姜矜君，趙云

(三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北宜昌443002)

超聲微泡在乳腺癌靶向治療中的作用機(jī)制研究進(jìn)展

姜矜君，趙云

(三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北宜昌443002)

超聲微泡攜帶藥物或基因靶向治療腫瘤是目前的研究熱點(diǎn)。超聲微泡可通過提高腫瘤細(xì)胞膜的通透性、對(duì)血管內(nèi)皮和鄰近組織的機(jī)械損傷作用，對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用。超聲微泡可靶向遞送紫杉醇等化療藥物，降低藥物毒副作用，提高腫瘤局部的藥物濃度，增強(qiáng)化療藥對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力。超聲微泡可將外源基因?qū)肴橄侔┘?xì)胞，以糾正靶細(xì)胞的功能缺陷，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。超聲微泡可通過靶向遞送單克隆載體進(jìn)行免疫治療，活化免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)機(jī)體免疫能力，抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

微泡；超聲微泡；乳腺腫瘤；乳腺癌

化療是乳腺癌的常用治療方法，但普通抗腫瘤藥物無法實(shí)現(xiàn)在腫瘤部位的靶向聚集并滲透到腫瘤內(nèi)部，治療乳腺癌效果不佳。超聲微泡攜帶藥物或基因靶向治療腫瘤是近年來超聲分子影像學(xué)的研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，在腫瘤早期的檢測(cè)和療效評(píng)價(jià)方面具有可觀的應(yīng)用前景。超聲微泡靶向治療是將超聲微泡作為藥物或基因載體，在靶組織區(qū)域給予一定強(qiáng)度的超聲輻照導(dǎo)致微泡破裂，產(chǎn)生“擊破效應(yīng)”，使其攜帶的藥物或基因定向釋放到腫瘤組織，提高腫瘤組織的藥物濃度，達(dá)到靶向治療腫瘤的目的?，F(xiàn)將相關(guān)研究進(jìn)展綜述如下。

1 超聲微泡在乳腺癌治療中的作用機(jī)制

理想的超聲微泡應(yīng)具備安全無毒、粒徑小而均勻、載藥量高，包封率高、靶向性好、體內(nèi)穩(wěn)定性好且易被超聲擊破。目前所采用的超聲微泡均由外膜和包裹的惰性氣體組成，直徑均小于8 μm，可以通過肺毛細(xì)血管，在超聲的作用下被激發(fā)，產(chǎn)生較強(qiáng)的回波性能，增強(qiáng)腫瘤組織的回聲，提高腫瘤組織顯影度。超聲刺激下的微泡可產(chǎn)生微射流、沖擊波、流體噴射波，崩裂時(shí)可產(chǎn)生高溫、高壓，超聲刺激微泡產(chǎn)生振蕩、膨脹、坍塌的各種機(jī)械力使血管破裂來增加大分子，基因和細(xì)胞的穿透力[1，2]。

1.1 提高腫瘤細(xì)胞膜的通透性 超聲微泡可提高腫瘤細(xì)胞膜的通透性，促進(jìn)微泡內(nèi)容物吸收。Jenne等[3]報(bào)道，超聲微泡可增加細(xì)胞膜通透性，且不損傷中性粒細(xì)胞的活性。Taniyama等[4]研究也發(fā)現(xiàn)，微泡破裂可明顯提高腫瘤細(xì)胞膜的通透性，甚至使細(xì)胞產(chǎn)生暫時(shí)、可逆性小孔。

多數(shù)腫瘤中，與臨床診斷相關(guān)的特征性分子標(biāo)記物都位于腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞上或者血管外基質(zhì)內(nèi)。微泡對(duì)腫瘤的靶向顯影大多集中在血管內(nèi)皮上血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR2)、整合素αvβ3、血管細(xì)胞黏附分子(VCAM-1)、P選擇素等靶點(diǎn)[5]。傳統(tǒng)的微米級(jí)微泡造影劑相對(duì)粒徑較大(2～10 mm)，難以穿過腫瘤新生血管(380～780 nm)，不能滲透到血管外組織，使其對(duì)腫瘤實(shí)質(zhì)和血管外基質(zhì)分子的血管靶向分子顯影受到限制。Anderson等[6]將能與αvβ3特異性結(jié)合的物質(zhì)連接到微泡上，對(duì)Met-1原位乳腺癌移植瘤進(jìn)行超聲顯像，發(fā)現(xiàn)靶向微泡組的對(duì)比信號(hào)較非靶向組提高了33倍。Willmann等[7]利用生物素-鏈親和素相互作用制成攜VEGFR2的單克隆抗體靶向微泡造影劑，體外實(shí)驗(yàn)顯示其與VEGFR2陽性細(xì)胞的結(jié)合率顯著高于非靶向微泡造影劑,且顯著高于VEGFR2陰性細(xì)胞的結(jié)合率。

