王秋萍+趙靜苗+賈佳+路娟+胡繼宏

[摘要] 目的 探討組織激肽釋放酶1（KLK1）誘導(dǎo) 大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）向心肌樣細胞分化的影響。方法 選取2015年3—7月購買的大鼠BMSCs，將大鼠BMSC細胞分為3組即正常組、組織激肽釋放酶1組、5-Aza組。采用RT-PCR分別對誘導(dǎo)培養(yǎng)后的大鼠BMSCs 進行心肌細胞特異性蛋白Actin、c-TnI和Desmin的檢測，并用Western blot 免疫印跡分析c-TnT蛋白表達量。 結(jié)果 RT-PCR檢測顯示，5-Aza誘導(dǎo)的BMSCs（1.964±0.805）在心肌特異性蛋白Actin RNA、c-TnI RNA和Desmin RNA的表達均高于空白組（1.000±0.000）（P<0.05）， KLK1誘導(dǎo)組（2.633±0.582）以上蛋白的RNA表達量又顯著高于5-Aza誘導(dǎo)組（P<0.05）。Western blot 結(jié)果顯示，5-Aza誘導(dǎo)組c-TnT蛋白的表達（0.799±0.101）高于空白組（0.112±0.001）（P<0.001），KLK1誘導(dǎo)組（1.294±0.134）顯著高于5-Aza組。差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。結(jié)論 5-Aza能有效使BMSCs向心肌樣細胞誘導(dǎo)分化，KLK1也能誘導(dǎo)BMSCs向心肌樣細胞分化。KLK1較5-Aza誘導(dǎo)的BMSCs在心肌細胞特異性蛋白RNA表達，心肌特異性蛋白T表達其心肌特異性更為突出。

[關(guān)鍵詞] 心肌細胞；骨髓間充質(zhì)干細胞；組織激肽釋放酶1；肌動蛋白；結(jié)蛋白；肌鈣蛋白

[中圖分類號] R542 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-0742（2017）01（c）-0011-05

Study on Effect of Expression Vector with KLK1 Inducing the BMSCs Cardiac-like Cell Differentiation

WANG Qiu-ping， ZHAO Jing-miao， JIA Jia， LU Juan， HU Ji-hong

Basic Medical College of Gansu Chinese Medical University， Lanzhou， Gansu Province， 730000 China

[Abstract] Objective To study on effect of expression vector with KLK1 inducing the BMSCs cardiac-like cell differentiation. Methods Select the rat BMSC cells from March to July 2015 were divided into the normal group， KLK1 group and 5-Aza group， and the rat BMSCs cells were tested by the cardiac cell specific protein Actin， c-TnI and Desmin by the RT-PCR， and the c-TnT protein expression level was analyzed by the Western blot immunoblotting. Results The RT-PCR test showed that the expression of BMSCs induced by 5-Aza in the myocardial marker protein Actin RNA， c-TnI RNA and Desmin RNA was higher than that in the blank group[（1.964±0.805） vs （1.000±0.000）]（P<0.05）， and the RNA expression level of proteins above the （2.633±0.582） in the KLK1 induction group was obviously higher than that in the 5-Aza induction group（P<0.05）， and the Western blot results showed that the c-TnT protein expression level in the 5-Aza induction group was higher than that in the blank group， [（0.799±0.101） vs （0.112±0.001）]（P<0.001）， and the differences had statistical significance. Conclusion 5-Aza can effectively make the BMSCs cardiac-like cell differentiation， KLK1also can induce the BMSCs cardiac-like cell differentiation， and the cardiac-specificity of KLK1 in the BMSCs induced by the KLK1 cardiac cell specific protein RNA expression and myocardial marker protein T expression is more prominent than induced by the 5-Aza.

[Key words] Cardiac muscle cell； Bone marrow derived mesenchymal stem cell； Tissue kallikrein1； Actin； Desmin； Troponin

目前心血管性疾病成為危害人類健康的主要疾病，其中心肌梗死更是嚴(yán)重威害人類生命。2010年全球冠心病死亡人數(shù)占總死亡率15%。藥物干預(yù)和心臟移植作為當(dāng)代治療心臟疾病，改善預(yù)后的常用治療手段仍然存在一定的局限性[1]，干細胞移植作為新興的細胞生物工程技術(shù)已成為研究熱點，用以治療心肌梗死等心血管疾病。骨髓間充質(zhì)干細胞（Bone Mesenchymal Stem Cells，BMSCs）是具有多系分化，自我更新，和分化增殖潛能的特點，能誘導(dǎo)分化為心肌細胞及其他一些組織細胞在一定條件下?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對骨髓間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)分化為干細胞進行了大量研究，移植后存活率低而受限[2]。實驗研究證明基因修飾可以使骨髓間充質(zhì)干細胞的生命周期得到顯著延長，使其能夠繼續(xù)保持多向分化潛能，更好的向組織細胞分化，以抑制細胞的凋亡、刺激細胞的再生[3-4]KLK1即血管舒緩素，是KLK基因家族中重要的成員，在包括降低血壓、抑制心臟和動脈重構(gòu)、改善胰島素抵抗、抑制平滑肌細胞增殖及缺血/再灌注損傷起保護作用，而且還有直接舒張血管，抑制凋亡炎癥和纖維化，促進血管生成的作用[5]。

