尤穎哲

(漳州市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，福建 漳州 363000)

雙斑東方鲀精子冷凍保存方法探究

尤穎哲

(漳州市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，福建 漳州 363000)

雙斑東方鲀(Takifugubimaculatus)在福建已形成較大規(guī)模的養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)，但其精卵成熟同步率低、自然交配受精率低等繁殖特點已成為養(yǎng)殖規(guī)?；l(fā)展的最大制約因素。而精子超低溫冷凍保存技術(shù)作為直接保存細胞遺傳物質(zhì)的一種有效方法，為雙斑東方鲀規(guī)?；斯し庇龁栴}的解決提供了方案。研究以復(fù)蘇后的精子活力為選擇指標，開展雙斑東方鲀精子冷凍保存方法的研究，對抗凍劑、基礎(chǔ)液、精子稀釋濃度和降溫程序等幾個關(guān)鍵影響因素進行了篩選，獲得了雙斑東方鲀精子的最適冷凍方法：以含5%二甲亞砜(DMSO)的MPRS溶液與精子按1∶1比例稀釋，樣品在4 ℃冰箱中平衡30 min，液氮上方 10 cm 處熏蒸 5 min，再下降到5 cm處熏蒸5 min，之后投入液氮。按此方法保存的雙斑東方鲀精子在解凍激活后，其活力可達(83 ± 3)%，與相應(yīng)卵子受精，可得到平均70%的孵化率，可以滿足雙斑東方鲀規(guī)模化人工繁育的需求。研究結(jié)果也可為其他東方鲀魚類的相關(guān)研究提供參考。

雙斑東方鲀；精子；冷凍保存；繁育

水產(chǎn)經(jīng)濟物種的良種選育和種質(zhì)保護對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展至關(guān)重要。利用低溫生物學(xué)技術(shù)可為重要養(yǎng)殖魚類的種質(zhì)保護、良種選育及提供充足的育種研究材料提供巨大的幫助[1]。其中，魚類精子由于體積小、抗凍劑容易通過、冷凍保存較易成功，已成為解決魚類種質(zhì)資源及遺傳多樣性保護的有效方法之一。1953年，英國科學(xué)家首次用干冰冷凍保存了大西洋鯡精子，解凍后獲得了80 %的受精率[2]。此后，國內(nèi)外開展了多種魚類的精子冷凍保存研究工作，如石斑魚[3-6]、石首魚[7-9]、鲆鰈魚類[10-12]等，并已取得很大進展。

雙斑東方鲀(Takifugubimaculatus)屬鲀形目、東方鲀科、東方鲀屬，為近海暖溫性底層魚類，僅分布于中國南海、東海和黃海南部[13]。雙斑東方鲀?nèi)怩r嫩可口、營養(yǎng)價值高，具有極高的食用和醫(yī)用價值[14]。雙斑東方鲀養(yǎng)殖在福建已形成較大規(guī)模的產(chǎn)業(yè)，是福建省東方鲀養(yǎng)殖中僅有的兩個品種之一，年養(yǎng)殖總產(chǎn)量約5 000 t，其魚肉還被加工成烤魚片，產(chǎn)量占全國總產(chǎn)量的90%以上[15]。雖然雙斑東方鲀市場需求巨大、前景廣闊，但其規(guī)?；庇嬖谥菩鄢墒觳煌?、自然交配受精率低等條件限制。目前，人工授精已成為雙斑東方鲀?nèi)斯し庇闹饕侄?，而利用低溫冷凍技術(shù)可以保證在人工授精時獲得充足的魚類精子供應(yīng)，使規(guī)?；庇靡皂樌麑崿F(xiàn)，進而保障其產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展。此外，對雙斑東方鲀開展精子冷凍保存技術(shù)研究，還可以為已日漸衰竭的野生資源量的保護和復(fù)壯提供必要的幫助。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

