人參莖葉皂甙對鴨禽流感疫苗的免疫增強(qiáng)作用和抗氧化功能的影響

楊金保+張琳+李兆華+李禹濤+吳媛媛+劉紅巖+吳家強(qiáng)

摘要：為探討人參莖葉皂甙（GSLS）對鴨流感疫苗的免疫增強(qiáng)作用和抗氧化功能的影響，給鴨群飲水口服GSLS，同時接種禽流感疫苗，通過檢測血清抗AIV特異性HI效價、免疫器官指數(shù)、淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化指數(shù)、細(xì)胞因子和腸黏膜SIgA水平，評價GSLS的免疫增強(qiáng)作用；通過測定血清丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）含量，評價GSLS對機(jī)體抗氧化功能的影響。結(jié)果表明：在28和35日齡時，飲水口服中劑量GSLS組鴨血清抗AIV特異性HI效價顯著高于對照組（P<0.05），與1份疫苗組相比，免疫后2、3、4周，飲水口服GSLS能誘導(dǎo)機(jī)體對0.75份疫苗抗原產(chǎn)生的HI效價提高，但是差異不顯著（P>0.05），1份+GSLS組鴨血清抗AIV特異性HI效價顯著提高（P<0.05）；飲水口服GSLS能顯著增強(qiáng)鴨脾臟和法氏囊指數(shù)（P<0.05），顯著提高受ConA刺激產(chǎn)生的脾淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化指數(shù)，顯著或不顯著提高脾淋巴細(xì)胞上清中IFN-γ（Th1）和IL-4（Th2）水平，顯著提高鴨腸黏膜SIgA含量；飲水口服中劑量GSLS組血清MDA和SOD含量分別顯著低于和高于對照組（P<0.05）。因此，飲水口服GSLS具有增強(qiáng)鴨群對禽流感疫苗的免疫應(yīng)答水平和機(jī)體抗氧化功能的作用。

關(guān)鍵詞：禽流感疫苗；人參莖葉皂甙；肉鴨；免疫增強(qiáng)作用；抗氧化功能

AbstractTo discuss the effects of GSLS on immunopotentiation to AI vaccine and antioxidation of body， the ducks were orally-administrated GSLS and then subcutaneously immunized with AI vaccine. The blood samples were collected to detect the specific hemagglutination inhibition （HI） titers， immune organs index， lymphocyte proliferation and transformation index， cell factor and intestinal mucosa SIgA level， then the immunopotentiation of GSLS was evaluated. The contents of malondialdehyde （MDA） and superoxide dismutase（SOD） in serum were detected to evaluate the effects of GSLS on body antioxidation. The results showed that compared with the conventional breeding management， orally-administrated middle-dose GSLS group could significantly increase the serum HI titer of 28-and 35- day-old ducks， significantly decreased the content of MDA， and significantly increased the level of SOD in ducks injected with AI vaccine. Compared with the one dose of vaccine， orally-administrated GSLS could improve the HI titer of 0.75 dose of vaccine without significant difference and significantly improve the HI titer of one dose of vaccine after immunized for 2， 3 and 4 weeks. Compared with the group immunized with AI vaccine alone， orally-administrated GSLS could significantly improve the indexes of spleen and bursa of Fabricius， splenic lymphocyte proliferation and transformation index stimulated by ConA， secretion of SIgA on intestinal， and significantly or not significantly improve the IFN-γ（Th1）and IL-4（Th2） levels in serum of splenic lymphocyte of ducks. Therefore， oral administration of GSLS enhanced the immune responses to AI vaccine and antioxidation of ducks.

KeywordsAvian influenza vaccine； Ginseng stem and leaf saponin； Meat duck； Immunopotentiation； Antioxidation

鴨流感（aivan influenza，AI）是由AIV引起的一種病毒性人畜共患傳染病，家禽、水禽及一些野生鳥類均易感染，能造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。鴨在AIV流行過程中容易成為流感病毒貯庫，存在向其它易感動物、人類等散播病毒的潛在危害，容易引發(fā)重大公共安全問題[1]。目前，對鴨流感的防控除采用嚴(yán)格的生物安全措施外，主要措施是給易感鴨群接種禽流感疫苗。雖然已經(jīng)在養(yǎng)鴨業(yè)中廣泛采取接種商業(yè)化禽流感疫苗的措施，但是畜禽臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn)，存在鴨群禽流感抗體水平參差不一，抗體水平不高，甚至在養(yǎng)殖業(yè)中仍常見有鴨群禽流感免疫失敗的現(xiàn)象發(fā)生[2]。因此，研究提高鴨禽流感疫苗免疫效果對于提高鴨流感的防控技術(shù)水平具有重要意義。

