蔡佩娜，傅 楸

(1.泉州市農(nóng)業(yè)學校 362000， 2.泉美生物有限公司)

組織培養(yǎng)是一種快速發(fā)展的植物繁殖技術，已在單倍體育種、細胞突變體篩選、種苗脫毒復壯、種質資源保存與交換、植物快速繁殖、工廠化育苗等方面得到廣泛應用，并取得明顯的成效[1]。在組培過程中，無菌操作不規(guī)范，培養(yǎng)基、超凈工作臺、接種室消毒不徹底都會引起組培苗污染帶菌的問題，甚至會嚴重影響工作進度和生產(chǎn)效率，致使生產(chǎn)和科研試驗失敗，造成嚴重的經(jīng)濟損失。因此，在植物組培育苗中降低染菌率是極為關鍵的技術環(huán)節(jié)，其中無菌操作技術和經(jīng)驗積累至關重要?，F(xiàn)將植物組織培養(yǎng)中的污染原因及預防措施總結如下。

1 造成污染的原因

組織培養(yǎng)中染菌一直是制約植物組培育苗發(fā)展的主要因素，常見的病原是細菌和真菌兩類[2]。病菌的污染給育苗造成多方面的危害，尤其是內(nèi)生細菌的感染危害更為嚴重。其主要表現(xiàn)是早期引起育苗失敗、增殖率降低、培養(yǎng)苗生長緩慢、玻璃苗現(xiàn)象增多等[3]，后期導致移栽試管苗困難或移栽后死苗。

1.1 細菌污染

細菌污染一般在接種后1、2 d即可發(fā)生。在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁的水漬狀，有時甚至整個培養(yǎng)材料周圍出現(xiàn)黏液狀物或發(fā)酵狀的泡沫。在細菌污染中以芽孢桿菌污染最為嚴重、最為普遍，而且芽孢桿菌對紫外線和消毒劑有一定程度的抗性，能忍受一定程度的高溫高壓，常規(guī)的高溫消毒、紫外線殺菌效果不理想。

細菌性污染形成的原因，一是由于接種材料帶菌或培養(yǎng)基滅菌不徹底，使得成批育苗材料受污染；二是因工作人員無菌操作不規(guī)范引起細菌侵染。

1.2 真菌污染

真菌污染一般在接種后3～8 d發(fā)生，主要是由霉菌感染。起初培養(yǎng)基污染的部位發(fā)霉，產(chǎn)生絨毛狀菌絲，隨后可產(chǎn)生黑色、白色、黃色、綠色的病原孢子。

真菌污染主要是周圍環(huán)境帶菌和空氣不潔凈造成的，如育苗環(huán)境不潔凈、超凈工作臺過濾裝置失效、育苗容器的開口太大、封口膜密封不嚴等原因。

2 預防措施

對于以上導致污染的各種因素，應著手從以下兩方面來預防和降低污染。一方面應控制外植體內(nèi)部帶菌與外部帶菌，內(nèi)部帶菌不容易滅菌，但可通過無菌培養(yǎng)室或溫室內(nèi)的預培養(yǎng)來控制；外生菌可以通過表面消毒的方法進行殺菌[4]。另一方面應嚴格規(guī)范工作人員的無菌操作程序，降低操作環(huán)境染菌，可通過規(guī)范操作程序加以控制。

2.1 選擇合適的外植體

正確選擇外植體是組培取得成功的前提，一般一年生或者二年生的草本植物比多年生的木本植物帶菌少；幼嫩的材料比老的材料帶菌少；溫室培養(yǎng)的植物比田間生長的植物帶菌少；不帶泥土的材料比帶土的材料帶菌少。避免在陰雨天采集外植體，強烈陽光可滅殺一些真菌和細菌。對于大多數(shù)植物來說，莖尖組織生長速度快、遺傳性狀穩(wěn)定，病毒感染率低，所以莖尖組織是培育無毒苗的最佳外植體。但是莖尖數(shù)量較少，因此生產(chǎn)中植物中上部的莖段組織也是較好的外植體。不同植物由于本身不同部位的生長特性不同，宜采集容易消毒和滅菌的部位，以降低污染帶菌率。

2.2 外植體消毒

外植體可能帶有外生菌和內(nèi)生菌，必須經(jīng)徹底消毒才能接種。外生菌可用表面消毒的方法滅菌，一般情況采用的消毒法：用75%酒精浸泡幾秒至1 min后，再迅速浸入0.1%升汞溶液中5～10 min[5]。一些難消毒的外植體要采用特殊的措施，如表面帶有較多絨毛的外植體可用真空減壓消毒，真空減壓抽走絨毛下的空氣，讓消毒液更容易浸入，以增強滅菌效果。使用混合的消毒液或多次消毒的方法，也可增強滅菌效果。對于內(nèi)生細菌，表面消毒無法滅菌，可采用分生組織培養(yǎng)或反復莖尖培養(yǎng)的方法來脫除[6]，也可在培養(yǎng)基中添加抗菌素、降低pH值等方法來預防和控制內(nèi)生菌的污染。