雙斑東方鲀親魚為野生2齡魚，購自浙江省臺州市三門縣，體質(zhì)量350～400 g，暫養(yǎng)于福建省漳浦縣前亭興海水產(chǎn)養(yǎng)殖場。2016年4月，采用輕擠壓魚體腹部的方法從性成熟的雄性親魚采精，無污染的精液暫存于 4 ℃冰箱。在顯微鏡下用細胞計數(shù)板統(tǒng)計被鹽度28 滅菌海水激活的精子占總精子的比例，該比例即代表精子的活力，選用活力90 %以上的精液用于實驗。實驗所用鮮精的活力平均為 93 %，精子壽命平均為 40.5 s。

1.2 抗凍劑的篩選

選用甘油和二甲亞砜(DMSO)這兩種常見滲透性抗凍劑來檢測其對雙斑東方鲀精子的保護效果，并選用最常見的魚類凍精稀釋液Hank’s液作為抗凍劑篩選過程的基礎(chǔ)稀釋液[16]。按表 1配制3種常見的精子冷凍保護稀釋液Hank’s[16]、MPRS[17]和Cortland[18]。

表1 3種精子稀釋液基礎(chǔ)溶液的組成成分

按表1配制基礎(chǔ)溶液 Hank’s液，分別以4個濃度梯度(5 %、10 %、15 %和20 %)添加甘油或DMSO至稀釋液，配成8種精子冷凍保存液，并置于1.5 mL凍存管中。將精液與配制好的保存液以 1∶1 的比例混合，精子凍存混勻液的總體積為100 μL，每組實驗設(shè)3個平行樣。將裝有精子凍存混勻液的凍存管以4°C 冰箱平衡 30 min，液氮上方10 cm處熏蒸10 min，再投入液氮進行降溫(表2，Y3)。復(fù)溫時直接放入 38 ℃水浴中快速解凍至完全融化，取少許用鹽度為 28 的滅菌海水激活，記錄凍精激活后的活力。

表2 降溫程序列表

1.3 精子稀釋比例的篩選

以含 5% DMSO的 Hank’s 液為精子冷凍保存液，將雙斑東方鲀精子分別以 1∶1、1∶2、1∶5、1∶7、1∶10 的比例稀釋，總體積保持100 μL，每組實驗設(shè)3個平行樣。凍存管的降溫、復(fù)溫步驟同1.2節(jié)。

1.4 基礎(chǔ)溶液的篩選

按表1配制的Hank’s、MPRS和Cortland液中，分別加入DMSO至終濃度5%。精子與冷凍保存液稀釋比例為1∶1，總體積100 μL，每組實驗設(shè)3個平行樣。凍存管的樣品降溫、復(fù)溫同1.2節(jié)。

1.5 降溫程序的篩選

以1.2、1.3和1.4的實驗結(jié)果為基礎(chǔ)，以終濃度5 % DMSO的MPRS作為精子冷凍保護稀釋液，精子與冷凍保存液稀釋比例為1∶1，評估不同降溫步驟對雙斑東方鲀精子冷凍保存活力的影響。每組實驗設(shè)3個平行樣，按4℃冰箱平衡、液氮上方熏蒸、直接投入液氮這3個步驟的不同，分為4種程序(表2)分別進行降溫。凍存管的樣品復(fù)溫同1.2節(jié)。

1.6 凍精受精實驗

選擇1.5節(jié)實驗中Y4冷凍保存程序下的雙斑東方鲀精子(最高精子活力)。取3管冷凍5 h的精子復(fù)溫，同時取 300 μL 鮮精作為對照。量取6份各4 mL新鮮卵子，分別與6份精子混合，加入海水激活 10 min后洗卵兩遍，23 ℃海水中孵化受精卵，孵化 7 d后統(tǒng)計孵化率。

1.7 數(shù)據(jù)處理方法

使用統(tǒng)計軟件SPSS17.0和EXCEL進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，利用方差分析(One-wayANOVA)來檢驗精子冷凍前后活性差異的顯著性，并利用EXCEL軟件對分析所得數(shù)據(jù)做柱狀圖和對比表格。