皂甙是由甙元與糖相連構(gòu)成的糖甙類化合物，是中藥人參的有效成分之一，研究發(fā)現(xiàn)其對神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)產(chǎn)生廣泛的藥理作用[3]，是人參發(fā)揮補(bǔ)氣安神的藥理作用基礎(chǔ)之一。人參皂甙廣泛來源于人參的根、莖、葉、花等部位[4]，人參莖葉皂甙（GSLS）就是從人參的莖和葉中提取的總皂甙。與根皂甙相比，GSLS來源于中藥人參收獲的廢棄部分——莖和葉，在畜牧業(yè)中推廣具有比較明顯的成本優(yōu)勢。而且，研究發(fā)現(xiàn)GSLS具有類似于根皂甙的多種皂甙單體，有些單體含量甚至高于根皂甙中的含量[5]。目前，已經(jīng)有GSLS調(diào)節(jié)小鼠、雞等動物免疫功能的研究報道，但尚未見在肉鴨上的研究報道。因此，有必要開展GSLS調(diào)節(jié)肉鴨免疫功能的研究，為提高鴨流感防控技術(shù)水平和養(yǎng)殖效益提供重要的理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料

GSLS（吉林省宏久生物科技股份有限公司），ConA和LPS（美國Sigma公司提供），AI滅活疫苗（哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司），SIgA、MDA（malondialdehyde， 丙二醛）、SOD（superoxide dismutase， 超氧化物歧化酶）、IL-4和IFN-γ等ELISA試劑盒（北京華英生物技術(shù)研究所）。

1.2試驗動物

1日齡櫻桃谷鴨，購自濰坊某肉鴨養(yǎng)殖場。

1.3儀器設(shè)備

二氧化碳培養(yǎng)箱（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司）；恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；生物安全柜（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；酶標(biāo)儀（美國熱電公司）。

1.4試驗方法

試驗一：將1日齡肉鴨分成4組，每組50只，分別設(shè)對照組、高劑量組、中劑量組和低劑量組。對照組給予正常的飼養(yǎng)管理，高、中、低劑量組分別在5～14日齡時飲水口服12、6、3 mg/kg bodyweight（BW）的GSLS。在14日齡時給肉鴨接種1份AI滅活疫苗。分別在1、7、14、21、28、35和42日齡時對肉鴨進(jìn)行稱重和采血，離心分離血清，檢測血清抗AIV特異性HI效價，并測定28日齡各組抗氧化指標(biāo)（MDA和SOD）變化。每次試驗操作按照先稱重，再采血，然后飲水給藥，最后接種疫苗的順序進(jìn)行。HI效價測定采用血凝抑制（HI）試驗，參照《高致病性禽流感診斷技術(shù) GBT 18936—2003》操作步驟進(jìn)行。MDA和SOD參照北京華英生物技術(shù)研究所試劑盒說明書進(jìn)行操作。

試驗二：將1日齡健康肉鴨分成5組，每組50只。分別設(shè)1份疫苗組、1份+GSLS組、0.75份+GSLS組、0.5份+GSLS組、0.25份+GSLS組。1份疫苗組，在14日齡時接種1份AI滅活疫苗；1份+GSLS組，在14日齡時接種1份AI滅活疫苗，并在5～14日齡期間飲水口服由試驗一確定的劑量即6 mg/kg BW的GSLS；0.75份+GSLS組，在14日齡時接種0.75份AI滅活疫苗，并在5～14日齡期間飲水口服6 mg/kg BW的GSLS；0.5份+GSLS組，在14日齡時接種0.5份AI滅活疫苗，并在5～14日齡期間飲水口服6 mg/kg BW的GSLS；0.25份+GSLS組，在14日齡時接種0.25份AI滅活疫苗，并在5～14日齡期間飲水口服6 mg/kg BW的GSLS。各組分別在免疫后0、1、2、3和4周齡時對肉鴨進(jìn)行稱重和采血，離心分離血清，檢測血清抗AIV特異性HI效價。每次試驗操作按照先稱重，再采血，然后飲水給藥，最后接種疫苗的順序進(jìn)行。在免疫后1、2和3周齡時，對1份組和1份+GSLS組肉鴨，每組取8只，頸部放血處死，無菌操作摘取脾臟、胸腺和法氏囊，進(jìn)行稱重，測定免疫器官指數(shù)（免疫后2周）；制備脾淋巴細(xì)胞懸液，測定淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化水平（免疫后2周）和脾淋巴細(xì)胞上清中細(xì)胞因子（IL-4和IFN-γ）分泌水平（免疫后2周和3周）；收集空腸，刮取腸黏膜，進(jìn)行腸道SIgA濃度測定（免疫后1周和2周）。免疫器官指數(shù)和淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化指數(shù)測定參照相關(guān)文獻(xiàn)操作進(jìn)行[6， 7]。SIgA、IL-4和IFN-γ參照北京華英生物技術(shù)研究所試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行LSD統(tǒng)計分析，以P<0.05表示差異顯著。

