益氣活血散結法對糖尿病腎病大鼠腎組織中MCP-1、TGF-β的影響

黃為鈞 王世東 趙進喜 傅 強 宮 晴 張 華 吳文靜 申子龍 賈 旭 張雨婷

(1 北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京，100700； 2 湖北省中醫(yī)院，武漢，430061； 3 首都醫(yī)科大學北京中醫(yī)醫(yī)院腎病科，北京，100010； 4 北京中醫(yī)藥大學科研實驗中心，北京，100029)

益氣活血散結法對糖尿病腎病大鼠腎組織中MCP-1、TGF-β的影響

黃為鈞1王世東1趙進喜1傅 強1宮 晴1張 華1吳文靜2申子龍3賈 旭4張雨婷4

(1 北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京，100700； 2 湖北省中醫(yī)院，武漢，430061； 3 首都醫(yī)科大學北京中醫(yī)醫(yī)院腎病科，北京，100010； 4 北京中醫(yī)藥大學科研實驗中心，北京，100029)

目的：通過動物實驗，基于免疫炎性反應因子MCP-1、TGF-β，探索益氣活血散結法改善腎小球硬化的分子機制。方法：24只GK大鼠，隨機分為模型組、假手術組、益氣活血散結組。通過高脂高能量喂養(yǎng)加單腎切除術復制糖尿病腎病模型。檢測各組大鼠的24 h尿蛋白，觀察大鼠在干預后腎臟組織的病理改變，同時采用Western blotting以及免疫組化法檢測腎臟組織的MCP-1和TGF-β的表達情況，采用RT-PCR法檢測MCP-1mRNA以及TGF-βmRNA的表達水平。結果：PASM染色和Masson染色顯示：益氣活血散結組陽性率明顯低于模型組(P<0.01)。益氣活血散結組中24 h尿蛋白在藥物干預后明顯減少(P<0.01)。Western blotting、免疫組化結果均顯示：益氣活血散結組MCP-1(P<0.05)、TGF-β(P<0.01)的表達程度明顯低于模型組。同樣，RT-PCR結果也顯示:MCP-1mRNA(P<0.01)、TGF-βmRNA(P<0.05)水平在益氣活血散結組明顯低于模型組。結論：益氣活血散結法可以有效地減少24 h尿蛋白定量、延緩腎小球纖維化，其機制可能與抑制腎臟組織中MCP-1和TGF-β的表達有關。

MCP-1；TGF-β；益氣活血散結法；糖尿病腎病

糖尿病腎病(Diabetes Nephropathy，DN)是糖尿病最為常見的微血管并發(fā)癥之一，也是目前導致終末期腎衰竭的最主要的原因[1]。長期以來，糖尿病腎病的治療手段僅僅局限于降血糖、降血壓、ACEI/ARB類藥物的治療，治療手段較少，即使是僅有的已經(jīng)明確證明具有降蛋白作用的ACEI/ARB類藥物，其效果也一般，而且研究證實其只能使糖尿病腎病患者發(fā)展為終末期腎病的危險率降低28%，而且不能降低死亡率[2-4]?？梢姡F(xiàn)代醫(yī)學對于糖尿腎病的治療，目前沒有十分理想的藥物。相對而言，中醫(yī)學在糖尿病腎病的治療方面有一定的優(yōu)勢。本課題組長期對糖尿病腎病的中醫(yī)藥治療進行研究，提出糖尿病腎病的“微型癥瘕”形成病機理論，并且證實了益氣化瘀散結法治療糖尿病腎病的有效性[5-11]。

MCP-1和TGF-β在糖尿病腎病的發(fā)展過程中起著重要的作用[12]，其中前者可以在腎臟組織中募集單核-巨噬細胞，后者可以釋放多種炎性反應因子以及生長因子，促進細胞外基質增生，導致腎小球硬化。釋放的炎性反應因子還可以激活p38 MAPK信號通路，產(chǎn)生TGF-β，后者同樣可以導致細胞外基質以及系膜細胞增生，導致腎小球硬化[13]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康SPF級GK大鼠24只，11～17周，300 g，雄性，清潔級，購自常州卡文斯實驗動物有限公司[實驗動物許可證號：SCXK(蘇)2011-0003]。所有動物都飼養(yǎng)在北京中醫(yī)藥大學動物實驗室，飼養(yǎng)溫度22 ℃，相對濕度60%，12 h光/暗周期，自由飲水。