因此如何提高骨髓間充質(zhì)干細胞向心肌細胞的分化率成為研究熱點。該實驗于2015年3—7月，選擇SD大鼠（第2代）組織激肽釋放酶1表達載體誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞向心肌細胞分化，以觀察其效果。

1 臨床資料

選取于骨髓間充質(zhì)干細胞購自于北京醫(yī)科利昊生物科技有限公司（SDMSC-3）。DMEM（500 mL）培養(yǎng)基，胎牛血清（500 mL），KLK1腺病毒載體，Trizol，M-MLV，Oligo Dt，Bulge-LoopTM， miRNA qPCR Primer set，Rnase Inhibitor，SYBR Master Mixture，Primer，RatVEGF SunnyELISA。儀器：Nanodrop 分光廣度計，穩(wěn)壓電泳儀，超細勻漿機，Real time PCR 儀器，反轉(zhuǎn)錄耗材，CO2恒溫培養(yǎng)箱

2 實驗方法

2.1 SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)

常規(guī)滅菌，打開培養(yǎng)瓶，放入細胞，根據(jù)細胞的生長情況加入培養(yǎng)基（80%～90%）和血清（10%～20%），放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，次日觀察細胞生長狀態(tài)，是否需要換液。換液取細胞培養(yǎng)瓶，棄液，用酒精燈消毒；用PBS沖洗1次，再棄液，滅菌，加入培養(yǎng)基，鏡下觀察細胞，后放入培養(yǎng)箱，根據(jù)細胞生長情況，每隔2～3 d進行觀察換液。細胞生長至80%～90%融合時可傳代。在重大疾病分子醫(yī)學(xué)與中醫(yī)藥防治研究省級重點實驗室進行實驗，選取于2015年3—7月。

2.2 SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞體外誘導(dǎo)

將第2代SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞復(fù)蘇傳代，將傳代后的細胞隨機分組為3組：BMSCs組（正常組），KLK1組，5-Aza組。誘導(dǎo)組分別加入含5-Aza和含KLK1細胞因子的誘導(dǎo)液，進行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，誘導(dǎo)24 h后，更換完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d換液1次，并收集細胞培養(yǎng)上清液，放于-20℃保存，連續(xù)4周后，對分化的細胞進行鑒定。

2.3 Real-time qPCR檢測心肌相關(guān)蛋白Desmin、ɑ-sarcomeric actin、cardiac Troponin I（cTn I）mRNA的表達

總RNA抽提收集細胞，2 000 rpm離心5 min，去上清，細胞沉淀中加入1 mL Trizol，充分混勻后室溫靜止5 min，然后轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL EP管中，MicroRNA 反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄：將2 μL 反轉(zhuǎn)錄引物（0.5 μg/μL）和2.0 μg Total RNA加入到PCR小管中，補RNase-free water至11 μL；混勻后離心，70℃溫浴10 min；之后立即至于冰水混合物中冰浴，使反轉(zhuǎn)錄引物和模板退火。RNA反轉(zhuǎn)錄將1 μL Oligo Dt（0.5 μg/μL）和2.0 μg Total RNA加入到PCR小管中，補充RNase-free H2O至10 μL；混勻后離心，70℃溫浴10 min；之后立即置于冰水混合物中冰浴，使Oligo dT和模板退火。在上述混合物中，按以下的比例配制反應(yīng)體系（冰上進行），混勻，短暫離心。將得到的RT產(chǎn)物—cDNA置于-20℃保存?zhèn)溆?。Real-time PCR檢測引物序列如表1所示。