2結(jié)果與分析

2.1不同濃度GSLS對鴨血清HI效價的影響

不同濃度GSLS對鴨血清抗AIV特異性HI效價的影響結(jié)果見圖1，可以看出，在28、35日齡時，與對照組相比，口服中劑量GSLS能顯著提高鴨血清抗AIV特異性HI效價（P<0.05），在其它日齡時，組間血清抗AIV特異性HI效價差異不顯著（P>0.05）。

2.2口服GSLS對不同劑量疫苗免疫鴨血清HI效價的影響

口服GSLS對不同劑量疫苗免疫鴨血清抗AIV特異性HI效價的影響結(jié)果見圖2，可以看出，在免疫后2、3和4周時，與1份疫苗組相比，1份+GSLS組鴨血清抗AIV特異性HI效價顯著升高（P<0.05）；0.75份+GSLS組鴨血清抗AIV特異性HI效價高于1份疫苗組，但是差異不顯著（P>0.05）；0.5份+GSLS組與0.25份+GSLS組血清抗AIV特異性HI效價顯著下降（P<0.05）。

組間不同字母表示差異顯著（P<0.05），下同。

2.3口服GSLS對鴨脾臟淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化的影響

口服GSLS對鴨脾臟淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化的影響結(jié)果見圖3，可以看出，1份+GSLS組鴨脾臟淋巴細(xì)胞體外受ConA刺激產(chǎn)生的淋巴細(xì)胞增殖能力顯著高于對照組（P<0.05），而受LPS刺激產(chǎn)生的淋巴細(xì)胞增殖能力與對照組比較差異不顯著（P>0.05）。

2.4口服GSLS對鴨細(xì)胞免疫功能的影響

口服GSLS對鴨細(xì)胞免疫功能的影響結(jié)果見表1，可以看出， 1份+GSLS組鴨脾淋巴細(xì)胞體外受ConA刺激后血清IFN-γ含量，在免疫后2周和3周，均顯著高于1份免疫組（P<0.05）；1份+GSLS組鴨脾淋巴細(xì)胞體外受ConA刺激后血清IL-4濃度，在免疫后2周，與1份免疫組差異不顯著（P>0.05），在免疫后3周，顯著高于1份免疫組（P<0.05）。

2.5口服GSLS對鴨免疫器官指數(shù)變化的影響

口服GSLS對鴨免疫器官指數(shù)的影響結(jié)果見表2，可以看出，1份+GSLS組鴨脾臟指數(shù)和法氏囊指數(shù)顯著高于1份疫苗組（P<0.05），而胸腺指數(shù)與1份疫苗組差異不顯著（P>0.05）。

2.6口服GSLS對腸黏膜SIgA含量變化的影響

口服GSLS對腸黏膜SIgA含量變化的影響結(jié)果見圖4，可以看出，在免疫后1周，飲水口服GSLS組鴨腸黏膜SIgA含量與對照組比較差異不顯著（P>0.05）；在免疫后2周，飲水口服GSLS組鴨腸黏膜SIgA含量顯著高于對照組（P<0.05）。

2.7口服GSLS對鴨抗氧化功能的影響

口服GSLS對鴨抗氧化功能的影響結(jié)果見表3，可以看出，飲水口服中劑量GSLS組鴨血清MDA濃度（MDA含量）顯著降低（P<0.05），SOD濃度（SOD活力）顯著升高（P<0.05）。