1.1.2 器材 血糖儀(ACCU-CHEK? Performa，羅氏卓越型)；尿蛋白定量試劑盒(貨號c035-2，規(guī)格100T/96樣，生產(chǎn)批號：20150928，南京建成生物工程研究所)；紫外-可見分光光度計(美國Beckman(貝克曼)公司，型號:DU 800)；Anymicro DSSTM圖像采集系統(tǒng)(江蘇瑯珈科技有限公司)；Synergy 4型酶標儀(美國BioTek公司)；轉移電泳槽(Mini Trans-Blot Transfer Cell，BIO-RAD公司)；垂直板電泳槽(Mini-PROTEAN3 cell，BIO-RAD公司)；DYY-10型電泳儀(北京市六一儀器廠)；TS-1型脫色搖床(海門麒麟醫(yī)用儀器廠)；Bio-Rad Image LabTM XRS+凝膠圖像分析管理系統(tǒng)(BIO-RAD公司)；TRIzol(美國Invitrogen15596-026)；RT reagent Kit(大連寶生物公司)；SYBR PremixEX Taq(大連寶生物公司)；PCR引物(大連寶生物公司)；Real time PCR master Mix(SYBRGreen)(日本TOYOBO)；熒光定量PCR循環(huán)儀(美國ABI Step one plus)。

1.1.3 藥物和試劑 高熱量高脂飼料成分:豬油10%，膽固醇2%，膽酸鹽0.25%，蔗糖5%，基礎飼料82.75%。基礎飼料：熱量比例，糖水化合物65%，脂肪10.3%，蛋白質24.2%。由北京科奧協(xié)力飼料有限公司提供。戊巴比妥鈉(Sigma-P3761，北京智杰方遠科技有限公司)；實驗用中藥顆粒劑購自北京康仁堂藥業(yè)有限公司；MCP-1抗體(ab25124,批號lotGR151246-1)以及兔抗TGF-β多克隆抗體(ab66043，批號lotGR134709-5)購自Abcam公司。Dako REALTM EnVisiontm Detection SystemPeroxidase/DAB+，Rabbit/Mouse(丹麥DAK0公司)。BCA蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液(強)、PMSF均購自碧云天生物技術公司，組織蛋白質制備試劑、5×蛋白上樣緩沖液、1.5M Tris·HCl緩沖液、1.0M Tris·HCl緩沖液、30%丙烯酰胺、AP、TEMED、10×封閉-洗滌緩沖液、10×電泳緩沖液均購自普利萊基因技術有限公司，彩色蛋白Marker、ECL發(fā)光液購自Thermo公司，反轉錄提取試劑盒、takara試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分組及模型復制 所有大鼠在適應性喂養(yǎng)1周后，高脂高熱量飼料喂養(yǎng)8周。然后對所有大鼠進行OGTT測試(空腹12 h后，灌服2 g/kg體重的葡萄糖溶液)，檢測口服葡萄糖后0 h、0.5 h、1 h、2 h尾尖血血糖。以血糖(2 hPG=11.1 mmol/L)為隨機分層因素進行分層隨機分組，隨機分為中模型組、假手術組、益氣活血散結組。分組完成后，模型組、益氣活血散結組行單側腎切除手術，假手術組只切開皮膚、肌肉，不切除腎臟。手術在3%戊巴比妥鈉(1.6 mL/kg腹腔注射)麻醉下進行。手術后連續(xù)3 d腹腔注射青霉素鈉注射液(40單位/只)，預防傷口感染。此后整個實驗過程均給予高脂高熱量飲食。

1.2.2 干預藥物及干預措施 所有大鼠在術后恢復飼養(yǎng)1周后，開始進行藥物干預(8周)。益氣活血散結組給予益氣活血散結顆粒(黃芪、鬼箭羽)。模型組、假手術組則給予純凈水。以灌胃的方式進行給藥。結合前期預實驗結果，根據(jù)人和動物體重進行換算，實驗大鼠劑量選用人體臨床等效劑量的10倍。