2 結(jié)果

2.1 抗凍劑的篩選結(jié)果

實驗分別以不同濃度的DMSO 和甘油這兩種溶劑作為抗凍劑進行超低溫保存雙斑東方鲀精子，通過解凍并檢測精子活力來確定抗凍劑的保護效果，其結(jié)果見表 3。從表3可看出，甘油對雙斑東方鲀的精子基本無抗凍保護作用。而隨著 DMSO 濃度由5%增加到 20%，精子活力和壽命都顯著降低(P<0.05)。以5%DMSO作為抗凍劑，其解凍精子的活力平均69 %，顯著低于鮮精(93 %)的活力(P<0.05)，而激活后精子的壽命則無顯著差異(P>0.05)。

表3 不同濃度的兩種抗凍劑對精子超低溫保存的效果

2.2 精子稀釋比例的篩選結(jié)果

在冷凍保存過程中，精子濃稠度對于平衡精子細胞的內(nèi)外滲透壓有重要的影響，因此，稀釋比例是影響精子活力的重要因素。精子冷凍前經(jīng)以下倍數(shù)稀釋，復(fù)溫后活力結(jié)果如圖1所示。由激活結(jié)果可看出，隨著稀釋比例由 1∶1擴大到1∶10，精子活力呈下降趨勢，按1∶1比例稀釋的精子活力最高(70%)。因此，雙斑東方鲀精子超低溫保存時，按 1∶1比例稀釋可取得最好效果。

圖1 不同稀釋比例對精子活力的影響

2.3 基礎(chǔ)液的篩選結(jié)果

由于不同魚類精子對環(huán)境適應(yīng)能力及代謝水平上的差異，對提供保護的稀釋液成分要求也會有所不同。因此，本實驗選用3種常見的基礎(chǔ)稀釋液來檢測其對雙斑東方鲀精子冷凍保存的效果。在抗凍劑均為5%DMSO的條件下，MPRS液、Hank's液和Cortland液對凍精解凍后活力的影響分別是(77±3)%、(62±1)%和(75±3)%，對精子壽命的影響分別是(43.7±2.1)s、(40.1±0.9)s和(24.5±0.2)s。Hank's的活力最低(P<0.05)，而 Cortland 液作為基礎(chǔ)液保存的精子壽命最短(P<0.05)。綜合活力和精子壽命這兩個指標，MPRS 液是最適合雙斑東方鲀精子超低溫保存的基礎(chǔ)稀釋液。

2.4 降溫程序的篩選結(jié)果

不同的生物樣品對降溫速率同樣有不同的要求[1]。本次實驗比較了4種不同降溫程序下的精子活力，復(fù)溫激活后的活力顯示，在基礎(chǔ)液和抗凍劑濃度分別為MPRS、5%DMSO 時，Y1、Y2、Y3、Y4降溫程序?qū)﹄p斑東方鲀精子冷凍后的活力的影響分別為(3±1)%、(16±1)%、(71±4)%、(83±3)%。

4種降溫程序中，Y1直接投入液氮，而其余3種降溫程序都在4℃冰箱平衡30 min。結(jié)果證明，經(jīng)過 Y1 降溫程序冷凍的精子活力極低，Y4 精子活力最高，而Y3 的活力也極顯著高于Y2(P<0.01)，這說明雙斑東方鲀精子的超低溫冷凍需要經(jīng)過一定的降溫平衡，而且循序漸進的降溫模式最適合用于雙斑東方鲀精子的超低溫冷凍保存。