隨著相變型氟碳納米粒子、納米級(jí)脂質(zhì)微泡等納米級(jí)微泡的成功研制，超聲微泡在分子顯像、藥物傳送、基因轉(zhuǎn)染及多學(xué)科交叉等領(lǐng)域得到快速發(fā)展，成為給腫瘤血管外顯影的一項(xiàng)新方法，。腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞連接不健全，血管內(nèi)皮間隙擴(kuò)大到380～780 nm，血管通透性增加，淋巴回流受阻，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的高通透性和滯留效應(yīng)。ER[8，9]、PR、HER2[10]是乳腺癌組織中特異性分子標(biāo)志物。有學(xué)者[11]用聚焦超聲(FUS)聯(lián)合微泡空化血腦屏障后，將HER2 陽性的腦轉(zhuǎn)移人乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-361)接種到裸鼠上，結(jié)果顯示治療期間，超聲聯(lián)合抗體組處理后的腫瘤平均體積顯著小于單獨(dú)使用超聲治療組和單獨(dú)使用抗體治療組。目前針對(duì)腫瘤實(shí)質(zhì)及血管外基質(zhì)的特征性標(biāo)志物方面的研究很多[12，13]，但是超聲微泡針對(duì)腫瘤實(shí)質(zhì)及血管外基質(zhì)的特征性標(biāo)志物的藥物治療方面的研究尚少，因此制備出攜帶有腫瘤實(shí)質(zhì)特征性標(biāo)志物的超聲微泡具有可觀臨床應(yīng)用前景。

1.2 對(duì)血管內(nèi)皮和鄰近腫瘤組織的機(jī)械損傷 超聲微泡在血管壁內(nèi)流動(dòng)時(shí)，由于超聲的空化效應(yīng)，可導(dǎo)致血管壁和鄰近腫瘤組織發(fā)生機(jī)械損傷，甚至使微血管破裂出血，血管通透性增加，增加內(nèi)皮間隙。促進(jìn)周圍細(xì)胞氧化應(yīng)激，啟動(dòng)局部炎癥反應(yīng)，同時(shí)促進(jìn)巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤。超聲微泡可使腫瘤組織微小血管破裂，阻斷腫瘤組織血管新生；促進(jìn)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α(SDF-1α)、血管細(xì)胞黏附附分子(ICAM-1)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá),有助于內(nèi)皮細(xì)胞和損傷組織修復(fù)。Wood等[14]用靜脈注射微泡聯(lián)合低頻率超聲作用于小鼠移植性黑色素瘤，發(fā)現(xiàn)超聲輻照后腫瘤血流灌注下降，無灌注區(qū)域面積較治療前增大82%。

2 超聲微泡靶向遞送的物質(zhì)在乳腺癌治療中的作用機(jī)制

2.1 超聲微泡靶向遞送化療藥物 腫瘤的化療效果取決于化療藥物在腫瘤局部的有效濃度及持續(xù)時(shí)間。采用化療藥物可延長乳腺癌患者的生存期，但不良反應(yīng)一直是限制其臨床應(yīng)用的主要問題。紫杉醇是一種脂溶性藥物，是常用的臨床乳腺癌化療藥物，但其導(dǎo)致的化療不良反應(yīng)較多。將紫杉醇包載于微泡中既降低了藥物毒副作用，同時(shí)提高腫瘤局部的藥物濃度。目前超聲微泡載紫杉醇、阿霉素用于治療乳腺癌的研究已經(jīng)非常廣泛，制備技術(shù)已經(jīng)十分成熟，但都處于動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)階段，尚有待于進(jìn)一步臨床研究進(jìn)一步應(yīng)進(jìn)行應(yīng)用于臨床研究是亟待解決的問題。Yan等[15]制備出載紫杉醇脂質(zhì)體微泡復(fù)合物，在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)該復(fù)合物較紫杉醇能更有效的抑制腫瘤生長。有學(xué)者[16]制備共載阿霉素(DOX)和維拉帕米(VER)雙修飾脂質(zhì)CL-R8-LP(DOX+VER)，考察其對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)將DOX和VER共同包載于共修飾脂質(zhì)體中可顯著提高對(duì)MCF-7細(xì)胞的殺傷力。P-糖蛋白(P-gp)在腫瘤細(xì)胞膜上過度表達(dá)是其耐藥性的主要機(jī)制之一[17]，最常用的解決方法是將P-gp抑制劑和化療藥物聯(lián)用，VER作為P-gp抑制劑，雙修飾脂質(zhì)體(CL-R8-LP)有良好的腫瘤靶向傳遞能力，將CL-R8-LP作為化療藥物和P-gp抑制劑的載體，化療藥物在P-gp抑制劑的協(xié)同作用下，可有效地蓄積于胞內(nèi)進(jìn)而抑制并殺死腫瘤細(xì)胞。超聲微泡攜帶藥物不僅降低了藥物的毒副作用，且提高藥物在腫瘤局部的濃度，增強(qiáng)了對(duì)腫瘤組織的殺傷作用。