1.2.3 取材及檢測指標 在術后8周的藥物干預期間，每隔2～3周進行1次大鼠24 h尿液的收集，并且及時使用考馬斯亮藍法進行24 h尿蛋白的檢測。藥物干預結束后，在3%戊巴比妥鈉(1.6 mL/kg腹腔注射)麻醉下摘取剩余腎臟。腎臟縱切后，一半放入凍存管并放入-80 ℃冰箱暫時保存，用于western blotting以及PCR；另一半浸泡于4%多聚甲醛中固定，用于病理染色以及免疫組化。采用Western blotting以及免疫組化法以檢測腎臟組織中MCP-1以及TGF-β的表達情況和分布情況，采用Quantitative Real-time PCR以檢測腎臟組織中MCP-1mRNA和TGF-βmRNA的表達情況。

1.3 統(tǒng)計學方法 本實驗采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計：計量資料以均數(shù)±標準差(X±S)表示。符合正態(tài)分布者，使用單因素方差分析(One-wayANOVA)；不符合正態(tài)分布者，采用非參數(shù)檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，以P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 動物一般狀況及存活情況 益氣活血組在麻醉時死亡1只，考慮為麻藥誤入血管所致。單腎切除術后，假手術組和益氣活血組各死亡1只，考慮為術后出血過量致死。

2.2 病理染色 HE染色在鏡下100倍、200倍觀察大鼠腎臟結構。假手術組可見到：腎小球肥大或萎縮(以前者為主)，肥大的腎小球內(nèi)毛細血管迂曲擴張，毛細血管瘤形成；萎縮表現(xiàn)為系膜細胞及系膜基質均增生，毛細血管壓迫閉塞，球囊間隙輕度變窄；局部腎小管上皮細胞變性，呈空泡樣變，管腔內(nèi)未見管型；間質少量炎細胞浸潤及少量纖維組織增生。模型組可見到：腎小球肥大或萎縮(以前者為主)，肥大的腎小球內(nèi)毛細血管迂曲擴張，毛細血管瘤形成；萎縮表現(xiàn)為系膜細胞及系膜基質均增生，毛細血管壓迫閉塞，球囊間隙變窄；腎小管上皮細胞變性，呈空泡樣變及顆粒樣變(以前者為主)，腎小管可見代償性擴張，管腔內(nèi)見管型；間質少量炎細胞浸潤及少量纖維組織增生。益氣活血散結組可見到：腎小球體積形態(tài)正常，腎小球毛細血管擴張，系膜細胞增生不明顯，系膜基質區(qū)輕度增寬；腎小管上皮細胞完整，腎小管排列輕度紊亂，擴張明顯，小灶腎小管上皮細胞空泡變性，管腔內(nèi)未見管型，間質未見炎性反應細胞浸潤。見圖1。

PASM染色和Masson染色在鏡下200倍觀察大鼠腎臟染色結果：益氣活血散結組的系膜增生以及基底膜增厚程度要輕于模型組。見圖2。PASM染色及Masson染色的陽性率結果顯示：益氣活血散結組陽性率明顯低于模型組(P<0.01，表1)。

表1 PASM染色和Masson染色陽性率

注：**與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01。

圖1 HE染色

注：a空白組；b假手術組；c益氣活血散結組。

圖2 Masson染色和PASM染色

注：a空白組；b假手術組；c益氣活血散結組。

2.3 24 h尿蛋白定量 藥物干預后，各組的尿蛋白量呈現(xiàn)下降的趨勢，分析第8周與第0周尿蛋白差值的結果顯示：益氣活血散結組的24 h尿蛋白在藥物干預后明顯減少，而且與模型組對比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，表2)。

2.4 Western blotting 各組均在分子量為25 kDa(MCP-1)，13 kDa(TGF-β)處可見蛋白條帶。對其灰度值進行分析，結果顯示：益氣活血散結組MCP-1(P<0.05，表3)、TGF-β(P<0.01，表3)的表達程度明顯低于模型組。

表2 藥物干預前后24 h尿蛋白定量差值

注：**與模型組相比，差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01。

表3 WB檢測MCP-1和TGF-β在腎臟組織中的表達情況

注：*與模型組相比，差異有統(tǒng)計學意義，P<0.05，**與模型組相比，差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01。

圖3 Western blotting蛋白條帶

2.5 免疫組化 結果顯示，腎臟組織中MCP-1主要表達于腎小球系膜上皮細胞胞質，TGFβ表達于腎小球和腎小管上皮細胞胞質。進一步分析灰度值，結果顯示：MCP-1(P<0.05，表4)及TGF-β(P<0.01，表4)在益氣活血散結組的表達水平顯著低于模型組。