2.5 凍精受精實驗

為了確定冷凍精子復(fù)蘇后的受精能力，使用之前結(jié)果獲得的最佳保存方案(5 % DMSO的MPRS，稀釋比例1∶1，Y4降溫程序)下的冷凍精子低溫保存5 h后復(fù)溫，取等量凍精和鮮精，分別與等量卵子受精。孵化 7 d后，計算孵化率，結(jié)果顯示，組別鮮精1、鮮精2和鮮精3的孵化率分別是83.5%、71.2%和85.4%，凍精1、凍精2和凍精3的孵化率分別是68.8%、65.7%和75.8%。雖然凍精孵化率平均約70 %，略低于鮮精孵化率(80%)，但已足以滿足雙斑東方鲀的規(guī)?；斯し庇?，也高于七帶石斑魚[19]、史氏鱘[20]等魚類凍精復(fù)蘇后的孵化率。

3 討論

3.1 基礎(chǔ)液和抗凍劑對精子超低溫冷凍保存的影響

基礎(chǔ)液能提供精子所需的合適滲透壓環(huán)境，在有關(guān)魚類精子冷凍保存的研究中，基礎(chǔ)液大部分是無機鹽溶液，能為精子提供一個合適的生存環(huán)境，防止精子在體外被激活，延長其在魚體外的存活時間。Hank’s、MPRS和Cortland溶液是常用的動物精子冷凍保存基礎(chǔ)液。本研究結(jié)果表明，MPRS是最適合雙斑東方鲀精子冷凍保存的基礎(chǔ)稀釋液。抗凍劑在精子的冷凍過程中能保護精子細胞免受冰晶損傷，并有調(diào)節(jié)細胞滲透壓的作用，是影響精子冷凍保存的重要因素[1]。DMSO和甘油在魚類的精液冷凍保存中均有廣泛應(yīng)用。DMSO在棕點石斑魚[5]、大黃魚[8]、大菱鲆[12]等被證明是適合的抗凍劑，而甘油在淡水魚類的精液冷凍保存中也取得了理想的效果[21]。在本實驗中，甘油無論在何種濃度下，均未能起到絲毫的保護作用，可見甘油并不適合作為雙斑東方鲀精子的抗凍劑，而DMSO 則顯示出了較好的適用性，其中5%的終濃度可以獲得最佳的精子復(fù)蘇活力，而隨著DMSO濃度的增加，精子復(fù)蘇活力顯著下降。

3.2 降溫程序與精子活力的關(guān)系

降溫程序?qū)Τ蜏乩鋬鼍拥拇婊盥屎突盍τ兄卮笥绊慬22]。最佳的降溫方法是將待冷凍的樣品通過程序降溫儀有步驟地降溫。由于程序降溫儀操作繁瑣、設(shè)備昂貴，而魚類精子因體積小，抗凍劑可以迅速進入細胞內(nèi)，因而在實際操作中無需對降溫程序要求過于精確，通常會采用簡便的方法，即通過將樣品放在液氮面上一定高度熏蒸的方式進行降溫。本研究發(fā)現(xiàn)雙斑東方鲀精子的超低溫冷凍需要經(jīng)過多次降溫平衡。在4 ℃冰箱中的降溫平衡步驟之后，在液氮上方不同高度進一步降溫平衡，可極有效地提高冷凍精子的存活率。

3.3 稀釋比例與精子活力的關(guān)系

在魚類精子冷凍保存實驗中，精液與冷凍稀釋液一般以 1∶1～1∶20 的體積比稀釋，都能取得很好的冷凍效果。在大菱鲆[12]精子冷凍保存中，稀釋比例從1∶1至1∶9時，精子活力沒有顯著變化。而在大西洋石首魚[8]的實驗中，稀釋比例大于1∶20后，精子存活率顯著降低。本實驗中，1∶1的稀釋比例可以獲得最高的精子活力，而在稀釋比高于1∶5之后，精子的活力則顯著降低。這可能是由于比例的增大，稀釋精液與稀釋液混合后的溶液中DMSO的相對濃度提高，導(dǎo)致精子活力的下降。