2.4 c-TnT蛋白 Western blot 免疫印跡分析

提取細胞蛋白，從培養(yǎng)箱中取出細胞棄液，用PBS沖2次棄液，加入適量蛋白電泳，吹打細胞至充分裂解，移入EP管冰上裂解10～15 min，4℃，12 000 g離心5 min，放入沸水水浴10 min，4℃，12 000 g離心1 min，-80℃?zhèn)溆?。聚丙稀酰胺凝膠電泳：利用BioRad Protean Ⅲ裝置制備長7.00 cm、厚0.75 mm的膠，分離做成梯度膠，分3層，底層鋪滿后應(yīng)立即鋪上2層，以使3層膠融為一體。各層緩沖液濃度相同，均為0.375 mol/L的 Tris-HCl buffer （pH 8.8）+ 2 g/L的SDS。制備過程中，底層、中層、上層分別加入體積分?jǐn)?shù)為0.1、0.075、0.03的甘油以增加穩(wěn)定性。膠凝后每孔上樣約200 μg， 預(yù)染的順序為空白組，KLK1組，5-Aza組。將蛋白質(zhì)樣品，室溫下100 V恒壓電泳4 h，電泳緩沖液含14.4 g/L的甘氨酸，3 g/L 的 Tris及2g/L 的 SDS。進行轉(zhuǎn)膜工作并觀察轉(zhuǎn)膜情況。c-TnT蛋白Western blot 免疫印跡分析：轉(zhuǎn)膜后封閉液封閉1 h，留置待用。TBST洗膜后，發(fā)光劑孵育 1 min，暗室曝光，圖像掃描進行Western blot免疫印跡分析。另配置120 g/L 的分離膠， 按傳統(tǒng)方法做內(nèi)參 GAPDH 的 Western blot 免疫印跡。

3 統(tǒng)計方法

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示服從正態(tài)分布，組間比較采用方差分析，LSD兩兩比較做進一步分析，檢驗水準(zhǔn)為P<0.05；中位數(shù)和四分位間距表達用于不服從正態(tài)分布，組間比較采用秩和檢驗。計數(shù)資料用率（%）表達，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 RT-PCR檢測誘導(dǎo)后BMSCs心肌早期基因的表達

經(jīng)5-Aza誘導(dǎo)的BMSCs在心肌特異性蛋白Actin RNA、c-TnI RNA的表達和Desmin RNA的表達與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。經(jīng)KLK1誘導(dǎo)的BMSCs在心肌特異性蛋白Actin RNA、c-TnI RNA和Desmin RNA的表達比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。KLK1誘導(dǎo)組與5-Aza誘導(dǎo)組比較在心肌特異性蛋白Actin RNA，c-TnI RNA，Desmin RNA的表達增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表1。

4.2 c-TnT蛋白 Western blot 免疫印跡分析的表達結(jié)果

經(jīng)5-Aza誘導(dǎo)的BMSCs在c-TnT蛋白的表達與空白組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。經(jīng)KLK1誘導(dǎo)的BMSCs在c-TnT蛋白的表達與正常組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。KLK1組與5-Aza組比較其表達增高，見表2。

4.3 c-TnT蛋白 Western blot 免疫印跡內(nèi)參灰度表達

圖1為c-TnT蛋白 Western blot 免疫印跡內(nèi)參灰度表達，圖2 為3組實驗組c-TnT蛋白 Western blot 免疫印跡灰度表達，用目的條帶的灰度值比內(nèi)參GAPDH灰度值代表蛋白相對表達量，采用ImagJ軟件進行灰度值的計算。

5 討論

心肌梗死后，如何修復(fù)壞死心肌、改善心功能，是心梗治療的關(guān)鍵。目前，對于心肌梗死的治療方法有藥物治療、介入治療、手術(shù)治療等，這些治療方法也只能恢復(fù)再灌注，而不能修復(fù)或逆轉(zhuǎn)已壞死的心肌。骨髓間充質(zhì)干細胞是骨髓基質(zhì)中存在的非造血系的成體干細胞，具有向多種細胞分化的能力，可向包括血管內(nèi)皮細胞、心肌細胞、骨細胞、神經(jīng)細胞等分化，除此外還有自我更新能力、可塑性高、易導(dǎo)入外源基因等特點，因此BMSCs是基因治療的理想供體細胞[6]?；谝延写罅矿w外實驗研究旨在通過加入適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)劑，使BMSCs定向分化為心肌樣細胞。選擇安全有效的誘導(dǎo)劑并將BMSCs高效誘導(dǎo)為心肌細胞，則是干細胞移植治療成功的關(guān)鍵，也是為日后體內(nèi)移植實驗研究做基礎(chǔ)。