表4 免疫組化檢測腎臟組織中MCP-1、TGF-β的表達水平

注：*與模型組相比，差異有統(tǒng)計學意義，P<0.05，**與模型組相比，差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01。

表5 PCR檢測MCP-1mRNA和TGF-βmRNA的表達水平

注：*與模型組相比，差異有統(tǒng)計學意義，P<0.05，**與模型組相比，差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01。

2.6 RT-PCR 本實驗采用實時定量PCR對MCP-1mRNA以及TGF-βmRNA的表達水平進行檢測，結果采用2-△△CT法進行數(shù)據(jù)的相對定量分析，并且以假手術組為對照組。結果顯示：MCP-1mRNA(P<0.01，表5)、TGF-βmRNA(P<0.05，表5)水平在益氣活血散結組明顯低于模型組。

圖4 免疫組化結果

注：a MCP-1，b TGF-β；1模型組，2假手術組，3益氣活血散結組。

3 討論

糖尿病腎臟病“微型癥瘕”學說是呂仁和教授在整理古代文獻的基礎上，參照現(xiàn)代醫(yī)學相關認識，結合臨床實踐經(jīng)驗提出來的。認為糖尿病腎臟病屬于中醫(yī)“消癉”的范疇，為消渴病日久，體質因素加以情志、飲食失調等，內(nèi)熱傷陰耗氣，氣陰兩傷，或陰損及陽，久病致虛基礎上，久病入絡，氣虛血瘀，痰郁熱瘀互相膠結，則可在腎之絡脈形成微型癥瘕，使腎體受損，腎用失司。腎主藏精，腎氣不固，精微外泄，則可見尿蛋白，或見夜尿頻多等。腎主水，腎氣不化，或陰損及陽，陽不化氣，水濕氣化不利，水液滯留，溢于肌膚，故可見水腫脹滿。病情繼續(xù)發(fā)展，腎體勞損，腎元虛衰，氣血俱傷，氣化不行，濁毒內(nèi)留，則諸癥峰起。終成腎元衰敗，五臟俱病，升降失常，三焦阻滯，水濕濁毒泛濫，一身氣機升降出入俱廢，轉為關格危證[7]。在治療方面，強調益氣活血散結法應貫穿糖尿病腎病治療的始終[14]。在“十五”“十一五”期間，呂仁和教授團隊基于“微型癥瘕”學說，開展了多個隨機、單盲、平行對照和多中心臨床研究，研究結果均顯示，基于“微型癥瘕”學說形成的中藥辨證論治方案在有效率、24 h尿蛋白定量、尿微量白蛋白排泄率、血肌酐等方面具有優(yōu)于或非劣于西藥ARB類藥物的療效，甚至在終點事件方面(Ⅲ期DKD患者進入Ⅳ期，或者Ⅳ期DKD患者血肌酐平翻倍或需要透析治療)明顯優(yōu)于西藥厄貝沙坦組[5-6,9-11]?？梢姡鏆饣钛⒔Y法治療糖尿病腎病的療效明確，但是其分子生物學機制仍不清楚，為此，我們開展了此項研究。

研究表明，免疫炎性反應機制在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用[13]，其中MCP-1以及TGF-β與糖尿病腎病腎臟纖維化有著密切的關系。糖尿病時高血糖刺激腎系膜細胞表達MCP-1增多，MCP-1可直接激活系膜細胞產(chǎn)生肌纖維蛋白，使腎小球纖維化；此外還可募集血循環(huán)中的單核巨噬細胞，被活化的巨噬細胞可以釋放活性氧、各種炎性因子(IL-1，TNF-α等)和促纖維化生長因子(PDGF，TGF-β等)，導致腎小球實質細胞受損以及壞死，上皮細胞間充質轉化，細胞外基質的增多，最終導致腎小球硬化的發(fā)生[15]?？梢?，MCP-1和TGF-β在糖尿病腎病發(fā)展過程中的起著重要作用，甚至有學者認為將MCP-1、TGF-β等作為生物標記評估糖尿病腎病的發(fā)展[16]。