2.2 超聲微泡靶向遞送基因 超聲微泡作為載體不但可以在體循環(huán)中減少藥物的副作用提高病變區(qū)域的藥物濃度，還可以保護(hù)藥物和基因片段不被核酸酶降解和內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)清除?；蛑委熥饔眉从没蚬こ碳夹g(shù)，將外源基因?qū)氚屑?xì)胞，以糾正靶細(xì)胞功能缺陷或者為其提供一個(gè)新功能。超聲靶向微泡破壞(UTMD)技術(shù)是一種靶向、高效的基因輸送方法，能有效促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)染和表達(dá)，是一種安全有效的基因傳輸方式?；蜉d體包括病毒載體和非病毒載體，病毒載體雖然轉(zhuǎn)染效率高，但存在免疫原性，潛在的致腫瘤性和低攜帶能力；而非病毒載體轉(zhuǎn)染效率低。如何制備轉(zhuǎn)染效率高的非病毒載體成為基因治療的新方向。超聲微泡屬于一種非病毒載體，具有制備簡單、轉(zhuǎn)染效率高、無免疫原性等優(yōu)勢(shì)[18]。目前超聲微泡作為基因的載體已經(jīng)廣泛應(yīng)用到腫瘤、干細(xì)胞移植、心血管疾病等的基礎(chǔ)研究中，具有廣闊的應(yīng)用前景。

基因轉(zhuǎn)染成功的關(guān)鍵是如何將外源基因成功的、高效的轉(zhuǎn)入靶組織，并調(diào)控基因的表達(dá)。基因轉(zhuǎn)染的理想條件是提高細(xì)胞膜的通透性而對(duì)周圍組織的傷害減少到最低，微泡的空化效應(yīng)很好的體現(xiàn)了這一優(yōu)點(diǎn)。有學(xué)者[19]將靶向超聲微泡與CD/TK雙自殺基因質(zhì)粒聯(lián)合前藥轉(zhuǎn)染到具有KDR啟動(dòng)子乳腺癌MCF-7細(xì)胞中，給予超聲輻照，結(jié)果顯示KDR啟動(dòng)子可以驅(qū)使CD/TK雙自殺基因在MCF-7細(xì)胞中靶向表達(dá)，KDRP-CD/TK基因在體外對(duì)MCF-7細(xì)胞具有靶向殺傷作用。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的成員，可促進(jìn)腫瘤分裂增殖，通過抑制survivin基因表達(dá)，干擾survivin的Thr34磷酸化可使處于有絲分裂中的癌細(xì)胞發(fā)生凋亡并增加化療藥物誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的作用。有學(xué)者[20]構(gòu)建沉默人survivin基因的siRNA真核表達(dá)載體，采用反相蒸發(fā)-機(jī)械振蕩法制備出siRNA真核表達(dá)載體的脂質(zhì)微泡，體外實(shí)驗(yàn)顯示，載基因靶向微泡可特異性結(jié)合到高表達(dá)HER-2的乳腺癌細(xì)胞上并誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。微泡作為基因的載體的安全性、有效性及穩(wěn)定性已在國內(nèi)外許多學(xué)者的實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)，但是其應(yīng)用于臨床仍有諸多挑戰(zhàn)。