4 結(jié)論

經(jīng)過對稀釋液、抗凍劑等多個影響因素的比較分析，獲得了雙斑東方鲀精子冷凍保存的最佳方法：以含5 % DMSO的 MPRS 溶液與精子按 1∶1 比例稀釋，4°C 冰箱中平衡30 min，液氮上方 10 cm處熏蒸 5 min，下降到5 cm處再熏蒸5 min，之后投入液氮。此方法可獲得高達83 %的凍融精子活力，基本接近鮮精的活力水平。此方法的建立，不僅可以為雙斑東方鲀規(guī)?；斯し庇峁┏渥愕目杉せ罹樱ＷC雙斑東方鲀產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展，而且可以為其他東方鲀魚類的相關(guān)研究提供參考，同時也進一步豐富了我國魚類精子庫種類，為雙斑東方鲀種質(zhì)資源的保護提供技術(shù)支持。

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·文摘·

標志的外科式植入對虹鱒的短期影響

外科式植入標志提供了生物遙感數(shù)據(jù)和生物跟蹤記錄數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)可用于調(diào)查魚類在自然環(huán)境中的行為和生理機能。然而，為了確保數(shù)據(jù)的有效性，了解植入標志對魚類行為和生理機能的影響是至關(guān)重要的。因此已有許多研究對標志的外科式植入產(chǎn)生的影響做了調(diào)研。這些研究表明，標志重量應(yīng)該小于魚體體重的2%(所謂的“2%規(guī)則”)。但種類相同但大小不同、或者所處發(fā)育階段不同(如稚魚或成魚)的魚是否適用于2%規(guī)則，相關(guān)信息幾乎沒有。本研究調(diào)研了虹鱒體內(nèi)的植入標志和魚體體重之比率(在此稱為標志個體比)是否影響其攝食行為、存活率、血漿乳酸鹽水平和生長率等問題。發(fā)現(xiàn)超過3%的標志個體比在植入標志后的第1天和第8天均嚴重損害其攝食行為；存活率與標志個體比呈負相關(guān)；魚體體重對存活率沒有影響。分析顯示，5.6%的標志個體比在第8天的存活率預(yù)計為90%。在第8天，標志個體比或外科式植入不影響虹鱒的血漿乳酸鹽水平和生長率。從分析中得出結(jié)論，2%規(guī)則可能是保守的，可能在稚魚階段及成魚虹鱒可接受。

(《Fisheries Research》Vol.185)

Research on cryopreservation ofTakifugubimaculatusspermatozoa

YOU Yingzhe

(FisheriesTechnologyPromotionStationofZhangzhou,Zhangzhou363000,China)

Takifugu bimaculatus aquaculture industry has been largely developed in Fujian Province,however,its benign development was restricted by some of its reproductive characters like the unsynchronization of maturity of sperm and egg,and low fertility rate under nature mating conditions.Sperm cryopreservation method provides an effective solution for this restriction because it can preserve germplasm directly.In this study,the optimal parameters for sperm cryopreservation of T.bimaculatus were tested.The most suitable treatment for T.bimaculatus sperm is to dilute the sperm by MPRS solution with 5 % DMSO at a ratio of 1∶1,freeze at 4 ℃ for 30 min,fumigate at 10 cm above the surface of liquid nitrogen for 5 min and then at 5 cm above the surface of liquid nitrogen for 5 min,and finally preserve in liquid nitrogen.By this procedure,the motility of frozen-thawed sperm could reach (83±3) % and the hatching rate after artificial insemination was about 70 %,which can meet the requirement of lager scale breeding of T.bimaculatus.And our result could also be a good reference for relative researches in other fugu fishes.

Takifugubimaculatus;spermatozoa;cryopreservation;breed

10.3969/j.issn.1007-9580.2017.01.007

2016-10-30

2017-01-17

廈門南方海洋中心項目雙斑東方鲀和菊黃東方鲀的三倍體規(guī)模化育苗技術(shù)開發(fā)(14GZY025NF25)

尤穎哲(1973—)，男，高級工程師，研究方向：海水水生動物繁育。E-mail:yyz197352@sina.com

S962.1

A

1007-9580(2017)01-035-05