5-氮雜胞苷（5-azaCytidine，5-Aza）是一種DNA轉(zhuǎn)甲酶抑制劑，實驗證明其可使干細胞向心肌樣細胞分化，成為誘導(dǎo)的較理想途徑，還是衡量其他誘導(dǎo)條件有效性的標(biāo)準(zhǔn)，但對細胞有一定的毒性作用，其濃度大小會對BMSCs分化為心肌樣細胞產(chǎn)生影響。低濃度的5-Aza分化效率較低，但濃度過高又造成細胞大量死亡。由于5-Aza對BMSCs誘導(dǎo)其濃度難以掌握，同時誘導(dǎo)后的細胞活性也受影響，有研究表明常規(guī)劑量5-Aza能誘導(dǎo)BMSCs凋亡[7]。

基因修飾可以使骨髓間充質(zhì)干細胞的生命周期得到顯著延長，使其能夠繼續(xù)保持多向分化潛能，有研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)基因修飾的BMSC可促進其向心肌樣細胞的分化[8-9]。KLK1轉(zhuǎn)染BMSC向心肌樣細胞分化方面在國內(nèi)外尚無報道。KLK1在心血管的表達及作用是通過緩激肽或賴氨酰緩激肽來調(diào)節(jié)的。已有研究表明KLK1與心臟疾病有重要關(guān)系。在心臟疾病發(fā)生過程中，活性激肽的減少導(dǎo)致心肌儲備力下降，而KLK1能特異性的在碳末端切割底物肽，可裂解激肽原釋放具有活性的激肽，增強心肌儲備力，從而能發(fā)揮對心血管系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用。

該實驗將大鼠BMSCs細胞分別進行5-Aza和KLK1轉(zhuǎn)染，RT-PCR檢測結(jié)果顯示，經(jīng)5-Aza誘導(dǎo)的BMSCs在心肌特異性蛋白Actin RNA、c-TnI RNA和Desmin RNA的表達均高于空白組，5-Aza組為（1.964±0.805）、（0.716±0.074）、（109.2±5.744）?？瞻捉M為（1.000±0.000）；KLK1誘導(dǎo)組以上蛋白的RNA表達量又顯著高于5-Aza誘導(dǎo)組，KLK1組為（2.633±0.582）、（0.732±0.0492）、（223.894±0.895）。Western blot 免疫印跡結(jié)果顯示5-Aza誘導(dǎo)組c-TnT蛋白的表達高于空白組（P<0.001），5-Aza組為（0.799±0.101），空白組為（0.112±0.001），KLK1誘導(dǎo)組顯著高于5-Aza組（P<0.001），KLK1組為（1.294±0.134）。a-Actin是心肌細胞的肌動蛋白的主要存在形式。結(jié)蛋白（Desmin）被認為是前體肌細胞活化的早期標(biāo)志物，參與肌細胞的形成是通過其肌纖維結(jié)構(gòu)形成時發(fā)揮作用。肌鈣蛋白cTnT作為心肌細胞內(nèi)的一種特異性結(jié)構(gòu)蛋白，在心肌發(fā)育過程中，cTnT的表達發(fā)生一系列的變化參與組成細肌絲，并與心肌收縮和舒張的調(diào)節(jié)有關(guān)。由于以上蛋白在心肌細胞形成早期所具有的一定特殊代表性，也是BMCs分化為心肌細胞后進行收縮的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。該研究結(jié)果表明KLK1對BMSCs有向心肌樣細胞的分化作用，而且KLK1誘導(dǎo)分化率較5-Aza高，相對5-Aza更安全。有研究將心肌細胞與BMSCs按一定比例共培養(yǎng)，也可使BMSCs向心肌細胞分化，其PCR檢測PCR 檢測各組均有cTnT表達為（14.79±0.110）[10]。

該實驗是對KLK1干預(yù)BMSCs向心肌樣細胞分化是否有效的初步判斷，并未對誘導(dǎo)后的細胞沒有進行相關(guān)的心肌樣搏動相關(guān)因子的檢測，如免疫熒光和RT-PCR檢測細胞起搏基因HCN2和HCN4。或是通過在電鏡下觀察其超微結(jié)構(gòu)來判斷是否有心肌樣變化，還有待進一步驗證。

隨著心血管疾病發(fā)病率日益增加，對心血管疾病的治療不僅局限于藥物，手術(shù)治療，心臟移植治療等，從種子細胞即干細胞移植層面研究治療已收到廣泛關(guān)注。因為常規(guī)治療方法并不能從根本治療壞死的心肌細胞，而心臟移植對于大多數(shù)患者來說費用昂貴且沒有大量的移植源可提供。該實驗的目的在于找到更安全，有效的BMSCs向心肌樣細胞分化的誘導(dǎo)劑，為BMSCs向心肌樣細胞分化并向體內(nèi)移植治療心肌梗死，亦為日后心血管疾病的臨床治療提供基礎(chǔ)層面的支持。

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