2.3 超聲微泡靶向遞送單克隆載體 免疫治療即調(diào)動(dòng)機(jī)體的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)抗腫瘤能力，從而抑制和殺傷腫瘤細(xì)胞。將單克隆抗體通過化學(xué)連接法與微泡連接，制備出靶向超聲微泡，并對(duì)微泡表面進(jìn)行修飾，實(shí)現(xiàn)微泡攜帶抗體主動(dòng)尋靶，在一定強(qiáng)度的超聲輻照下靶向擊破微泡，釋放出抗體從而作用于機(jī)體的免疫系統(tǒng)，使免疫系統(tǒng)活化而達(dá)到增強(qiáng)免疫和抗腫瘤的效果。

腫瘤的免疫治療有多年的歷史，但一直未成為主要的治療手段。近幾年，針對(duì)免疫檢點(diǎn)的單抗治療不斷在癌癥治療中取得突破性進(jìn)展，尤其是在黑色素瘤、腎癌、肺癌和膀胱癌等多種腫瘤治療中顯示出很好的療效。PD-1作為重要的共刺激抑制分子，在免疫系統(tǒng)中扮演著類似“剎車”的角色[21]，主要在激活的T細(xì)胞和B細(xì)胞中表達(dá)，其配體包括PD-L1和PD-L2，PD-L1主要在免疫細(xì)胞(如腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞)和上皮細(xì)胞(如腫瘤細(xì)胞)上誘導(dǎo)表達(dá)，而PD-L2主要在抗原提呈細(xì)胞上表達(dá)。機(jī)體的腫瘤微環(huán)境會(huì)誘導(dǎo)浸潤的T細(xì)胞高表達(dá)PD-1分子，腫瘤細(xì)胞高表達(dá)PD-L1，導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境中PD-1通路持續(xù)激活，PD-1和PD-L1連接后，T細(xì)胞的功能被抑制，因此PD-1/PD-L1抑制T細(xì)胞活化在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮重要的作用[22，23]。MPDL3280A(RG7446)是抗PD-L1的單克隆抗體，適用于PD-L1陽性患者。有學(xué)者[24]在2015 美國癌癥協(xié)會(huì)(AACR)的年會(huì)上指出，MPDL3280A在晚期三陰性乳腺癌中表現(xiàn)出了持久的療效。PD-1/PD-L1免疫療法，是當(dāng)前抗腫瘤治療的熱點(diǎn)，但尚未有將抗PD-L1的單克隆抗體與微泡連接用于治療乳腺癌的研究報(bào)道。

綜上所述，超聲微泡可提高腫瘤細(xì)胞膜的通透性、對(duì)血管內(nèi)皮和鄰近腫瘤組織造成機(jī)械損傷，增加內(nèi)皮間隙。超聲微泡可靶向遞送紫杉醇等化療藥物，降低藥物毒副作用，提高腫瘤局部的藥物濃度，增強(qiáng)化療藥對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力。超聲微泡可將外源基因?qū)肴橄侔┘?xì)胞，以糾正靶細(xì)胞的功能缺陷，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。超聲微泡可通過靶向遞送單克隆載體進(jìn)行免疫治療，活化免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)機(jī)體免疫能力，抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。目前關(guān)于攜帶有腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞靶點(diǎn)的載藥載基因的微泡鮮有報(bào)道。因此，進(jìn)一步研究應(yīng)發(fā)現(xiàn)安全、高效的針對(duì)腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞靶點(diǎn)，提高超聲微泡靶向治療的精準(zhǔn)性。

[1] Ho YJ, Chang YC, Yeh CK. Improving Nanoparticle Penetration in Tumors by Vascular Disruption with Acoustic Droplet Vaporization.[J]. Theranostics, 2016,6(3):392-403.

[2] Park D, Park H, Seo J, et al. Sonophoresis in transdermal drug deliverys[J]. Ultrasonics, 2014,54(1):56-65.

[3] Jenne J, Konstantin M. Ultrasound exposure can increase the membrane permeability of human neutrophil granulocytes containing microbubbles without causing complete cell destruction[J]. Ultra Med Bio, 2006,32(2):297-303.

[4] Taniyama Y, Tachibana K, Hiraoka K, et al. Local delivery of plasmid DNA into rat carotid artery using ultrasound.[J]. Circulation, 2002,105(10):1233-1239.