3討論與結(jié)論

體液免疫應(yīng)答是由機(jī)體B細(xì)胞產(chǎn)生的以抗體為主要效應(yīng)分子的免疫應(yīng)答[8]，血清抗AIV特異性HI效價高低直接反映鴨抵抗流感病毒感染能力的高低。在家禽養(yǎng)殖業(yè)中，廣泛采用給易感動物接種AI疫苗刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗病毒抗體來防控AI發(fā)生。本研究結(jié)果表明，飲水口服中劑量GSLS能顯著提高鴨血清抗AIV特異性HI效價，說明飲水口服GSLS能提高機(jī)體體液免疫應(yīng)答，增強(qiáng)鴨群抗AIV感染能力，表現(xiàn)出良好的口服免疫增強(qiáng)作用。AI是一種人畜共患傳染性疾病，對鴨等易感動物采用抗體合格率來判定AI疫苗免疫合格的主要評判指標(biāo)[9]，而臨床調(diào)研發(fā)現(xiàn)，抗體合格率不高已成為導(dǎo)致AI頻發(fā)的重要因素之一。而本研究發(fā)現(xiàn)的口服GSLS能提高鴨群血清抗AIV特異性HI效價恰好證實其能提高抗體合格率，說明GSLS能作為一種免疫佐劑有效提高鴨群抗AIV感染能力。

在獸用疫苗生產(chǎn)中，抗原劑量是影響疫苗免疫效果和關(guān)系疫苗生產(chǎn)成本的重要因素。低劑量抗原的疫苗不能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答，血清特異性抗體效價低、抗體合格率低，仍然會造成傳染病的頻發(fā)；反之，高劑量抗原的疫苗會導(dǎo)致疫苗生產(chǎn)成本大幅增加，間接導(dǎo)致養(yǎng)殖成本增加，降低養(yǎng)殖利潤[10]。免疫佐劑能增強(qiáng)機(jī)體對疫苗抗原的免疫應(yīng)答，具有降低疫苗抗原用量的效果，成為評價疫苗免疫佐劑的一個重要指標(biāo)[11]。本研究結(jié)果表明，0.75份+GSLS組鴨血清抗AIV特異性HI效價與1份疫苗原組鴨血清抗AIV特異性HI效價相比，統(tǒng)計學(xué)顯示差異不顯著。疫苗抗原劑量減少0.25份，GSLS仍能刺激鴨群產(chǎn)生與1份疫苗抗原誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生相同水平的血清抗AIV特異性HI效價，說明飲水口服GSLS具有一定降低疫苗抗原用量的作用。

淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)是反映機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答水平的指標(biāo)之一[12]。一般來說，淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化能力高，機(jī)體的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答能力則強(qiáng)。本研究結(jié)果表明，口服GSLS能顯著提高鴨脾臟淋巴細(xì)胞受ConA刺激后的淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化指數(shù)，說明口服GSLS能提高鴨群的細(xì)胞免疫應(yīng)答水平，從而增強(qiáng)機(jī)體抵御病毒感染能力。細(xì)胞因子是免疫細(xì)胞受抗原或絲裂原刺激后產(chǎn)生具有清除機(jī)體病原體、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答過程等作用的效應(yīng)分子，是機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答的主要效應(yīng)分子，也是動物機(jī)體抗病毒感染中的重要輔助因素之一[13]，因此細(xì)胞因子分泌水平的高低反映機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答能力的強(qiáng)弱。本研究結(jié)果表明，飲水口服GSLS能顯著提高鴨脾臟淋巴細(xì)胞受ConA刺激后上清IFN-γ（Th1）和IL-4（Th2）水平（P<0.05），說明飲水口服GSLS能增強(qiáng)機(jī)體的Th1和Th2型細(xì)胞免疫應(yīng)答。而Th1和Th2型細(xì)胞免疫在抗病毒感染和調(diào)節(jié)體液免疫應(yīng)答中均發(fā)揮一定作用[8]，本研究結(jié)果證實GSLS是一種比較理想的免疫佐劑。

