteofAgriculturalProductsProcessing,JiangsuAcademyofAgriculturalSciences,Nanjing210014,China; 3.InstituteofHorticulture,JiangsuAcademyofAgriculturalSciences,Nanjing210014,China; 4.WanshanhongbianBiotechnologyLtd.,Jurong212403,China)

[Objective]To optimize the ultrasonic-assisted extraction parameters of total polyphenols in strawberry by response surface methodology, in order to provide reference for industrial production of strawberry polyphenols.[Methods]The influence on the technology caused by the liquid-to-solid ratio, ethanol concentration, ultrasonic time and ultrasonic power were investigated. The data were analyzed by Box-Benhken central composite experiment design depended on the results of single-factor experiments. Response surface analysis was applied to create the two multinomial mathematical in order to optimize the extraction process of polyphenol from strawberry. [Results]When the ratio of material to liquid was 1∶30 g · mL-1，the results showed that the optimum parameters for extracting from strawberry were 60% ethanol，ultrasonic power 585 W，ultrasonic time 25 min. Under the condition, the yield of strawberry polyphenols was 10.959 mg·g-1. The results showed that the extraction yield of strawberry by ultrasonic extraction was higher than it of the ethanol refluxing extraction，ultrasonic extraction was faster and needed less solvent，which were superior to solvent extraction method.

Strawberry, Total polyphenols, Ultrasonic assisted extraction, Response surface method(RSM)

2016-11-09

2016-12-29

李芬芳(1991-)，女(漢)，河南洛陽人，碩士研究生，研究方向：生化分析

*通信作者：段云青，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師。Tel:13934086398;E-mail: duan_yq@sina.com

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)引進(jìn)人才基金項(xiàng)目(XB2009004)；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目(CX(15)1021);句容市農(nóng)業(yè)科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(NY2016228842)

TS201.1

A

1671-8151(2017)03-0207-07