本研究結果顯示，益氣活血散結組在降低24 h尿蛋白定量以及減輕腎小球纖維化，延緩腎小球硬化方面明顯要比模型組效果好(見圖1，圖2，表1，表2)。這與我們臨床觀察以及以往的隨機對照研究結果是相符的，再次證明了益氣活血散結法治療糖尿病腎病的有效性。而在機制研究方面，不管是western blotting、免疫組化，還是RT-qPCT，結果都一致顯示，對比模型組，益氣活血而散結組可以很明顯地抑制MCP-1以及TGF-β的表達(見表3，表4，表5)。此外，在HE染色病理切片中也可以看見益氣活血散結組的炎性反應細胞浸潤要比模型組以及假手術組輕(見圖1)?？梢姡兴幰鏆饣钛⒔Y法可以有效地抑制糖尿病腎病大鼠腎臟組織中MCP-1和TGF-β的表達。

綜上，我們得出結論，益氣活血散結法可以有效地減少24 h尿蛋白定量、延緩腎小球纖維化，其機制可能與抑制腎臟組織中MCP-1和TGF-β的表達有關。

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(2016-12-20收稿 責任編輯：洪志強)

Effects of Qi-tonifying Blood-activating and Mass-dissipating Method on Expressions of MCP-1 AndTGF-β in Renal Tissue of Rats with Diabetic Nephropathy

Huang Weijun1，Wang Shidong1，Zhao Jinxi1，F(xiàn)u Qiang1，Gong Qing1，Zhang Hua1，Wu Wenjing2，Shen Zilong3, Jia Xu6，Zhang Yuting6

(1SectionⅡofEndocrinology&NephropathyDepartmentofDongzhimenHospitalAffiliatedtoBeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100700,China; 2NephropathyDepartmentofHubeiProvincialHospitalofTCM，Hubei430061,China;3NephropathyDepartmentofBeijingHospitalofTraditionalChineseMedicineAffiliatedtoCapitalMedicalUniversity，Beijing100010,China; 6ResearchandExperimentCenter，BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100029,China)

Objective:To study the mechanism of Qi-tonifying blood-activating and mass-dissipating method in treating diabetic nephropathy based on MCP-1 and TGF-β through animal experiment.Methods:A total of 24 GK rats were randomly divided into model group，sham-operated group and Qi-tonifying blood-activating and mass-dissipating group.Each group had 8 rats.The DN model was established by feeding with high-fat diet and unilateral nephrectomy.24-hour urine protein was detected and the renal pathological changes were observed.Expressions of MCP-1 and TGF-β in the renal tissue were detected by Western blotting and immunohistochemistry，while RT-PCR was used to detect the expression of MCP-1mRNA and TGF-β mRNA.Results:Results of PASM staining and Masson staining show that the positive rate of Qi-tonifying blood-activating and mass-dissipating group was significantly lower than that of model group(P<0.01).The 24-hour urinary protein in Qi-tonifying blood-activating and mass-dissipating group decreased significantly after drug intervention(P<0.01).Results of Western blotting and immunohistochemistry showed that expression levels of MCP-1(P<0.05) and TGF-β(P<0.01) were lower in Qi-tonifying blood-activating and mass-dissipating group than those in model group.Results of RT-qPCR showed that expression levels of MCP-1 mRNA(P<0.01) and TGF-β mRNA(P<0.05) in Qi-tonifying blood-activating and mass-dissipating group were significantly lower than those in model group.Conclusion:The treatment of diabetic nephropathy with Qi-tonifying blood-activating and mass-dissipating method can decrease the proteinuria and delay the glomerular fibrosis.The molecular mechanism may be related to the inhibition of MCP-1 and TGF-β.

MCP-1; TGF-β; Qi-tonifying blood-activating and mass-dissipating method; diabetic nephropathy

國家自然科學基金項目(編號：81473664)

黃為鈞(1990.07—)，男，在讀博士研究生，研究方向：中醫(yī)藥防治糖尿病及其并發(fā)癥，E-mail：huangweijun2015@126.com

趙進喜(1965.03—)，男，博士，教授/主任醫(yī)師，北京中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院中醫(yī)內(nèi)科學教研室主任，研究方向：中醫(yī)藥防治糖尿病及其并發(fā)癥，郵編：100700，電話：84013293，E-mail：zhaojinximd@126.com

R259

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.01.004