[5] Fan CH, Ting CY, Liu HL, et al. Antiangiogenic-targeting drug-loaded microbubbles combined with focused ultrasound for gliomatreatment[J]. Biomaterials, 2013,34(8):2142-2155.

[6] Anderson CR, Hu X, Zhang H, et al. Ultrasound molecular imaging of tumor angiogenesis with an integrin targeted microbubble contrast agent[J]. Invest Radio1，2011,46(4):215-224.

[7] Willmann JK, Paulmurugan R, Chen K, et al. US imaging of tumor angiogenesis with microbubbles targeted to vascular endothelial growth factor receptor type 2 in mice[J]. Radiology, 2008,246(2):508-518.

[8] Cuzick J, Dowsett M, Pineda S, et al. Prognostic value of a combined estrogen receptor, progesterone receptor, Ki-67, and human epidermal growth factor receptor 2 immunohistochemical score and comparison with the genomic Health recurrence score in early breast cancer[J]. Clini Oncol, 2011,29(32):4273-4278.

[9] Murphy LC, Leygue E. The role of estrogen receptor-β in breast cancer[J]. Sem Rep Med, 2012,30(1):5-13.

[10] Metzger-Filho O, Procter M, De AE, et al. Magnitude of trastuzumab benefit in patients with HER2-positive, invasive lobular breast carcinoma: results from the HERA trial[J].Clini Oncol， 2013,31(16):1954-1960.

[11] Kobus T, Zervantonakis IK, Zhang Y, et al. Growth inhibition in a brain metastasis model by antibody delivery using focused ultrasound-mediated blood-brain barrier disruption[J]. Control Rel, 2016,28(9):281-288.

[12] Filardo EJ, Quinn JA, Bland KI, et al. Estrogen-induced activation of Erk-1 and Erk-2 requires the G protein-coupled receptor homolog, GPR30, and occurs via trans-activation of the epidermal growth factor receptor through release of HB-EGF[J]. Mole Endo, 2000,14(10):1649-1660.

[13] 郭業(yè)兵,張廷國. 宮頸微小浸潤癌上皮及間質(zhì)細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-2、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白的表達(dá)及意義[J]. 山東醫(yī)藥,2017,57(1):76-78.

[14] Wood AK, Ansaloni S, Ziemer LS, et al. The antivascular action of physiotherapy ultrasound on murine tumors[J]. Ultra Med Bio, 2005, 31(10):1403-1410.

[15] Yan F, Li L, Deng Z, et al. Paclitaxel-liposome-microbubble complexes as ultrasound-triggered therapeutic drug delivery carriers[J]. Control Rele Off , 2013,166(3):246-55.

[16] 母發(fā)旭,唐潔,何勤，等. 共載阿霉素和維拉帕米雙修飾脂質(zhì)體的制備及其對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞增殖的抑制作用[J]. 華西藥學(xué)雜志,2015(4):396-399.

[17] Dean M, Allikmets R. Complete Characterization of the Human ABC Gene Family[J]. Bio Bio, 2001,33(6):475-479.

[18] Borden M, Sirsi S, Hernandez S, et al. Polyplex-microbubbles for improved ultrasound-mediated gene therapy[J]. Acoustical , 2013, 133(5):3409.

[19] Li XH, Zhou P, Wang LH, et al. The targeted gene (KDRP-CD/TK) therapy of breast cancer mediated by SonoVue and ultrasound irradiation in vitro[J]. Ultrasonics, 2011,52(1):186-191

[20] Chen Z, Liang K, Sheng X, et al. Optimization and apoptosis induction by RNAi with UTMD technology in vitro[J]. Oncology Letters, 2012,3(5):1030-1036.

[21] Pardoll DM. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy[J]. Nature Reviews Cancer, 2012,12(4):252-264.

[22] Hawkes EA, Grigg A, Chong G. Programmed cell death-1 inhibition in lymphoma[J]. Lancet Oncology, 2015,16(5):234-245

[23] Miller JF, Sadelain M. The journey from discoveries in fundamentalimmunology to cancer immunotherapy[J]. Cancer Cell, 2015,27(4):439-449.

[24] Cimino-Mathews A, Foote JB, Emens LA. Immune targeting inbreast cancer[J]. Oncology, 2015,29(5):375-385.

湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金資助項(xiàng)目(2016KZL09)。

趙云(E-mail: zhaoyun@ctgu.edu.cn)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.19.033

R737.9

A

1002-266X(2017)19-0105-04

2016-12-16)