胸腺、脾臟和法氏囊是家禽的重要免疫器官，參與機(jī)體全身的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，是動物免疫系統(tǒng)執(zhí)行免疫功能的重要組織結(jié)構(gòu)，其發(fā)育狀況直接決定家禽機(jī)體免疫應(yīng)答水平的強(qiáng)弱，免疫器官重量成為評價動物機(jī)體免疫應(yīng)答水平的指標(biāo)之一[7]。免疫器官指數(shù)是免疫器官重量與其體重的比值，是衡量免疫器官發(fā)育狀況方法之一，成為表征機(jī)體免疫應(yīng)答水平高低的指標(biāo)之一。一般來說，免疫器官指數(shù)越大，說明機(jī)體的免疫應(yīng)答水平越強(qiáng)。本研究結(jié)果表明，飲水口服GSLS顯著提高鴨群的脾臟和法氏囊指數(shù)（P<0.05），說明GSLS具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用，與本研究發(fā)現(xiàn)的飲水口服GSLS能提高鴨血清抗AIV特異性HI效價和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平結(jié)果相一致，說明GSLS是一種有效的口服免疫佐劑。

動物機(jī)體的呼吸道、消化道和泌尿生殖道的黏膜中分布有豐富的免疫細(xì)胞，這些免疫細(xì)胞組成了機(jī)體黏膜免疫系統(tǒng)[14]。機(jī)體的黏膜免疫系統(tǒng)是病原微生物突破機(jī)體防御的主要屏障，也是機(jī)體免疫應(yīng)答的重要組成部分，機(jī)體的體液免疫、細(xì)胞免疫應(yīng)答都有黏膜免疫系統(tǒng)的參與。因此，黏膜免疫功能成為評價免疫佐劑的主要指標(biāo)之一。SIgA是腸道黏膜免疫的主要效應(yīng)分子，成為評價腸道黏膜免疫功能的指標(biāo)。從本研究結(jié)果可以看出，飲水口服GSLS后鴨群腸道SIgA含量顯著高于對照組（P<0.05），說明GSLS具有增強(qiáng)機(jī)體腸道黏膜免疫功能的作用，表現(xiàn)出一定的黏膜免疫佐劑潛質(zhì)。有研究發(fā)現(xiàn)，黏膜免疫能激活機(jī)體黏膜免疫和系統(tǒng)免疫應(yīng)答[15]。而本研究發(fā)現(xiàn)飲水口服GSLS組鴨群的體液免疫應(yīng)答水平升高，該結(jié)果恰好說明飲水口服GSLS通過增強(qiáng)機(jī)體黏膜免疫功能來激活機(jī)體體液免疫應(yīng)答，可能是GSLS發(fā)揮口服免疫佐劑作用的機(jī)制之一。此外，GSLS發(fā)揮免疫佐劑效應(yīng)還可能與GSLS中皂甙單體的構(gòu)效關(guān)系[16]、皂甙對免疫細(xì)胞的刺激作用[6]有一定關(guān)系。

在正常狀態(tài)下，動物機(jī)體內(nèi)氧化與抗氧化過程保持動態(tài)平衡，當(dāng)機(jī)體遭受病原微生物等外源性或內(nèi)源性有害刺激時，氧自由基產(chǎn)生速度遠(yuǎn)超抗氧化系統(tǒng)的清除能力，過量氧自由基破壞正常組織和細(xì)胞功能，導(dǎo)致機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而誘發(fā)動物出現(xiàn)多種疾病或加重疾病發(fā)展[17]。MDA是細(xì)胞膜多不飽和脂肪酸過氧化物的降解產(chǎn)物，能反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化程度高低，成為表征機(jī)體過氧化損傷的指標(biāo)之一。SOD是機(jī)體內(nèi)一種自由基防御酶，能清除機(jī)體內(nèi)的過氧化物，能反映機(jī)體抗氧化程度高低，成為表征機(jī)體抗氧化能力高低的指標(biāo)之一[18]。本研究結(jié)果表明，飲水口服GSLS能顯著降低血清MDA水平，顯著提高血清SOD水平，說明GSLS能夠調(diào)節(jié)鴨群體內(nèi)氧化與抗氧化動態(tài)平衡，維持鴨群腸道氧化還原狀態(tài)，保持生物膜完整性[19]，與相關(guān)資料報道的人參具有抗氧化功能相一致[20]。有研究發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)過氧化能損傷機(jī)體免疫功能[21]。本研究結(jié)果說明，GSLS可能通過提高機(jī)體的抗氧化功能來增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，可能是GSLS發(fā)揮免疫佐劑作用的機(jī)制之一。

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