2.3 培養(yǎng)基滅菌

培養(yǎng)基與培養(yǎng)器皿的滅菌大都采用高壓濕熱蒸汽滅菌法以確保滅菌效果完全徹底。滅菌過程中當壓力升到0.5 kg/cm2時，開啟放氣閥將鍋內(nèi)冷空氣排凈，再關閉排氣閥繼續(xù)加熱，壓力上升到1.1 kg/cm2、121℃時，保持15～20 min即可。

2.4 接種過程嚴格滅菌

接種時工作人員應嚴格規(guī)范無菌操作，避免人為因素造成染菌。要定期檢查超凈工作臺，定期對過濾器進行清洗與更換，避免操作區(qū)域帶菌。內(nèi)部的過濾器每隔一定時間要檢測操作區(qū)的帶菌量，如果發(fā)現(xiàn)過濾失敗，則要整塊更換。此外還需要測定操作區(qū)的風速，通過調壓旋鈕使操作區(qū)的風速達到無菌操作需要的每分鐘20～30 m[7]。操作人員要做到盡量少帶菌，嚴格實驗操作，接種過程中使用的各種器具都要嚴格滅菌。接種用的器具要經(jīng)高溫滅菌，每次使用后蘸酒精在酒精燈火焰上灼燒滅菌。在超凈工作臺的操作范圍內(nèi)，不能放入過多的育苗材料，以免擋住氣流。感染雜菌的培養(yǎng)瓶在滅菌處理后才能打開洗滌。脫毒培養(yǎng)所用的顯微鏡不能用高溫高壓滅菌，可用75%酒精擦洗顯微鏡表面，再放在操作臺上用紫外燈殺菌。

2.5 環(huán)境消毒

不清潔的環(huán)境使培養(yǎng)的污染率明顯增加，因此接種室與培養(yǎng)室應定期凈化與消毒，接種前接種室和培養(yǎng)室應用紫外燈照射消毒30 min以上或用2%來蘇水消毒，定期對接種室和培養(yǎng)室熏蒸或噴霧消毒。甲醛和高錳酸鉀熏蒸消毒效果較好，但是對人體存在一定的傷害，通常每年熏蒸2、3次。紫外線與臭氧對環(huán)境消毒效果好，且使用靈活簡便，對人體的傷害較小。夏季、高溫高濕的環(huán)境污染率較高，要求培養(yǎng)室的相對濕度應控制在70%以下。

3 小結

隨著組培技術的快速發(fā)展，植物組培育苗的應用領域越來越廣闊。在育苗過程中控制或降低污染是最為關鍵的環(huán)節(jié)，既要保證控制污染的效果良好，又要力求外植體不受損傷或輕微損傷不影響生長。因此控制污染、建立潔凈培養(yǎng)環(huán)境、無菌的植株系統(tǒng)是組培育苗的努力方向[8]。

[1]吳洪生.組織培養(yǎng)中的染菌及預防[J].藥物生物技術,2001,8(2):239-240.

[2]周俊輝.植物快速繁殖技術中存在的問題與對策[J].仲愷農(nóng)業(yè)技術學院學報,1999,12(4):64-70.

[3]韓美麗,陸榮生,黃華艷,等.綠巨人組培苗繼代過程中玻璃化苗及細菌污染的消除方法研究[J].廣西林業(yè)科學,1999,28(1):16-19.

[4]邱堅鋒.熱帶地區(qū)植物組織培養(yǎng)中污染的控制[J].熱帶林業(yè)科技,1987(5):72-75

[5]朱廣廉.植物組織培養(yǎng)中外植體滅菌[J].植物生理學通訊,1996,32(6):444-449.

[6]周俊輝,劉花全,羅慧君，等.瑪麗安萬年青莖段培養(yǎng)的污染防止[J].仲愷農(nóng)業(yè)技術學院學報,2002,15(4);43-48.

[7]柴向華，李軍，張秀珊，等.植物組織培養(yǎng)中污染的控制[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學,2003，23(6)40-43.

[8]鄧小梅，奚如春.植物組織培養(yǎng)過程中污染現(xiàn)象的研究進展[J].江西林業(yè)科技，2004(6)：33-36.